Les résultats de l’analyse métabolomique sont inclus dans l’article : « Effect of maternal ponderal trajectories on metabolic profiles in liver and brain revealed by non-targeted metabolomics approach in mice » ci-joint en 2.4).
Par LC-HRMS, nous avons détecté 640 signaux dans le foie, correspondant à 278 métabolites. Dans l’hypothalamus, nous avons détecté 398 signaux, correspondant à 200 métabolites. Enfin, dans le bulbe olfactif, nous avons détecté 394 signaux, correspondant à 258 métabolites.
Un comptage manuel des classes de métabolites a mis en évidence les similarités entre les trois tissus, en particulier, une abondance élevée en acides aminés et peptides, en lipides, en nucléotides et nucléosides et en glucides (Figure 2 de l’article). Les analyses MSEA-ORA ont été réalisées dans chacun des tissus en comparant le jeu de données produit par Profilomic à leur base de données. Ces analyses ont mis en évidence une absence d’enrichissement dans les trois tissus.
Nous avons ensuite réalisé des analyses descriptives de nos données afin d’obtenir une représentation globale de l’impact du groupe maternel et du régime post-sevrage. L’analyse PLS-DA a permis la construction de modèles robustes selon le régime post-sevrage sur le profil métabolique du foie et de l’hypothalamus, mais aucun modèle n’a pu être construit pour le bulbe olfactif. Par ailleurs, aucun modèle n’a pu être construit selon le statut métabolique maternel sur le profil métabolique quel que soit le tissu étudié. Ainsi, l’analyse métabolomique a révélé un effet majeur du régime propre de l’individu dans le foie et l’hypothalamus (Figure 3 de l’article), confirmant ainsi les résultats précédemment obtenus sur l’analyse phénotypique (Panchenko et al. 2019).
Nous avons ensuite recherché les métabolites qui présentaient des différences d’abondance selon le régime post-sevrage, le groupe maternel ou une interaction entre ces facteurs. Pour cela, nous avons réalisé des analyses différentielles par ANOVA à 2 facteurs. A nouveau, nous avons observé un impact majeur du régime post-sevrage dans le foie, avec 108 métabolites différentiellement abondants (CD vs. HDF), soit plus d’un tiers des métabolites détectés dans le foie. L’abondance était augmentée pour 55 de ces métabolites et diminuée pour 53 d’entre eux. Le régime post sevrage a aussi eu un effet sur l’abondance de 16 métabolites dans l’hypothalamus et de 11 métabolites dans le bulbe olfactif, représentant respectivement 8% et 4% des métabolites détectés dans ces tissus (Figure 4 de l’article).
107
De manière intéressante, parmi les métabolites impactés par le régime post-sevrage, trois étaient communs aux trois tissus : l’anhydroglucitol, l’hydroxybutyrate et la saccharopine (Figure 4 de l’article). De plus, le sens de variation et l’amplitude d’effet du régime HFD sur l’abondance de chacun de ces métabolites étaient similaire dans chaque tissu (Figure 4 de l’article), avec une diminution de l’anhydrosorbitol et de la saccharopine et une augmentation de l’hydroxybutyrate chez les animaux HFD.
De manière intéressante, dans le foie, nous avons également mis en évidence une interaction entre le groupe maternel et le régime post-sevrage qui s’est matérialisée sur l’abondance d’un pentose ou hexose-phosphate, dont l’annotation n’a pu être précisée en MS/MS. Dans le groupe CTRL, le régime HFD entrainait une diminution de son abondance, tandis que dans le groupe OB, nous avons observé une augmentation suite au régime HFD. En revanche, dans le groupe WL, le régime HFD n’a pas eu d’effet sur l’abondance de ce métabolite (Figure 5b de l’article). Plus intéressant encore, toujours dans le foie, indépendamment du régime post-sevrage, l’obésité maternelle était associée à la diminution d’un métabolite, l’ansérine, tandis que la perte de poids maternelle préconceptionnelle normalisait son abondance (Figure 5a de l’article). Les résultats détaillés des analyses différentielles réalisées dans chaque tissu sont présentés en Annexe 3, 4, et 5 (Tableaux I, II et III).
Les analyses MSEA-QEA ont révélé un enrichissement en métabolites associés à différentes voies métaboliques en fonction des tissus, les résultats sont présentés en annexe : - Dans le foie, les métabolites étaient associés à un enrichissement du métabolisme des lipides, des phospholipides, des triglycérides et des acides gras, des glucides, des acides aminés, mais aussi du métabolisme des acides biliaires, du métabolisme mitochondrial ainsi que du métabolisme des vitamines B et de certaines hormones (Tableau IV).
- Dans l’hypothalamus, les métabolites étaient associés à un enrichissement de la voie de biosynthèse du pantothénate (vitamine B5) et de la coenzyme A, du métabolisme de la β-alanine, de la phénylalanine et de la tyrosine, du cycle de l’urée, de la biosynthèse de la spermidine et de la spermine, du métabolisme de l’aspartate, de la dégradation de la lysine, du métabolisme de l’aspartate, de la dégradation de la lysine, du métabolisme du propanoate, de la dégradation de la valine, la leucine et l’isoleucine, de la synthèse des hormones thyroïdiennes et du métabolisme de l’arginine et de la proline (Tableau V).
- Dans le bulbe olfactif, les métabolites étaient associés à un enrichissement du métabolisme de l’acide linoléique (oméga-6) et α-linolénique (oméga-3) (Tableau VI).
108
Les analyses de pathways ou voies métaboliques ont été réalisées en retirant l’ADP de la liste des métabolites impactés par le régime HFD en raison de sa place centrale dans une multitude de voies métaboliques et réactions enzymatiques. De plus, l’utilisation de la base de données SMPDB, pour les analyses de pathways dans le foie, comportait des erreurs, tel que la présence d’enzymes dans la liste des métabolites de notre jeu de données. Nous avons donc choisi, pour le foie, d’utiliser uniquement les analyses de pathways réalisées à l’aide de la base de données KEGG. Ces analyses ont permis de révéler, dans le foie, un impact très important (Score d’impact >40%) du régime post-sevrage sur le métabolisme de la glutamine et du glutamate, la biosynthèse de l’ubiquinone et autres terpénoïdes-quinone, le métabolisme de la taurine et de l’hypotaurine, de la β-alanine et du méthane. De manière moins importante (Score d’impact compris entre 10 et 40%), le régime post-sevrage de la descendance a eu un impact sur le métabolisme des acides aminés, des lipides, des glucides et de la vitamine B. La liste complète des pathways est fournie dans le Tableau 1 de l’article. Dans l’hypothalamus, le régime post-sevrage des descendants a eu un impact important sur le métabolisme de l’aspartate, de l’arginine et de la proline, le cycle de l’urée et sur le métabolisme de la phénylalanine et de la tyrosine. De plus, il a eu un effet, bien que moindre, sur la biosynthèse du pantothénate et de la coenzyme A, sur le recyclage de l’ammoniac ainsi que sur la dégradation de la lysine. Ces résultats sont les même quel que soit la base de données utilisée (Tableau 2 de l’article). Enfin, dans le bulbe olfactif, en utilisant la base de données SMPDB, le régime post-sevrage des descendants a eu un impact important sur le métabolisme de l’acide linoléique et α-linolénique. En utilisant la base de données KEGG, le régime post-sevrage des descendants a eu un impact sur le métabolisme de l’arginine et de la proline, sur la biosynthèse du pantothénate et de la coenzyme A ainsi que sur la dégradation de la lysine (Tableau 2 de l’article).
La MSEA-QEA n’apporte que peu d’informations supplémentaires aux analyses de
pathways, qui donnent déjà des résultats satisfaisants et permettent une bonne interprétation
de nos données. Ces 2 analyses étant redondantes, nous avons choisi de présenter uniquement les analyses de pathways dans l’article.
En résumé, ce qu’il faut retenir des résultats des analyses métabolomiques est :
- un effet majeur du régime post-sevrage qui touche principalement le foie, mais qui affecte aussi l’hypothalamus et le bulbe olfactif.
- un impact du régime HFD post-sevrage sur 3 métabolites communs aux 3 tissus étudiés : l’anhydroglucitol, la saccharopine et le β-hydroxybutyrate.
109
- un effet persistant du groupe maternel dans le foie concernant 2 métabolites : un pentose ou hexose-phosphate et l’ansérine.
L’ensemble de ces résultats est discuté dans la 1ère partie de la partie Discussion de ce manuscrit de thèse.
Mouse liver and brain metabolomic response to high fat diet and maternal ponderal trajectories
Sofiane Safi-Stibler, Etienne A. Thévenot, Luc Jouneau, Mélanie Jouin, Alexandre Seyer, Hélène Jammes, Delphine Rousseau-Ralliard, Christine Baly and Anne Gabory, to be submitted to Nature metabolism
Abstract
Altered nutrition during developmental windows is particularly of high concern in offspring metabolic disease, with emerging questions about the role of the maternal weight trajectories before conception, particularly after weight loss. Insight in underlying physiological pathways in the offspring is pivotal, but poorly understood, and a broad overview is lacking in adults to identify affected pathways. How the maternal metabolic status impacts the offspring’s metabolome was examined in three tissues involved in energy homeostasis control, liver, hypothalamus and olfactory bulb of adult male mice born to control, obese or weight loss mothers and fed either a control or high fat diet after weaning. Here we show that post-weaning diet interferes with the production of several metabolites in the three tissues, anhydroglucitol, saccharopine and hydroxybutyrate being common. Moreover, the maternal diet has a unique impact on the production of two metabolites, a pentose- or hexose-phosphate and anserine in the liver.
Introduction 1
In 2015, the worldwide prevalence of obesity in child-bearing age women was 15%1. Maternal obesity is a 2
risk factor for metabolic and obstetrical complications during pregnancy2, but also for foetuses, since it is 3
associated with a higher risk of either large for gestational age foetuses or, on the contrary, foetal growth 4
restriction3–5. Consistently with the concept of the developmental origins of health and disease (DOHaD), 5
obesity impacts on foetal organogenesis, altering organs functions after birth6. 6
Given the many risks for both mother and children, overweight women are advised to lose weight before 7
conception7. However, the consequences of weight loss, in response to a nutritional intervention, on foetal 8
and tissues development are poorly known, as well as their long-term effects8. Since foetal tissues adapt to 9
the nutritional gestational environment, any variation in energy intake during key periods of gametogenesis 10
and development alters the establishment of key organs regulating energy metabolism and eating behaviours, 11
with long-term consequences6,9. The morphology and functions of the liver, which controls metabolic 12
homeostasis, are altered in utero in the context of maternal obesity and / or high fat diet (HFD)10,11. These 13
liver changes are associated with the development of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) in 14
adulthood10. The morphology and functions of the hypothalamus, a brain structure involved in the control of 15
energy homeostasis and eating behaviours, are also altered by obesity and / or maternal HFD12,13. These 16
hypothalamic alterations are associated in the adulthood with changes in dietary and hedonic behaviours14–16. 17
Finally, the function of the olfactory system which participates to the food intake control can also be altered 18
by maternal HFD17,18. 19
We developed a mouse animal model of preconceptional maternal obesity and weight loss. At short term, 20
maternal obesity led to small-for-gestational age foetuses that was normalized with preconceptional maternal 21
weight loss19. To study whether the maternal weight trajectories influenced the offspring’s health at long 22
term, offspring were challenged after weaning with a HFD until adulthood. At the adult age, 23
periconceptional maternal obesity was associated to a worsening of diet-induced obesity in male. 24
Preconceptional weight loss normalized this phenotype but was associated with a decrease of olfactory 25
sensitivity whatever the post-weaning diet18. 26
In order to gain insight into the mechanisms associated to these metabolic outcomes, we hypothesized that 27
maternal obesity may impact the metabolic phenotype of the offspring. We also wanted to know if 28
preconceptional maternal weight loss, induced by a nutritional intervention, could influence it. For that, we 29
chose a non-targeted metabolomics approach. Such a holistic analysis approach can be judicious in DOHaD 30
to discover metabolic pathways in the offspring, associated with maternal metabolism20. To our knowledge, 31
there are only few metabolomics studies in the context of DOHaD and most of them generally focused on the 32
study of placenta or bio-fluids such as serum, in the context of maternal obesity21,22 or in protein restricted 33
mothers23–26. Using LC-HRMS, we analysed the metabolome of three target tissues involved in food intake 34
and nutrient management (liver, olfactory bulb and hypothalamus) according to the maternal and post-35
weaning nutritional status in male mice at 6 months of age. 36
37 38
Materials and methods 39
40
Sample processing and preparation 41
The animal model has been previously described elsewhere18. Briefly, offspring born to control (CTRL), 42
obese (OB) or weight loss after diet-induced obesity (WL) mothers were put on either a control (CD) or high 43
fat diet (HFD), giving 6 F1 groups (Figure 1): CTRL-CD, WL-CD, CD, CTRL-HFD, WL-HFD, OB-44
HFD. This study only focused on F1 males, the only ones with a phenotype due to maternal conditioning in 45
adulthood. Six representative individuals of their post-weaning diet and maternal group were selected in each 46
group, based on phenotypic and behavioural similarities using a Principal Component analysis 47
(Supplementary data 1). The six chosen individuals were the nearest of the barycentre of their own group. 48
We excluded individuals that presented macroscopically apparent lesions at the time of sampling, as well as 49
animals with extreme phenotype. 50
The mass spectrometry analysis was carried out by the Profilomic company (Saclay, France) on samples 51
prepared according to the following procedure. The liver samples were grinded with mortar and pestle in the 52
presence of liquid nitrogen. Ground liver (LI), intact hypothalamus (HYP) and whole olfactory bulb (WOB) 53
tissues (15 mg each) were homogenized in ultrapure cold water using a sonicator (Vibra-Cell™ 75185, Sonic 54
& Materials, Inc.). Tissue homogenates were extracted by adding 600µl of cold methanol containing an 55
internal standard mixture (Alanine 13C; Metformin ; Ethylmalonic acid ; Aspartate 15N ; Glucose 13C ; 2-56
aminoanthracene ; Amiloride ; Imipramine ; Atropine ; Ampicillin ; Prednisone ; Colchicine ; 57
Dihydrostreptomycin ; ATP 15N), kept on ice 90 min and centrifuged at 20,000 x g for 10 min at 4°C. The 58
aqueous phase was collected and evaporated to dryness under a stream of nitrogen (TurboVap® LV, 59
Biotage). The dried samples were re-suspended in 10 mM ammonium carbonate pH 10.5: acetonitrile (40:60 60
v: v) and stored at -80°C until mass spectrometry analysis. 61
62
Liquid chromatography–high resolution mass spectrometry (LC-HRMS) analyses for metabolites 63
LC-HRMS analysis and data processing were performed using a Q-Exactive™ Hybrid Quadrupole-64
Orbitrap™ Mass Spectrometer coupled to a Transcend 1250 liquid chromatography system (ThermoFisher 65
Scientific, Les Ulis, France) equipped with an aSequant ZIC-pHILIC column (Merck). Samples were 66
analysed in high resolution (70 000 FWHM) through alternative positive and negative ionization modes. 67
Raw data were processed and metabolites annotated in comparison with the exact mass and retention time of 68
the Profilomic metabolites database. Annotated metabolites were compared both to the human metabolome 69
database (HMDB) and to the chemical entities of biological interest (ChEBI) database in order to obtain 70
accession numbers. MS/MS validation of metabolites annotation was performed by Profilomic on a subset of 71
HFD-impacted LI metabolites and on all HFD-impacted HYP and WOB metabolites. 72
73
Statistical analysis 74
Datasets form each tissue were analysed separately. Statistical analyses were performed using the 75
collaborative portal dedicated to metabolomics data processing, analysis and annotation for Metabolomics 76
community, Workflow4Metabolomics (W4M)27. Raw signals were log10 transformed. A quality metric test, 77
including a Hotelling’s T2 test on first plane of principal component analysis and z-score of intensity decile 78
(threshold p-value = 0.001), discarded one WL-CD and one CTRL-HFD samples from the LI dataset, one 79
WL-CD sample from the HYP dataset and one WL-HFD sample from the WOB dataset. Partial least 80
squares–discriminant analysis (PLS-DA) was performed in each tissue, using each group (maternal group, 81
post-weaning diet) as Y response. Transformed signals were mean-centred and divided by the standard 82
deviation of each variable. All validated models had a significant Q2Y ≤ 0.00127. In addition, no outlier was 83
detected in our models by the observation diagnostic. A 2-ways analysis of variance (ANOVA) with 84
interaction testing was performed on the maternal group and the post-weaning diet. In order to decrease the 85
bias caused by the redundancy of metabolites detected in both ionization mode, these analyses were 86
performed separately on metabolites detected in positive and negative ionisation. The p-values were adjusted 87
for the false discovery rate (FDR) using Benjamini-Hochberg procedure and considered significant if FDR ≤ 88
0.05. For the metabolites showing a maternal group effect or interaction between the maternal group and 89
post-weaning diet, a post-hoc test was performed on the raw signal intensity from MS peaks, using the R 90
software (version 3.4.3), with the LSMeans package (version 2.27-62) and adjusted with the Tukey method. 91
92
Over representation analysis 93
Dataset from each tissue were analysed separately. Metabolites input type was HMDB accession numbers. 94
Metabolites Set Enrichment Analysis–Over Representation Analysis (MSEA-ORA) were performed using 95
the whole set of metabolites detected in each tissue and the reference database was the Profilomic 96
metabolites database (960 compounds). 97
98
Pathways analyses 99
Dataset from each tissue were analysed separately. MetaboAnalyst tool was used with HMDB accession 100
numbers. Mus musculus (KEGG) database was used as pathway library. The selected pathway enrichment 101
analysis method was “Global ANCOVA” and the pathway topology analysis was “relative betweenness 102
centrality”. Raw p-values were adjusted using False Discovery Rate. We chose to exclude the metabolite 103
ADP in the liver pathway analysis because of its central place in a multitude of metabolic pathways and 104
enzymatic reactions. We also excluded metabolites with multiple annotations as well as metabolites for 105
which MS/MS signal did not correspond to any expected metabolites. The pathway impact score is the 106
cumulative percentage from the matched metabolite nodes, based on the importance of each node among a 107 pathway. 108 109 110 111
Results 112
113
Nervous and non-nervous tissues display similar metabolite profiles 114
Metabolomics investigations were performed using liquid chromatography separation followed by high-115
resolution mass spectrometry (LC-HRMS). Up to 471, 292 and 394 variables were annotated in positive and 116
negative ionisation mode in the liver (LI), hypothalamus (HYP) and whole olfactory bulb (WOB) 117
respectively. They correspond to 293, 206 and 271 unique metabolites in LI, HYP and WOB, respectively. 118
Some of these metabolites had multiple annotations (between 2 and 7 possible identities): 73 in the LI, 46 in 119
the HYP and 68 in the WOB. Interestingly, the 5 main chemical classes of metabolites were similar for all 120
tissues: amino acids, carbohydrates, nucleosides, lipids and organic acids. The main differences between 121
tissues were the proportion of each chemical classes and the presence of alcohols and polyols compounds in 122
the HYP (Figure 2). 123
124
Post-weaning diets discriminate the metabolite profile of both the liver and hypothalamus 125
Partial least square–discriminant analysis (PLS-DA) was carried out in order to detect global differences 126
between groups for each tissue. We particularly investigated the effect of maternal groups and post-weaning 127
diet. No model was significant for any tissue when maternal group was used as a discriminant parameter 128
whatever the tissue. Using post-weaning diet as a discriminant parameter, robust and validated models were 129
built for the sets of metabolites detected in the LI and HYP, but not in the WOB (Figure 3a, 3c). In the LI, 130
CD and HFD groups were separated on the first dimension (t1) of the PLS-DA score plots (Q²Y= 0.917) 131
(Figure 3b). In the HYP, CD and HFD groups were separated on the two first dimensions (t1 and t2) of the 132
PLS-DA score plot (Q²Y=0.74) (Figure 3d). This descriptive analysis allowed us to conclude to a global 133
effect of the post-weaning diet on the metabolite profiles of the LI and the HYP. 134
135
The post-weaning diet has a major impact on metabolite abundance in the liver. 136
Post-weaning diet effects can have masked some subtle effects of maternal group . In order to get a better 137
evaluation of the effect of each group and interactions between them, we carried out differential analyses on 138
each sets of metabolites using 2-ways ANOVA. In the LI, we found substantial differences in the metabolic 139
profile according to the post-weaning diet: 108 metabolites were significantly altered, representing more than 140
1/3 of the initial set (Figure 4a). Fold changes varied between 2.32 and -2.27 with 4 metabolites with an 141
absolute value of fold change >1.5. The abundance of 55 metabolites was increased under HFD, while the