Analyses biochimiques

4.1.1. Profil lipidique plasmatique

La mesure des taux de triglycérides, de LDL, de HDL et de cholestérol total plasmatiques a été effectuée en utilisant les kits enzymatiques (TRIGL Réf 20767107 322, LDL-C Réf 03038866 322, HDL-C plus 3rd generation Réf 04713109 190 et CHOL2 Rèf 03039773, respectivement) du fournisseur Roche (Indianapolis, USA) à l’aide de l’appareil de mesure Cobas 6000 (Roche). Le taux d’acides gras non-estérifiés a été mesuré en utilisant le kit Randox (Randox Laboratories, Royaume-Unis).

4.1.2. Mesure de la capacité antioxydante globale plasmatique

La capacité antioxydante globale du plasma a été mesurée en utilisant le kit OxiSelect™ TAC (Total Antioxidant Capacity) de Cell BioLabs (USA). Le test TAC est basé sur la réduction du cuivre Cu2+ au cuivre Cu+ par des antioxydants tels que l'acide urique. Après réduction, le Cu⁺ réagit avec un réactif chromogène qui produit une couleur avec une absorbance à 490 nm. Les valeurs d'absorbance nette d'antioxydants ont été comparées à une courbe standard d’acide urique. Les valeurs d'absorbance sont proportionnelles à la capacité antioxydante globale de l'échantillon. Les résultats ont été exprimés en "mM équivalents d'acide urique".

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4.2. Analyses hépatiques

4.2.1. Dosages des lipides hépatiques

Les quantités des différents lipides contenus dans les échantillons de foie (triglycérides, cholestérol total, acides gras non-estérifiés) ont été mesurées après extraction des lipides totaux au préalable, à l’aide de tests classiques colorimètriques. L’extraction et le dosage des lipides hépatiques ont été réalisés au sein du CRMBM UMR CNRS 7339 à Marseille sous la supervision de Martine Armand.

Extraction des lipides totaux

L’extraction des lipides du foie a été réalisée par la méthode de Folch modifiée par Hernell (Hernell et al., 1990). Pour cela, les échantillons de foie ont été pesés, broyés et homogénéisés dans du PBS à l’aide d’un broyeur-homogénéiseur (Polytron). Brièvement, 20 volumes d’une solution de chloroforme/méthanol (2:1) ont été ajoutés aux broyats de foie et le tout a été homogénéisé pendant 1 minute avec le Polytron. Ensuite, 20 % d’une solution de chlorure de sodium 150 mM/2% acide acétique à pH 3.0 ont été ajouté. La solution obtenue a été vortexée puis centrifugée à 2000 rpm pendant 20 minutes à 20°C. La phase chloroformique inférieure contennant les lipides a été récupérée puis séchée sous azote afin d’obtenir un culot lipidique sec.

Dosage des lipides

Afin d’effectuer les dosages des différents lipides présents dans le foie, les culots des lipides totaux extraits par la méthode Folch/Hernell ont été remis en suspension avec de l’isopropanol comme précédemment utilisé (Garcia et al., 2014). Le dosage de la quantité de triglycérides et de cholestérol total a été effectué en utilisant les kits enzymatiques colorimétriques PAP 150 et chol RTU du fournisseur Biomérieux (Lyon, France), respectivement. Le dosage des acides gras non-estérifiés a été réalisé à l’aide du kit enzymatique colorimétrique Randox (Randox Laboratories, Royaume-Unis).

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4.2.2. Analyses de l'expression des gènes du métabolisme lipidique

L’expression des gènes du métabolisme des lipides au niveau hépatique a été analysée par PCR quantitative en temps réel (qPCR). Pour cela, les ARN totaux d’échantillons de foie ont été extraits afin de réaliser une transcription inverse permettant d’obtenir des ADN complémentaires qui ont ensuite servi à réaliser la qPCR.

Extraction des ARN totaux

L’extraction a été effectuée à partir de 30 mg de foie pesés et broyés en utilisant du Qiazol Lysing reagent (Qiagen, Allemagne). Après la lyse, 100 µL de solution permettant d'éliminer l'ADN génomique (gDNA eliminator solution) ont été ajoutés dans chaque tube contenant les broyats de foie afin de détruire l'ADN génomique présent dans l'échantillon. Ensuite, 180 µL de chloroforme ont été ajoutés et les échantillons ont été centrifugés à 12000g pendant 15 minutes à 4°C. Une fois la centrifugation terminée, la phase aqueuse supérieure a été prélevée et transférée dans un tube eppendorf de 2 mL. L'extraction a ensuite été réalisée à l'aide du Kit RNeasy MiniSpin^® (Qiagen, Allemagne). Les ARN obtenus après extraction ont été quantifiés en mesurant l'absorbance à l'aide d'un nanodrop à 260 nm, et la pureté de ces ARN a été évaluée en utilisant le rapport des absorbances mesurées à 260 et 280 nm. Une PCR de contrôle a également été effectuée sur chaque échantillon d’ARN afin de vérifier l'absence de tout ADN génomique pour ne pas fausser, par la suite, les résultats de qPCR.

Transcription inverse

La transcription inverse (RT) consiste à synthétiser de l'ADN à partir d'une matrice d'ARN, appelé ADN complémentaire (ADNc), en utilisant l'enzyme rétrovirale, la transcriptase inverse. Les ARN ont été dilués dans de l'eau ultra pure sans RNase afin d'obtenir 1,6 µg d'ARN dans un volume de 8 µL auxquels sont ajoutés 1 µl de Random Primer. Le mélange a été ensuite chauffé à 70°C pendant 5 minutes puis placé sur la glace pendant 5 minutes. Un mélange de réactifs nécessaire à la réaction (Mix RT) a alors été préparé :

Mix RT Pour 1 échantillon (µL)

Tampon 5X 4

MgCl2 3,8

PCR nucleotide mix 1

Rnase inhibitor 0,5

Goscript reverse transcriptase 1

Eau ultra pure 0,7

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11 µL de mix RT a alors été ajouté dans chaque tube d'ARN. Les tubes sont ensuite incubés à 25°C pendant 10 minutes, puis à 42°C pendant 1h et enfin à 70°C pendant 15 minutes. Les solutions d'ADNc obtenues sont ensuite diluées au 1/3(20 µl + 40 µl d'eau ultra pure) et les échantillons sont conservés à -80°C jusqu'à utilisation. Une PCR de contrôle a également été effectuée sur chaque échantillon d’ADNc afin de vérifier la présence d’ADNc pour chaque échantillon.

PCR quantitative en temps réel

Cette technique, selon le même principe qu'une PCR classique, permet l'amplification mais également la quantification de la séquence de l'ADN cible via l'utilisation d'un fluorochrome, le SYBR Green, ayant la propriété de se lier à l’ADN double brin et de n'être fluorescent que sous sa forme liée. Au début de l’amplification, le mélange réactionnel contient l’ADN dénaturé, les amorces et le fluorochrome non lié. Pendant l’étape d’élongation, le nombre de SYBR Green liés à l’ADN synthétisé augmente entraînant une augmentation de la fluorescence mesurée à la fin de chaque cycle en utilisant un thermocycleur en temps réel. Une courbe représentant la fluorescence en fonction du nombre de cycles est ainsi obtenue.

L’amplification des solutions d’ADNc a été réalisée en suivant les instructions du kit RT² Profiler™ PCR Arrays (Qiagen, Allemagne). Ce kit était composé de 12 plaques 96 puits contenant chacune un couple d’amorces par puits pour neuf gènes d’intérêt et un gène référence (RPL17), plus deux contrôles internes (contrôle de détection d’ADN génomique (RGDC, Rat Genomic DNA contamination, Réf U26919) et un contrôle positif de PCR (PPC, Positive PCR control, Réf SA00103) permettant de tester 8 échantillons différents selon le schéma de plaque suivant Figure 20 :

9 gènes d’intérêt 1 gène réf 2 ctrl

Echantillon 1 Echantillon 2 Echantillon 3 Echantillon 4 Echantillon 5 Echantillon 6 Echantillon 7 Echantillon 8 Mix qPCR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Réf RGDCPPC

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Les solutions d’ADNc obtenues après la RT ont été mixées avec une solution de SYBR Green et de l’eau ultra pure (Mix qPCR) et 25 µL de mix ont été déposés dans chaque puits des plaques de qPCR Array.

Mix qPCR Pour 1 puit (µL)

SYBR Green 12,5

Eau ultra pure 11,5

ADNc 1

Total 25

Les plaques ont été ensuite placées dans l’appareil Lightcycler 480 (Roche, Allemagne) afin de lancer le programme d’amplification suivant (45 cycles) :

Cycles Durée Température

1 10 min 95°C

45 15 s

1 min

95°C 60°C

L’analyse des résultats de qPCR a été réalisée à l’aide du logiciel LightCycler^® 480 v1.5.1.

4.2.3. Mesure de la capacité antioxydante globale du foie

La capacité antioxydante globale du foie a été évaluée à l’aide du kit Antioxidant Assay de Sigma Chemical Co. (Réf CS0790, St Louis, MO, USA). Le principe de ce test est la formation du radical myoglobine à partir de la metmyoglobine et du peroxyde d’hydrogène (H2O2). La myoglobine va ensuite réagir et oxyder l’ABTS (2,2'-azino-bis (acide 3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) pour produire le radical ABTS^• de couleur verte qui peut être déterminée par spectrophotométrie à 405 nm. Les antioxydants présents dans la solution empêchent la production du radical ABTS^• et la couleur verte est donc inversement proportionnelle à la quantité d’antioxydants présents dans la solution. Une gamme standard de Trolox, antioxydant soluble analogue de la vitamine E, a été utilisée comme référence et les résultats ont été exprimés en "mM équivalents Trolox".

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4.2.4. Mesure de la peroxydation lipidique hépatique

La peroxydation lipidique a été évaluée à l’aide du kit QuantiChrom Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) de BioAssay Systems (USA). Ce test repose sur la réactivité d’un produit terminal de la peroxydation lipidique, le malondialdéhyde (MDA) avec l’acide thiobarbiturique générant une substance de couleur rouge qui peut être mesurée par spectrophotométrie à 540 nm. Une gamme standard de MDA a été utilisée comme référence et les résultats sont exprimés en "µg/mg de foie équivalents MDA".