2.1) Contexte
En 2015, la prévalence de l’obésité chez la femme était de 15% (OMS, 2016). L’obésité est un facteur de risque de complications métaboliques et obstétricales au cours de la grossesse (C. Y. W. Lee et Koren 2010). Chez l’être humain, l’obésité maternelle est associée à un poids fœtal élevé pour l’âge gestationnel ou, au contraire, à une restriction de la croissance fœtale (Rajasingam et al. 2009; Gaudet et al. 2014; Acosta et al. 2015). L’obésité peut avoir un impact sur l’organogenèse du fœtus, avec des conséquences sur la fonction des organes après la naissance (Williams et al. 2014).
Compte tenu des nombreux risques, à la fois pour la mère et son enfant, il est recommandé aux femmes en surcharge pondérale de perdre du poids avant la conception (Haute Autorité de Santé 2011). Cependant, les conséquences d’une perte de poids, induite par une intervention nutritionnelle chez les sujets obèses, sur le développement fœtal et par extension, sur les tissus participant au contrôle de l’homéostasie énergétique et du comportement alimentaire sont peu connues, de même que les effets qu’elle pourrait avoir à long terme (Forsum et al. 2013). Une variation des apports énergétiques au cours des périodes clés de la gamétogenèse et du développement pourraient altérer la mise en place d’organes clés de la régulation du métabolisme énergétique et des comportements alimentaires, avec, également, des conséquences à long terme pour la santé (Williams et al. 2014; Dearden et Ozanne 2015).
La morphologie et la fonction du foie, organe qui contrôle l’homéostasie métabolique, sont altérées in utero par l’obésité et/ou la surnutrition hyperlipidique de la mère (McCurdy et al. 2009; Plata et al. 2014). Ces altérations hépatiques sont associées au développement d’une stéatose hépatique non-alcoolique à l’âge adulte (McCurdy et al. 2009). La morphologie et les fonctions de l’hypothalamus, structure cérébrale impliquée dans le contrôle de l’homéostasie
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énergétique et les comportements alimentaires, sont aussi altérées par l’obésité et/ou le régime HFD maternel (Chang et al. 2008; Sanders et al. 2014). Ces altérations hypothalamiques peuvent persister jusqu’à l’âge adulte et sont associées à une modification des comportements alimentaires et hédoniques (Vogt et al. 2014; D Peleg-Raibstein et al. 2016). Enfin, la fonction du bulbe olfactif, structure cérébrale impliquée dans le traitement et la modulation de la réponse aux odeurs, peut, elle aussi, être altérée par la nutrition hyperlipidique maternelle à court et long terme (Merle et al. 2019; Panchenko et al. 2016).
Afin d’identifier les mécanismes associés à ces variations fonctionnelles, les études portent souvent sur un métabolite ou un groupe de métabolites, ce qui est pertinent mais réducteur. En effet, le métabolisme implique de multiples voies et une analyse holistique peut être judicieuse dans le contexte de la DOHaD pour découvrir de nouvelles voies métaboliques chez la descendance associées au métabolisme maternel (Hivert et al. 2015). La métabolomique non-dirigée est donc une méthodologie de choix. En effet, cette méthode holistique permet d’avoir une image globale des métabolites d’un tissu, permettant ainsi une analyse exploratoire, contrairement aux études dirigées qui s’intéressent à des métabolites spécifiques.
Chez l’être humain, peu d’articles présentent les résultats d’études métabolomiques dans le contexte de la DOHaD. Elles sont généralement centrées sur l’étude du plasma maternel et des descendants, du sang de cordon ou du placenta, en absence de toute intervention nutritionnelle chez les mères obèses (Rauschert et al. 2017), et rarement consacrées à la comparaison de plusieurs compartiments biologiques. Chez l’animal, quatre études métabolomiques ont été réalisées dans le contexte de la DOHaD, plus particulièrement en condition de restriction protéique (Preidis et al. 2014; Agnoux et al. 2014; Sato et al. 2017; Pedroso et al. 2017; 2018), l’étude d’Agnoux étant réalisée sur plusieurs compartiments métaboliques. Une seule étude de la littérature, chez le macaque, présente les effets d’une intervention nutritionnelle préconceptionnelle (retour à un régime contrôle) en contexte d’obésité maternelle sur les métabolites du foie fœtal (Wesolowski et al. 2018). Quant aux analyses métabolomiques sur le cerveau, elles sont peu nombreuses pour des questions de limites méthodologiques (Gonzalez-Riano, Garcia, et Barbas 2016), mais prometteuses pour identifier des voies impactées par une alimentation déséquilibrée (Rutkowsky et al. 2018). A notre connaissance, elles ne pas encore développées dans le cadre de la DOHaD. Les effets à long terme des trajectoires pondérales maternelles préconceptionnelles sur le phénotype métabolique du foie et des tissus nerveux restent donc à évaluer.
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Sur la base des résultats du modèle TPMP, nous avons posé l’hypothèse selon laquelle l’obésité maternelle pourrait avoir un impact négatif sur le phénotype métabolique du foie, de l’hypothalamus et du bulbe olfactif des descendants F1. Le but était de voir si la perte de poids maternelle préconceptionnelle, induite par une intervention nutritionnelle, pouvait corriger les effets induits par le contexte obésogène maternel, par quelle(s) voie(s) métaboliques, et selon quel contexte post-sevrage.
Afin d’avoir une image globale des voies métaboliques de ces tissus, nous avons choisi de les analyser de manière non-dirigée en chromatographie liquide suivie d’une détection par spectrométrie de masse à haute résolution (LC-HRMS, pour liquid
chromatography – high resolution mass spectrometry). La LC-HRMS permet aussi d’évaluer
les différences d’abondance des métabolites entre les différents groupes de régimes, dans chaque tissu, de manière précise grâce à la haute résolution.
Nos travaux antérieurs montraient que l’obésité maternelle préconceptionnelle était associée à une aggravation de l’obésité des descendants mâles sous régime HFD tandis que la perte de poids préconceptionnelle était associée à une diminution de la sensitivité olfactive des mâles F1 à l’âge adulte, indépendamment de leur régime post-sevrage (Panchenko et al. 2019). Pour ces raisons, nous avons sélectionné les 6 individus mâles les plus représentatifs (médians) de leur groupe de régime maternel et post-sevrage en se basant sur une analyse en composante principale, en excluant les individus qui présentaient des lésions macroscopiques observées lors des prélèvements sur au moins l’un des tissus d’intérêt. Les tissus ont été prélevés sur les souris à 6 mois, après le sacrifice, puis conservés à -80°C jusqu’à leur envoi à l’entreprise Profilomic. Cette entreprise a réalisé la préparation des échantillons, les analyses par LC-HRMS et procédé à l’annotation putative des métabolites en se basant sur leur base de données interne de composés chimiques purs. Nous avons ensuite réalisé les analyses bio-statistiques et bio-informatiques sur le logiciel Workflow4Metabolomics, sous la supervision d’Etienne Thévenot (CEA Saclay, Digiteo, MetaboHub) et grâce à la formation
Workflow4Experimenters que j’ai suivie en 2018
(https://workflow4metabolomics.org/W4E2018). Grâce à ces analyses, nous avons pu identifier les métabolites dont l’abondance était impactée par le groupe maternel ou le régime post-sevrage, ainsi que l’interaction entre les deux et évaluer les voies métaboliques impliquées à l’aide du logiciel MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca/).
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2.2) Méthodes
2.2.1) Analyses statistiques
Les données, issues de l’étude métabolomique par LC-HRMS réalisée par Profilomic, ont été importées dans l’outil d’analyse en ligne sous environnement Galaxy, Workflow4Metabolomics (W4M). Une étape préalable aux analyses statistiques de ces données a été la vérification de leur qualité, à l’aide de l’outil « quality metrics » proposé par W4M. A l’issue de cette vérification, les individus présentant des données aberrantes (outliers) ont été exclus de la suite des analyses : pour le foie, un CTRL-HFD et un WL-CD, pour l’hypothalamus, un WL-CD et pour le bulbe olfactif, un WL-HFD. Chaque tissu a été analysé séparément.
Analyses descriptives
Les analyses descriptives ont été réalisées en utilisant la méthode d’analyse discriminante des moindres carrés partiels, ou PLS-DA (pour partial least squares –
discriminant analysis). Ce type d’analyse permet de construire un modèle à partir de données
et de tester la robustesse de ce modèle. La PLS-DA permet d’identifier les métabolites les plus représentatifs du modèle ainsi que ceux contribuant le plus aux différences entre les groupes d’individus en leur attribuant un score VIP (pour variable influence on projection). Ce type de score est particulièrement intéressant dans une optique de recherche de biomarqueurs, mais ce n’était pas l’objet primaire de notre étude. De plus, ce type d’analyse ne nous permet pas de révéler les effets du groupe maternel, du régime post-sevrage ou de l’interaction entre les deux. Seule une analyse différentielle nous permet d’obtenir ces informations.
Analyses différentielles
Le seul test statistique différentiel permettant de tester les effets du groupe maternel d’une part et du régime propre aux individus d’autre part, ainsi que les interactions entre ces différents effets, est l’ANOVA à deux facteurs (2-ways ANOVA). Pour les métabolites dont l’abondance détectée différait en fonction du groupe maternel ou présentait une interaction entre le groupe maternel et le régime post-sevrage, un test post-hoc par la méthode de Tukey a été réalisé en utilisant le package LS-Means du logiciel R.
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2.2.2) Analyses bio-informatiques
Le but de ces analyses bio-informatique était d’identifier les voies métaboliques les plus représentées dans notre jeu de données et d’identifier les voies métaboliques impactées par le régime des descendants.
Constitution des tables d’analyse des métabolites
La première étape, indispensable pour constituer un jeu de données qui puisse être analysée ensuite par différents outils, a été la vérification manuelle de l’identifiant associé à chaque métabolite, en se basant sur le nom du métabolite, sa formule chimique, son identifiant HMDB (pour The Human Metabolome Database, http://www.hmdb.ca/, qui est une base de données de métabolites présents chez l’être humain), son identifiant ChEbi (pour Chemical
Entities of Biological Interest, https://www.ebi.ac.uk/chebi/, qui est une base de données
d’entités moléculaires axée sur les «petits» composés chimiques). Pour cela nous avons exploré plusieurs bases de données : ChEbi, KEGG, HMDB, PubChem, ChemSpider. Cependant, dans notre jeu de données initial, certains métabolites n’avaient pas de numéro d’identification associé à la base de données HMDB ou KEGG : 7 dans le foie, 3 dans l’hypothalamus et 4 dans le bulbe olfactif.
Test des différents outils bio-informatiques disponibles
Les trois outils d’analyse les plus fréquemment utilisés dans le cadre d’études métabolomiques ont été testés :
- KEGG (pour Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) est une base de données visant à comprendre les fonctions et l’organisation des systèmes biologiques, à partir d'informations moléculaires, en particulier de jeux de données à grande échelle générés par le séquençage du génome et d'autres analyses à haut débit comme la métabolomique. Dans nos jeux de données, une partie des métabolites n’avait pas d’identifiant KEGG. De plus, peu d’outils adaptés aux analyses bio-informatiques de données de métabolomique sont actuellement disponibles sur cette interface.
- MetExplore propose une solution en ligne composée d'outils interactifs pour l’analyse et l'exploration de réseaux métaboliques. En particulier, il comprend un module puissant de visualisation des réseaux. Cet outil s’est révélé peu adapté à nos jeux de données. En effet, une grande partie des identifiants des métabolites détectés dans nos tissus ne sont pas
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reconnus et il était impossible d’importer la moitié des métabolites présentant une abondance différentielle entre régime post-sevrage des descendants.
- MetaboAnalyst est une interface d’analyse statistique, fonctionnelle et intégrative de données métabolomiques. Dans cet outil, les identifiants utilisés sont ceux de la base de données HMDB, qui sont ensuite convertis en identifiants KEGG. Aussi, seule une faible proportion de métabolites de nos jeux de données n’était pas reconnue. Dans le set initial, nous en avions : 25/214 dans le foie, 14/155 dans l’hypothalamus et 32/197 dans le bulbe olfactif, parmi les métabolites impactés par le régime HFD : 12/88 dans le foie, 3/12 dans l’hypothalamus et 1/10 dans le bulbe olfactif. De plus, cet outil permettait de faire des analyses d’enrichissement de type MSEA (metabolite set enrichment analysis), soit de manière qualitative (analyse de surreprésentation ou ORA pour over representation analysis) soit de manière quantitative (analyse quantitative d’enrichissement ou QEA pour quantitative
enrichment analysis). Il était aussi possible de réaliser des analyses permettant l’identification
des voies métaboliques impactées (analyses de pathways) en utilisant les bases de données SMPDB (pour Small Molecule Pathway Database, http://smpdb.ca/) ou KEGG. Quelle que soit la base de données utilisée, l’étape finale de l’analyse (topographie des voies métaboliques) utilisait la base de données de voies métaboliques KEGG.
Compte-tenu des éléments présentés ici, il a été décidé de procéder aux analyses bio-informatiques en utilisant l’outil d’analyse MetaboAnalyst et en réalisant deux types d'analyses : des analyses d’enrichissement MSEA-ORA et MSEA-QEA en utilisant la base de données SMPDB, ainsi que des analyses de voies métaboliques ou pathways, en utilisant la base de données KEGG.
2.2.3) Protocole d’analyse des données issues d’étude métabolomique
Le protocole d’analyse à partir des données brutes, jusqu’à l’annotation putative des métabolites, est issu de la formation Workflow4Experimenters, de MetaboHUB et est présenté en annexe (Protocole I).
En annexe se trouve aussi le protocole d’analyse que nous avons utilisé en partant des données produites par Profilomic, jusqu’à l’identification des voies métaboliques différentiellement impactées par le régime post-sevrage des descendants (Protocole II).
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