Résultats additionnels

Au cours de ce protocole expérimental, les différentes mesures sur les facteurs du syndrome métabolique (Figure 23) ainsi que pour le profil des lipides hépatiques (Figure 24) ont également été faites sur le groupe Ctrl+Thé. Aucune différence significative n’a été observée entre les groupes Ctrl et Ctrl+Thé sur aucun des paramètres du syndrome métabolique (Figure 23), ni sur les dosages des lipides hépatiques (Figure 24). Ces résultats suggèrent que le thé a un impact bénéfique au niveau hépatique chez des populations atteintes de syndrome métabolique mais que cet effet n’est pas retrouvé chez des populations saines.

D’autre part, nous avons également mesuré l’expression d’autres gènes hépatiques du métabolisme lipidique chez les groupes Ctrl, HFS et HFS+Thé (Figure 25).

Dans un premier temps, l’expression des gènes Srebp2, Hmgr, Ldlr, Lxr, Cyp7a1, Abcg5 et

Abcg8 impliqués dans le métabolisme du cholestérol a été évaluée (Figure 25A). L’HMG-CoA réductase (codée par le gène Hmgr) est la principale enzyme impliquée dans la synthèse du cholestérol et son expression est principalement régulée par le facteur de transcription

Srebp2 (Goldstein et al., 2006). Dans notre étude, nous avons montré que le thé diminue l’expression de Srebp2 (Figure 25A) suggérant de ce fait que la baisse de la teneur en cholestérol observée dans le foie était liée à une baisse de sa synthèse via ce système de régulation. Des études ont en effet précédemment montré une diminution du taux de cholestérol hépatique suite à la consommation de thé parallèlement à une diminution des taux d'ARNm Srebp2 et Hmgr (Axling et al., 2012; Lin et al., 2007; Park et al., 2011; Uchiyama et al., 2011). Cependant, dans notre étude, la diminution de Srebp2 observée chez les rats HFS+Thé n’était pas accompagnée d’une diminution significative de l'expression du gène

Hmgr (Figure 25A) ne permettant pas de conclure à un tel effet. Nous avons pu ensuite mettre en évidence que le thé augmentait l’expression de Cyp7a1 (Cholesterol 7α hydroxylase) et

Abcg5 (ATP binding cassette g5) impliqués dans l’excrétion du cholestérol par voie biliaire (Figure 25A), suggérant fortement que la baisse du cholestérol hépatique que nous avons observée serait liée plutôt à une augmentation de son élimination via la bile. Pour les autres gènes du métabolisme du cholestérol, aucune différence significative n’a été observée entre les différents groupes de rats (Figure 25A).

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Dans un second temps, l’expression des gènes Lpl, ApoE, Abca1, ApoA1, Lcat et Sr-b1 impliqués dans le métabolisme des lipoprotéines (Figure 25B) a été évaluée. Nos résultats ont montré que le régime HFS entrainait une diminution de l’expression de la lipoprotéine lipase

Lpl, impliquée dans l’hydrolyse des triglycérides des lipoprotéines circulantes, comparé au rat Ctrl, et que la supplémentation de thé ne modifie pas cette diminution (Figure 25B). De plus, le régime HFS a entrainé une diminution significative de l’expression de l’Apolipoprotéine A1, impliquée dans la synthèse de HDL chez le groupe de rats HFS comparé au groupe Ctrl. Aucune différence significative entre les groupe HFS+Thé et Ctrl pour l'expression du gène

Apoa1 n'a été observée. Ce résultat est concordant avec la diminution significative du taux de HDL observée chez le groupe HFS comparé au groupe Ctrl et à la prévention de cette baisse par la consommation de thé.

Page 157 0 5 10 15 20 25 * * ns Ctrl Ctrl HFS HFS +Tea +Tea 0 5 10 15 20 25 30 * * ns Ctrl Ctrl HFS HFS +Tea +Tea 160 180 200 220 240 * * ns Ctrl Ctrl HFS HFS +Tea +Tea T rig ly c e rid e s ( m g /d L ) 0 20 40 60 80 100 * * ns Ctrl Ctrl HFS HFS +T ea + Te a 0 2 4 6 8 10 12 14 16 * * Ctrl Ctrl HFS HFS + Te a +T ea ns H D L ( m g /d L ) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 # * Ctrl Ctrl HFS HFS + T ea + Tea ns N E F A ( m m o l/ L ) 80 100 120 140 160 * * Ctrl Ctrl HFS HFS +Tea +Tea ns 0 20 40 60 80 Ctrl Ctrl HFS HFS + Te a + Te a # * ns

Figure 23. Effet du thé sur les facteurs de risque du syndrome métabolique chez des rats Wistar.

Les animaux ont été sacrifiés après 14 semaines de traitement avec un régime standard (Ctrl et Ctrl+Thé) et un régime hypercalorique (HFS et HFS+Thé). L’eau de boisson des groupes Thé a été supplémentée en Thé. (A) Changements de masse corporelle, (B) Evaluation de la glycémie et de l’insulino-résistance et (C) Evaluation du profil lipidique plasmatique dans chaque groupe (n=15). Les résultats sont exprimés en moyenne ± erreur standard à la moyenne (SEM). *p<0.05 comparé au groupe Ctrl et #

Page 158 0 20 40 60 80 100 120

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Figure 24. Effet du thé sur le profil lipidique hépatique

(A) Masse des foies, (B) Quantité de lipides totaux dans le foie, (C) Taux de triglycérides hépatiques, (D) Taux de cholestérol hépatique et (E) Taux d’acides gras non-estérifiés hépatiques. Les résultats sont exprimés en moyenne ± erreur standard à la moyenne (SEM). *p<0.05 comparé au groupe Ctrl et ^#p < 0.05 comparé au groupe HFS.

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Figure 25. Effet du thé sur l’expression des gènes du métabolisme lipidique

(A) Expression relative des gènes impliqués dans le métabolisme du cholestérol (B) Expression relative des gènes impliqués dans le métabolisme des lipoprotéines. Les résultats sont exprimés en moyenne ± erreur standard à la moyenne (SEM). *p<0.05 comparé au groupe Ctrl et #

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L’objectif de ce travail de thèse était d’étudier les effets et les mécanismes d’action du thé sur la NAFLD et ses facteurs de risque associés, en particulier la dyslipidémie.

Effets lipotropes du thé via la diminution de la lipogenèse hépatique

L’approche en culture primaire d’hépatocytes de rat et l’étude in vivo chez le modèle de rat syndrome métabolique apportent des informations qui convergent vers un effet bénéfique de notre extrait aqueux de thé sur les lipides hépatiques. En effet, le contenu total en lipides du foie diminue de 58 % sur modèle cellulaire et de 13,7 % dans le modèle animal. Dans l'étude animale, nous avons également pu montrer une diminution de 24,3 % des triglycérides, de 24,6 % des acides gras non estérifiés et de 43,6 % du cholestérol dans le foie suite à la consommation de thé. Ce niveau de diminution des lipides hépatiques avait déjà été montré chez le rat et la souris pour du thé vert ou noir avec une amplitude proche des nôtres pour des doses en moyenne de 0,8 mg d'extrait de thé/g masse corporelle/jour (Li et al., 2006; Liu et al., 2015; Park et al., 2011; Sae-Tan et al., 2011; Uchiyama et al., 2011) et avec une amplitude plus élevée pour des doses en moyenne de 3 mg d'extrait de thé/g masse corporelle/jour (Axling et al., 2012; Bruno et al., 2008; Heber et al., 2014; Lin et al., 2007). Dans notre étude, la quantité d'extrait sec pour 50 mL d'infusion était d'environ 300 mg correspondant à une consommation quotidienne d'environ 0,6 mg d'extrait sec par gramme de masse corporelle chez nos rats ce qui explique la concordance de nos résultats avec ceux obtenus dans les précédentes études (Li et al., 2006; Liu et al., 2015; Park et al., 2011; Sae-Tan et al., 2011; Uchiyama et al., 2011).

D’après nos résultats, la diminution du cholestérol hépatique peut être expliquée par une augmentation des gènes impliqués dans l’excrétion biliaire du cholestérol, à savoir CYP7A1 et ABCG5. L’augmentation de CYP7A1 a déjà été mise en évidence chez la souris soumise à un régime hyperlipidique (Lipides, 60% d'énergie) supplémenté à 1% d’extrait aqueux de thé vert (Kim et al., 2012) et sur une lignée d’hépatocytes humains (HepG2) exposés à différentes catéchines (EGCG, EGC, ECG, EC) (Lee et al., 2008). Au contraire, aucune différence n’avait été rapportée dans une autre étude chez la souris soumise à un régime enrichi à 32g de lipides pour 100 g de nourriture (≈ 60% d'énergie) et supplémenté en thé pu-erh (0,225% et 0,45%) dans l’eau de boisson (Shimamura et al., 2013). Une autre étude a montré que l’EGCG à une dose quotidienne de 50 mg/kg, entrainait l’augmentation de la protéine ABCG5 dans le foie de rats soumis à un régime standard (Hirsova et al., 2012).

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Ces résultats suggèrent que l’augmentation de l’excrétion de cholestérol via la bile est principalement due à la part de thé vert de notre mélange de thé.

La diminution des triglycérides par le thé, quand à elle, s’explique par une diminution de la lipogenèse dans les hépatocytes en culture primaire et chez le rat par down-régulation de certains gènes codant pour des protéines clés impliquées dans ce processus, à savoir SREBP1c et FAS. La diminution de la lipogenèse hépatique par une baisse de l'expression de la synthèse protéique des enzymes clés de la lipogenèse avait été rapportée suite à la consommation du thé vert ou noir chez la souris (Axling et al., 2012) et chez le rat (Lin et al., 2009, 2007; Liu et al., 2015). Dans notre étude, il serait cependant nécessaire d’évaluer les taux protéiques des enzymes de la lipogenèse afin d’être sûr que notre thé a bien un impact supposé sur leur synthèse.

La régulation de la lipogenèse hépatique est décrite comme étant principalement liée à l’obésité viscérale associée à une insulino-résistance périphérique induisant une lipolyse accrue du tissu adipeux qui conduit à une augmentation de la libération d’acides gras dans le plasma (Leto and Saltiel, 2012). Dans notre étude, le régime hyperlipidique et riche en saccharose (HFS) a permis d'induire une obésité viscérale ainsi qu'une insulino-résistance et une augmentation du taux d'acides gras libres plasmatiques chez nos rats. Certaines études ont mis en évidence une action bénéfique du thé vert et de l'EGCG seule sur le métabolisme glucidique favorisant l'insulino-sensibilité et par conséquent la diminution de la stéatose hépatique. En effet, une étude réalisée chez la souris a montré que la supplémentation dans la nourriture d’un extrait de thé vert lyophilisé (4 g/100 g nourriture) permettait de diminuer l’insulino-résistance en parallèle d’une atténuation de la stéatose et des lésions hépatiques (Axling et al., 2012). Des résultats similaires ont également été obtenus par la supplémentation dans la nourriture de la molécule seule d’EGCG (0,32 g/100 nourriture) chez la souris (Sae-Tan et al., 2011). Dans notre étude, le traitement consistait en la consommation d’une infusion d'un mélange de thé vert-oolong-pu-erh sous forme de boisson pendant 14 semaines. Ces conditions, proches d'une consommation humaine, n'ont pas permis d'observer d'effet sur l'accumulation de tissu adipeux ni sur l'insulino-résistance induites par le régime HFS. La dose administrée est effectivement un point critique puisque dans les deux études relatant des effets bénefiques sur l’insulino-résistance, les doses quotidiennes administrées par gramme de masse corporelle étaient plus élevées (6,7 mg d'extrait de thé vert et 0,5 mg d'EGCG pure) en comparaison à la dose administrée dans notre étude (0,6 mg de thé).

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De façon cohérente, l’augmentation des acides gras plasmatiques due à l'insulino-résistance induite par le régime HFS n’a pas été corrigée par le thé au cours de notre expérimentation animale. Dans notre étude, la diminution de la lipogenèse hépatique par le thé n'est donc pas due à une amélioration de l'insulino-résistance périphérique.

Un autre mécanisme pouvant expliquer la diminution des lipides hépatiques par le thé est l'augmentation de la β-oxydation des acides gras dans le foie. En effet, des études chez le rongeur ont montré que la consommation de thé vert ou noir permettait d’augmenter la β-oxydation des acides gras en augmentant l'expression des gènes PPar-α, Acox et Cpt-1 (Abe et al., 2009; Chen et al., 2009; Li et al., 2006; Murase et al., 2002). Dans notre étude en revanche, nos résultats in vivo ne montrent pas de modulation de l’expression de PPar-α ni d’Acox par le thé. A noter que dans l'étude de Chen et al. (2009), l'augmentation de la β-oxydation n'était pas accompagnée d'une diminution du taux de triglycérides hépatiques. De plus, dans ces différentes études, les régimes alimentaires étaient moins riches en lipides (entre 5 et 15 g de lipides/100 g de nourriture) que dans notre étude (35,8 g de lipides /100g d'énergie), ceci pouvant expliquer le fait que nous n’observons pas d’augmentation de l’expression d’Acox et de PPar-α dans notre étude animale. En effet, dans une étude réalisée chez des souris soumises à un régime enrichi à 32 g de lipides pour 100 g de nourriture (proche de notre étude animale), la consommation de thé pu-erh n'entraine pas d'augmentation de l'expression de PPar-α (Shimamura et al., 2013).

L’ensemble de nos résultats prouve que le thé régule les gènes du métabolisme lipidique, en particulier diminue l’expression des gènes impliqués dans la lipogenèse hépatique et stimule l’élimination biliaire du cholestérol, favorisant ainsi la diminution du taux de lipides hépatiques et permettant l’atténuation de la stéatose. De plus, l’insulino-résistance et l’obésité viscérale n’étant pas diminuées et la β-oxydation pas augmentée par la consommation de thé dans notre étude, il apparait que la diminution de la lipogenèse hépatique soit régulée via d’autres mécanismes qui restent à élucider.

Effets antioxydants et hépato-protecteurs du thé

La NAFLD est également caractérisée par une augmentation du stress oxydant dans les hépatocytes décrit comme consécutif à l’augmentation des lipides intracellulaires. Le thé, et plus particulièrement ses polyphénols, ont largement été étudiés pour leurs propriétés antioxydantes (Frei and Higdon, 2003; Rietveld and Wiseman, 2003).

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De plus, il apparait, au travers des études expérimentales et cliniques, que la consommation de thé est bénéfique pour les pathologies impliquant une augmentation du stress oxydant tels que les maladies neurodégénératives (Weinreb et al., 2004), le cancer (Lambert, 2013), les maladies cardiovasculaires (Stangl et al., 2006) et la NAFLD (Imai and Nakachi, 1995).

Un second axe de ce travail de thèse a donc été de mesurer les effets antioxydants et hépato-protecteurs du thé. Pour cela, nous avons tout d’abord évalué les effets d’un pré-traitement de thé sur des hépatocytes de rat en culture primaire exposés au t-BHP, un puissant inducteur de stress oxydant. Le t-BHP est connu pour augmenter le stress oxydant et provoquer la mort cellulaire par stimulation de la production de ROS au sein de la cellule (Kučera et al., 2014), ce que nous avons effectivement observé. Ces deux phénomènes ont été enrayés par un pré-traitement avec notre extrait de thé mettant en évidence des effets hépato-protecteurs via les propriétés antioxydantes des constituants qui le composent. Ces résultats sont en accord avec une précédente étude, elle aussi réalisée in vitro, soulignant l’impact bénéfique de l’acide gallique et des polyphénols de thé sur la viabilité des hépatocytes humains exposés à de l’hydrogène peroxyde (Li et al., 2010).

En parallèle de la surproduction de ROS, nous avons montré que le t-BHP entrainait une dysfonction mitochondriale caractérisée par une diminution de l’intégrité du potentiel membranaire mitochondrial (par mesure indirecte). Il a de plus été rapporté que la diminution du potentiel mitochondrial associé à une forte augmentation de ROS intracellulaires conduisait au déclenchement des voies de signalisation apoptotiques mitochondriales et à la mort cellulaire (Vander Heiden et al., 1997) pouvant ainsi expliquer la mortalité induite par le

t-BHP. Nous avons pu observer que cette perturbation de la fonction mitochondriale induite par le t-BHP était prévenue par un pré-traitement d’extrait de thé. Nos résultats révèlent donc l’impact bénéfique du thé sur la fonction mitochondriale et contribuent à renforcer de précédents travaux montrant que les polyphénols de thé sont de bons candidats pour protéger la fonction mitochondriale en diminuant notamment le déclin du potentiel membranaire mitochondrial (Forbes-Hernández et al., 2014; Jimenez-Lopez and Cederbaum, 2004) et en améliorant les performances de la chaîne respiratoire (Kucera et al., 2015). Nos résultats suggèrent également que les effets hépato-protecteurs du thé sont dus à l’effet bénéfique sur la fonction mitochondriale empêchant la cascade d’évènements apoptotiques comme décrit pour un autre type de thé (Bhattacharya et al., 2011).

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De ce fait, il serait intéressant d'évaluer de manière plus approfondie la fonction mitochondriale en déterminant par exemple l'activité de la chaine respiratoire, la capacité de phosphorylation, la production d'ATP, la quantité d'ADN mitochondrial afin d'appréhender en détails l'impact du thé sur la mitochondrie.

De manière concordante, les résultats de l’étude animale ont permis de mettre en évidence, par la mesure de la peroxydation lipidique, que la consommation de thé diminuait de manière significative le stress oxydant induit par le régime HFS. Comparativement à d’autres études qui montrent que le thé permet d’augmenter les défenses antioxydantes du foie expliquant cette baisse de stress oxydant (Park et al., 2012, 2011), notre étude ne permet pas d’établir cette relation car les capacités antioxydantes hépatiques très réduites chez nos rats HFS ne sont pas améliorées par l’administration du thé. En revanche, les capacités antioxydantes plasmatiques des rats HFS+Thé sont plus élevées par comparaison avec les rats HFS et contrôle suggérant l’existence d’un effet antioxydant systémique du thé pouvant bénéfier au foie comme aux autres organes.

Effets anti-lipogenèse hépatique du thé par son activité antioxydante

De manière très intéressante, nos résultats ont montré une forte corrélation entre la quantité de lipides et le stress oxydant dans le foie. En se basant sur la théorie des "two hits", il était logique que la diminution des lipides hépatiques soit accompagnée d’une diminution de ce stress. Cependant, bien que de nombreuses études aient rapporté des résultats corroborant le modèle des "two hits" dans le développement de la NAFLD (Angulo, 2002; Browning and Horton, 2004), de récents travaux nuancent l'implication de la stéatose hépatique dans l'initiation de la pathogenèse et suggèrent un rôle causal du stress oxydant (Polimeni et al., 2015; Serviddio et al., 2013; Tilg and Moschen, 2010). De ce fait et comme la diminution de la lipogenèse hépatique observée au cours de notre étude animale n’était pas due à une amélioration de l’insulino-résistance périphérique ni à une diminution de l’obésité viscérale, nous nous sommes intéressés à l’impact du stress oxydant sur l’accumulation des lipides hépatiques. Nous avons observé que le stress oxydant marqué par une augmentation d’O2

-induite par le t-BHP, entrainait une augmentation du taux de lipides dans des hépatocytes isolés de rats (rats nourris avant prélèvement du tissu via une alimentation classique). Ces résultats sont en accord avec de précédentes études qui avaient rapporté que la déplétion de la SOD, enzyme antioxydante responsable de la biotransformation de l’O2^- en H2O2, chez un modèle de souris SOD^-/- favorisait l’augmentation de l’O2^- dans la cellule et par la même

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entrainait une hausse du taux de lipides dans les hépatocytes isolés (Lee et al., 2015) et in vivo dans le foie (Wang et al., 2012) en augmentant entre autre la synthèse de la protéine SREBP1c. Par contre, la déplétion de la GPx, enzyme responsable de la détoxification de H2O2 en H2O, chez un modèle de souris GPx^-/-, ne favorisait pas l’accumulation de lipides intracellulaires suggérant que seule l’augmentation de l’O2^- pouvait augmenter la lipogenèse hépatique (Wang et al., 2012). Cependant, les taux d’O2^- et de H2O2 n’ayant pas été évalués dans cette étude, il est possible que l’H2O2 ait été détoxifié par la catalase n’entrainant donc pas d’augmentation du stress oxydant. Il a d’ailleurs été mis en évidence que le H₂O₂ pouvait induire l’accumulation de lipides dans une lignée cancéreuse d’hépatocytes humain (HepG2) en augmentant la synthèse du facteur de transcription SREBP1c et des protéines FAS et ACC impliquées dans la lipogenèse (Sekiya et al., 2008). L’implication des signaux redox dans la régulation du métabolisme lipidique a d'ailleurs fait l’objet d’une récente revue mettant en évidence l’activation de certains gènes clés de la lipogenèse hépatique (Srebp1, PPar-α,

PPar-γ) par différents facteurs pro-oxydants (H2O2, HNE, mROS) (Serviddio et al., 2013). Partant du fait que le stress oxydant pouvait favoriser la synthèse des lipides dans le foie, nous avons testé l’effet d’une molécule antioxydante, le Tempol, en parallèle d’un stress provoqué par le t-BHP. Nos résultats prouvent que l’effet antioxydant du Tempol prévient à la fois l’augmentation d’O2^- et l’augmentation des lipides dans les hépatocytes mettant en évidence le lien entre stress oxydant et lipogenèse hépatique. De plus, une forte corrélation positive a été observée entre le stress oxydant et les lipides dans les hépatocytes isolés en culture primaire renforçant à la fois nos résultats in vivo et le lien entre métabolismes redox et lipidique. Nous avons finalement testé l’impact du thé sur les hépatocytes soumis à un stress et de la même manière que le Tempol, le thé a permis de prévenir l’accumulation de lipides induite par le stress oxydant.

Au regard de l’ensemble de nos résultats, il semble que le thé par une action antioxydante prévient la lipogenèse hépatique induite par une augmentation du stress oxydant dans les hépatocytes. De plus, parmi les différentes origines de stress oxydant au cours de la NAFLD, de nombreuses études tendent à faire penser que le dénominateur commun sont les dysfonctions mitochondriales (Browning and Horton, 2004; Rector et al., 2010; Tariq et al., 2014). Une récente étude réalisée chez le rat fait notamment état d'une dérégulation redox, en