Etude de la topologie du domaine PAS

Lors de la mise au point du protocole de cysteine scanning, il a été mis en évidence que la cystéine native du PAS, Cys607, permettait la formation de 11% de dimère à l’état basal chez

E. coli, et que suite à la perception de modulateur, une diminution drastique de formation de

pont disulfure était observée. En se basant sur le modèle structural du domaine PAS de BvgS construit in silico (Dupré et al., 2013), nous avons ciblé certains résidus des brins β pour des analyses par cysteine scanning (Fig. 91). En effet, il est proposé dans la littérature que la transduction d’information au sein des domaines PAS se fait grâce à un réarrangement du feuillet β.

βA βB αC αD αE αF 592 600 610 620 630 640

PNPIYVRDKEGRMLLCNDAYLDTFGVTADAVLGKTIPEANVVGDPALAREMHEFLLTR ** ** *

βG βH βI

650 660 670 680 690 698

VAAEREPRFEDRDVTLHGRTRHVYQWTIPYGDSLGELKGIIGGWIDIT

** ** ** ** *

Figure 91 : Séquence protéique du domaine PAS de BvgS. Les brins β sont colorés en rouge et les hélices α en bleu. La cystéine native 607 est soulignée et a été remplacée, dans nos analyses de cysteine scanning, par une alanine. Les résidus substitués indépendamment en cystéine sont indiqués par les croix et mis en gras.

Les résultats obtenus lors de cette étude sont présentés dans la figure 92. De manière étonnante, tous les résidus ciblés permettent l’obtention de pont disulfure dans de relativement faibles proportions de l’ordre de 10% (Fig. 92A). Une cystéine dans le brin βH, correspondant au variant BvgSflH671C, permet l’obtention d’une proportion de dimère nettement plus élevée (32%), suggérant que cette région participe à l’interface entre les domaines PAS. Le fait que de nombreux résidus permettent la formation de pont disulfure à un faible niveau, suggère une forte dynamique des domaines PAS qui pourraient être sujets à des mouvements de ‘respiration’. L’ajout de modulateur diminue la formation de pont disulfure pour tous les mutants construits (Fig. 92A). Ainsi, ces données suggèrent l’idée d’un réarrangement du domaine PAS suite à la perception de modulateur par les domaines VFT. On aurait pu penser

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que la formation de pont disulfure pour toutes les positions testées était un artéfact expérimental, mais la diminution systématique de pont disulfure en réponse au modulateur va à l’encontre de cette idée. Notons tout de même que les résultats présentés dans la figure 92A correspondent à une expérience préliminaire qu’il faudra dupliquer, pour confirmer les valeurs obtenues et ainsi s’assurer de sa reproductibilité.

Une grande partie des mutants réalisés lors de cette étude présente une activité affectée chez

B. pertussis (Fig. 92B et C). En effet, BvgS est inactif dans quatre cas (BvgSflY596C, V672C, I677C et I689C) et pour la majorité des autres mutants son activité kinase est nettement diminuée. Certains mutants présentent un défaut de production et/ou de stabilité (BvgSflL605C, T676C, I677C et I689C), ce qui expliquerait la perte d’activité (Fig. 92D). Le domaine PAS s’avère donc très sensible à ces substitutions. Quatre mutants sont insensibles aux modulateurs, BvgSfl L606C, T676C, I595C et H671C, dont le dernier qui donnait une certaine proportion de ponts disulfure. On remarque de nouveau ici que l’ajout de chloronicotinate chez E. coli réduit la formation de pont disulfure, indiquant un réarrangement relatif des domaines PAS alors que l’activité kinase se maintient chez B. pertussis, suggérant que les réarrangements observés sont inefficaces. Chez B. pertussis, très peu de pont disulfure se forme spontanément, quelle que soit la position de la cystéine. Ceci indique que la perte d’activité ou de réponse à la modulation de la plupart des mutants n’est pas imputable à la formation de pont disulfure (Fig. 92D).

Ainsi, la substitution de ces différents résidus du noyau du domaine PAS a un effet assez drastique sur l’activité de BvgS, ce qui souligne l’importance des feuillets β du domaine PAS pour le fonctionnement de BvgS. Il se pourrait également que certains des résidus ciblés soient impliqués dans la fixation d’un co-facteur ou ligand agoniste (voir chapitre IX), et que leur substitution déstabilise le domaine PAS. Il a été montré précédemment que ce domaine doit être bien conformé pour l’activité de BvgS et pour le passage en mode phosphatase (Dupré et al., 2013). Tout ceci rend l’analyse de cette région extrêmement délicate.

A ce stade, les résultats obtenus ne nous permettent pas d’établir de modèles fiables des changements de cette région de BvgS entre les états kinase et phosphatase. De nouvelles positions seront ciblées afin de déterminer si des points de contact forts existent entre les feuillets β.

Figure 92 : Etude de la topologie et dynamique du domaine PAS de BvgS. A. Représentation sous forme d’histogramme des ratios de formation de dimère obtenus lors des analyses de cysteine scanning pour les différents variants de BvgSt_{. Ces analyses ont été réalisées en conditions basales (0) ou après l’ajout de 5 mM de chloronicotinate}

(CN 5). B et C. Activités β-galactosidase réalisées sur des lysats bactériens, représentant l’activité du promoteur ptx (B) ou fhaB (C) en conditions basales (0) ou après l’ajout de chloronicotinate à 4 mM (CN 4) au milieu de culture. Notons que tous les variants cystéine présentent également les substitutions C607A (sauf celui noté C607, où la Cys607

a été conservée) et C881S. Lorsque les valeurs présentées proviennent de plusieurs expériences indépendantes, la

moyenne et l’écart type de la moyenne sont représentés, sinon il s’agit d’une expérience représentative. D. Détermination chez B. pertussis de la quantité de BvgS sous forme monomérique (m) ou dimérique (d) dans des conditions basales, sans ajout d’oxydant. Le ratio de formation de dimère est indiqué en haut de chaque ligne. Notons que tous les variants cystéine présentent les mutations C607A et C881S. Le contrôle de charge est indiqué par un

astérisque. 2 mM de chloronicotinate ont été ajoutés à la culture du variants BvgSfl

159 A

B

C

160

J’ai cependant obtenu un résultat inattendu et très intéressant. Le mutant BvgSflI690C présente une très faible activité kinase à l’état basal (Fig. 92C), et l’ajout de modulateur au milieu de culture, accroit cette activité de façon marquée (Fig. 92B). Ainsi, ce variant semble présenter une régulation inversée, puisqu’il nécessite la perception de modulateur pour sa pleine activité kinase. L’utilisation d’une gamme de concentrations croissante de modulateur a montré que de faibles concentrations sont suffisantes pour la réactivation du mutant (Fig. 93). En revanche, le sulfate de magnésium ne permet pas d’augmenter l’activité de BvgS, même à de fortes concentrations, laissant à penser que pour ce mutant la transmission de l’information est découplée suivant les modulateurs utilisés.

A B

Figure 93 : A. Activités β-galactosidase réalisées sur des lysats bactériens de la souche BvgSfl

I690C présentant une

régulation inversée, représentant l’activité du promoteur ptx en conditions basales (0) ou après l’ajout de concentrations croissantes de nicotinate, MgSO4 ou de chloronicotinate (respectivement Nico, Mg, et CN) au milieu de

culture. Il s’agit de résultats provenant d’une expérience représentative. B. Représentation de la position putative du résidu I690 sur le modèle in silico du domaine PAS de BvgS (Dupré et al., 2013). Le résidu est coloré en bleu foncé, les

hélices α en cyan, les brins β en rouge et les boucles en mauve.

A l’heure actuelle, il est difficile d’expliquer le fonctionnement de ce mutant particulier, mais des hypothèses peuvent être proposées. La mutation I690C n’est pas impliquée dans la formation d’un pont disulfure de manière spontanée chez B. pertussis, avec ou sans modulateur (Fig. 92D). Ceci exclut donc un rôle du pont disulfure pour la régulation inversée. Sur base du modèle in silico du domaine PAS précédemment construit, nous pouvons observer que le résidu ciblé pourrait être en contact avec le coiled coil en amont du domaine PAS (Fig. 93B). Il semblerait qu’à l’état basal, le remplacement de l’isoleucine par une cystéine pose un problème pour la transmission de la dynamique imposée par les VFT vers la kinase. Si cette isoleucine est impliquée dans des contacts avec l’hélice en amont ou avec le noyau du PAS son remplacement par une cystéine perturberait ces interactions, permettant indirectement au linker en aval d’adopter son interface stable. Suite à l’ajout de modulateur, un réarrangement des domaines PAS aurait lieu en réponse à l’écartement des hélices en amont. La mutation I690C permettrait alors l’induction d’une dynamique du coiled coil en aval du domaine PAS, favorisant le passage de BvgS en mode kinase.

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De nombreuses mutations spontanées dans le domaine PAS ont été rapportées pour induire une insensibilité de BvgS aux modulateurs et ainsi contrer l’effet de mutations des domaines VFT qui inactivent le système (Miller et al., 1992; Goyard et al., 1994; Manetti et al., 1994). Ces substitutions sont confinées au niveau des hélices αE et αF et de la boucle joignant les brins βH et βI (autrement appelée boucle HI) (Fig. 94). Les hélices αE et αF sont critiques pour la signalisation dans d’autres domaines PAS (cf partie IV le domaine PAS). La boucle HI quant à elle serait en interaction avec l’hélice en amont du domaine PAS. Ainsi, des substitutions au niveau de ces régions découpleraient le domaine PAS de son hélice en amont (mutations dans HI) ou induiraient une déstabilisation du domaine PAS (mutations dans HI, αE et αF) mais également entraveraient la transmission d’information pour favoriser l’état kinase indépendamment de la perception de modulateur.

βA βB αC αD αE αF 592 600 610 620 630 640

PNPIYVRDKEGRMLLCNDAYLDTFGVTADAVLGKTIPEANVVGDPALAREMHEFLLTR

Y A PKH

βG βH βI

650 660 670 680 690 698

VAAEREPRFEDRDVTLHGRTRHVYQWTIPYGDSLGELKGIIGGWIDIT

CS P SGP S

Figure 94 : Mutations au niveau du domaine PAS, rendant BvgS insensible à la modulation et apparues de manière spontanée pour compenser l’inactivation de BvgS induite par des mutations des domaines périplasmiques. Les brins β sont colorés en rouge, les hélices en bleu et les boucles en noir. En vert sont indiquées les mutations induisant l’insensibilité.

Très récemment, nous avons obtenu une structure du domaine PAS (Fig. 95) en utilisant une protéine recombinante N2C3 (Dupré et al., 2013) modifiée par deux mutations de stabilisation du coiled coil en aval du domaine PAS (A709L et A713L) (Lesne et al., 2016). Ces expériences ont été réalisées par Elian Dupré, post-doctorant au laboratoire. Il s’agit d’une organisation particulière due vraisemblablement au packing cristallin, montrant un dimère central de domaines PAS en interaction avec deux monomères de part et d’autres du dimère. L’interface dimérique est très limitée. Les hélices C-terminales du dimère sont croisées et interagissent avec les hélices N-terminales des monomères flanquants. Vraisemblablement, la forme cristallisée ne serait pas la forme présente dans BvgS entre la membrane et le domaine kinase. Nous comptions sur cette structure pour aider au choix des résidus à cibler pour poursuivre l’analyse de cysteine scanning, mais elle ne nous y aidera pas. Des analyses de dynamique moléculaire en induisant des contraintes grâce aux résultats déjà disponibles de cysteine scanning (au niveau du PAS et des deux coiled coils en amont et aval) pourraient être effectuées pour construire un modèle plus plausible.

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A B

Figure 95 : Structure cristallographique du domaine PAS de BvgS. A. Le dimère central de domaine PAS est coloré en bleu et est en interaction avec des monomères de domaines PAS colorés en mauve. B. Représentation du dimère de domaine PAS central. Les feuillets β sont colorés en rouge, les hélices en cyan et les boucles en mauve. Les boucles de la structure ne sont pas encore toutes définies.

C. Bilan sur la transduction de signal au sein de BvgS via les linkers