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(Camellia sinensis)
Laura Braud
To cite this version:
Laura Braud. Effets lipotropes des molécules antioxydantes du thé (Camellia sinensis). Alimentation et Nutrition. Université de Toulon, 2015. Français. �NNT : 2015TOUL0014�. �tel-01405340�
UNIVERSITÉ DE TOULON
ÉCOLE DOCTORALE 548
T
HÈSE
Présentée par :
Laura BRAUD
Soutenue le : 7 décembre 2015
Pour obtenir le grade de
Docteur en Science de la vie et de la santé
Spécialité : Physiologie
Effets lipotropes des molécules
antioxydantes du thé (Camellia sinensis)
Membres du jury :
Pr. Christophe MOINARD PU, Université de Grenoble Rapporteur Pr. Franck PAGANELLI PU-PH, Hôpital Nord, Marseille Rapporteur Dr. Anthony FARDET CR INRA, Clermont-Ferrand Examinateur Dr. Georges DE SOUSA CR INRA, Sophia-Antipolis Examinateur Pr. Jean-Michel MAIXENT PU, Université de Toulon Directeur de thèse Pr. Joël GRILLASCA PU, Université de Toulon Co-directeur de thèse Dr. Martine ARMAND CR INSERM, CNRS, Marseille Membre invité M. Jean-Marc ZEIL PDG Thés de la Pagode, Paris Membre invité
Remerciements
Je tiens à remercier le Professeur Christophe Moinard et le Professeur Franck Paganelli d'avoir accepté d'être rapporteurs de mon mémoire de thèse.
Je tiens également à témoigner ma reconnaissance au Docteur Anthony Fardet et au Docteur Georges de Sousa d'avoir accepté de lire et d'évaluer mon travail.
Je remercie le Professeur Jean-Michel Maixent pour m'avoir permis d'effectuer cette thèse et le Professeur Joël Grillasca pour m'avoir accueillie au sein de l’équipe EB2M.
Je souhaite remercier chaleureusement le Docteur Martine Armand pour son aide substantielle et ses conseils tout au long de ce projet de thèse. Tu as été bien plus qu'une marraine de thèse au cours de ces trois années de doctorat (jusqu’à la correction de mon mémoire !), pour ton aide indéfectible, je te suis très reconnaissante.
Je remercie Monsieur Jean-Marc Zeil pour m’avoir ouvert les portes de son entreprise et pour la confiance qu'il m'a accordée tout au long de ce projet.
Je tiens à exprimer ma gratitude,
Aux membres du laboratoire Toxalim de l'INRA Sophia-Antipolis dirigé par le Professeur Roger Rahmani pour m'avoir permis d'effectuer les travaux sur modèle cellulaire dans votre laboratoire.
À Roger Rahmani pour m’avoir accueillie au sein de son équipe et pour son soutien sur le projet cellulaire.
À Georges de Sousa pour sa grande disponibilité et son aide en culture cellulaire. À Ludovic Peyre pour son aide, ses conseils et sa rigueur.
Je souhaite remercier,
Les membres du laboratoire Pharm-Ecologie Cardiovasculaire de l’Université d’Avignon dirigé par le Professeur Agnès Vinet pour m'avoir permis d'effectuer les travaux sur modèle animal dans votre laboratoire.
Agnès Vinet de m’avoir accueillie au sein de son équipe.
Un grand merci à Cyril Reboul et Grégory Meyer pour leur aide et leurs conseils pendant l'année (et demie) passée à leur coté à Avignon. Malgrè toutes vos responsabilités et vos autres thésards, merci de m'avoir aidée, conseillée, corrigée, expliquée et caféinée !
Sandrine Gayrard pour les bons moments passés au labo sur les airs de Nostalgie.
Catherine Riva pour sa sympathie, sa disponibilité et son aide pour réaliser les coupes histologiques.
Stéphane Nottin pour sa bonne humeur et sa grande maison !
Guillaume Walther pour sa gentillesse et pour son soutien à l’équipe de basket des vétérans du laboratoire LAPEC !
Merci à tous les doctorants du laboratoire LAPEC, Cindy, Julien, Saloua, Alessandro, Thomas, Claire, Adrien, Omar, Christopher pour leur amitié et les supers moments passés ensemble au labo et en dehors !
Je remercie très amicalement,
Les membres du laboratoire PROTEE et en particulier Marie-Christine Davy pour m’avoir aidé à gérer la partie financière de cette thèse.
Les membres de l’équipe EB2M du laboratoire PROTEE de l’Université de Toulon dirigé par le Docteur Nathalie Prévot pour m'avoir permis d'effectuer ma thèse dans votre laboratoire. Nathalie Prévot, merci de ta gentillesse et de ton aide précieuse dans les méandres administratifs de l’Université !
Simone Richard pour sa diplomatie et sa grande sagesse.
Stéphane Coupé, merci de m’avoir fait philosopher, débattre et beaucoup rire !
Merci infiniment à Sandrine Gaillard, merci pour toute l’aide que tu m’as apporté, pour ton écoute sans faille, ton soutien, ton sourire inépuisable, tu as été pour moi un modèle de force et de droiture durant cette thèse.
Rémy Simide, mon camarade de thèse, avec qui j’ai partagé les joies et les tourmentes de la thèse. Tu as été bien plus qu’un collègue, tu es devenu un ami, merci pour ton soutien, ton écoute et les tours de campus pour s’aérer l’esprit !
Sylvain Couvray, merci pour tous les bons moments de détente et merci de nous rappeler à tous que la pression se boit mais ne se subit pas !
Marine Fidèle, pour ton appétit débordant pour le travail et la nourriture ! Sonia Bernage, pour ton enthousiasme et les gros gateaux de ton mari !
Merci également à mes amis extérieurs au labo,
Á Séverine, mon amie charentaise exilée comme moi dans une contrée lointaine et plus ensoleillée, merci pour ton amitié, ton réconfort et tes encouragements.
Á Béné, Romu, Julien, Clément et Morgane, merci pour tous les bons moments partagés.
Je tiens également remercier ma famille,
Ma sœur, mon beau-frère et ma petite nièce que je vois bien trop rarement, merci de votre soutien et de me rappeler les choses plus essentielles de la vie.
Mes parents qui m’ont toujours soutenue quelque soit mes choix et qui m’ont toujours encouragée, merci d’être là pour moi.
Mon chéri, qui a vécu tous les moments de cette thèse à mes cotés. Tu as toujours été là pour moi, tu m’as soutenue, encouragée, tu as été fier de moi et tes encouragements et ton amour m’ont permis d’aller au bout de cette thèse.
Publications et Communications
Publications
Effect of Brewing Duration on the Antioxidant and Hepatoprotective Abilities of Tea Phenolic and Alkaloid Compounds in a t-BHP Oxidative Stress-Induced Rat Hepatocyte Model
Braud, L., Peyre, L., de Sousa, G., Armand, M., Rahmani, R., and Maixent, J.-M.
Molecules, 2015, 20(8): 14985–15002, doi:10.3390/molecules200814985
Antioxidant molecules of tea (Camellia sinensis) decrease hepatic lipogenesis and steatosis in a high fat-sucrose diet NAFLD rat model
Braud, L., Battault, S., Meyer, G., Nascimento, A., Gaillard S., de Sousa, G., Rahmnani R., Riva, C., Armand, M., Maixent, J-M., Reboul, C.
Article en cours de préparation pour soumission dans Free Radical Biology and Medicine
Communications affichées
Antioxidant and protective effects of a pu-erh tea extract (Camellia sinensis) on primary cultured rat cells
Braud, L., Peyre, L., de Sousa, G., Rahmani, R., and Maixent, J.-M.
Printemps de la Cardiologie, 2 et 3 avril 2015, Toulouse, France
Hao Ling pu-erh tea attenuates lipid accumulation in primary culture rat hepatocytes Braud, L., Peyre, L., de Sousa, G., Zeil, JM., Rahmani, R., and Maixent, J.-M.
Table des matières
Liste des abréviations ...1
Liste des figures ...2
Liste des tableaux ...3
AVANT-PROPOS ...4
REVUE DE LITTÉRATURE ...8
I. SYNDROME MÉTABOLIQUE ET NAFLD ...9
1. Syndrome métabolique ...9
1.1.Définition et critères d'évaluation ...9
1.2.Prévalence ... 11
2. NAFLD : manifestation hépatique du syndrome métabolique ... 12
2.1.Le foie : généralités ... 12
2.2.Définition et critères d'évaluation de la NAFLD ... 14
2.3.Prévalence et mortalité ... 16
II. PHYSIOPATHOLOGIE DE LA NAFLD ... 17
1. Accumulation de lipides hépatiques "First hit" de la pathogenèse de la NAFLD 17 1.1.Métabolisme lipidique hépatique en conditions physiologiques ... 18
1.1.1.Origine exogène des lipides du foie ... 19
1.1.2.Origine endogène des lipides du foie ... 21
Synthèse des acides gras et des triglycérides hépatiques ... 21
Synthèse de cholestérol hépatique ... 23
Synthèse des lipoprotéines ... 23
1.1.3.Régulations des voies métaboliques lipidiques ... 24
Régulation transcriptionnelle ... 24
Régulation hormonale... 28
1.2.Dérégulations du métabolisme lipidique hépatique et NAFLD ... 30
1.2.1.Augmentation de la lipogenèse hépatique ... 30
Régimes alimentaires ... 30
Insulino-résistance périphérique et lipolyse accrue du tissu adipeux ... 31
Hyperglycémie et hyperinsulinémie ... 32
1.2.2.Diminution de la béta-oxydation des acides gras dans le foie ... 33
1.2.3.Diminution de la sécrétion des VLDL par le foie ... 33
1.2.4.Dyslipidémies associées aux NAFLD ... 34
2. Stress oxydant, dysfonctions mitochondriales et inflammation "Second hit" de la pathogenèse de la NAFLD ... 37
2.1.Signalisation redox ... 37
2.1.1.Les espèces oxygénées réactives ou ROS (Reactive Oxygen Species) ... 37
Productions endogènes ... 38
Productions exogènes ... 39
2.1.3.Les défenses antioxydantes ... 39
2.1.4.Stress oxydant et cibles des ROS ... 40
2.2.Stress oxydant et NAFLD ... 42
2.2.1.Causes du stress oxydant au cours de la NAFLD ... 42
Dysfonctions mitochondriales ... 42 Cytochrome P450 2E1 ... 43 2.2.2.Conséquences hépatiques ... 43 Peroxydation lipidique ... 43 Inflammation ... 44 Fibrose ... 44
2.3.Autres causes de l'inflammation hépatique ... 44
2.3.1.Adipokines et inflammation adipocytaire ... 44
2.3.2.Microbiote intestinal ... 45
3. Stratégies nutritionnelles de lutte contre la NAFLD... 47
III. THÉ ET NAFLD ... 51
1. Camellia sinensis ... 51
1.1.Processus de fabrication ... 51
1.2.Composés du thé ... 52
1.3.Devenir des composés phénoliques de thé dans l’organisme ... 55
1.3.1.Absorption intestinale ... 55
1.3.2.Métabolisme et élimination... 56
1.3.3.Concentration plasmatique... 56
1.3.4.Concentration hépatique ... 57
2. Effets bénéfiques du thé sur la NAFLD ... 59
2.1.Effets hépatiques ... 59
2.1.1.Diminution de la stéatose hépatique ... 59
2.1.2.Diminution du processus de stress oxydant et des lésions hépatiques ... 62
2.2.Effets périphériques ... 63
2.2.1.Effets au niveau intestinal ... 63
2.2.2.Effets au niveau de l’adipocyte ... 64
2.2.3.Effets au niveau du muscle squelettique ... 65
2.2.4.Diminution de la dyslipidémie associée à la NAFLD ... 65
3. Etudes épidémiologiques et interventionnelles ... 72
OBJECTIFS DU TRAVAIL ... 74
MATÉRIEL ET MÉTHODE ... 77
I. PRODUIT UTILISÉ :THÉ HAO LING® ... 78
2. Préparation des extraits aqueux de thé ... 78
3. Détermination de la composition chimique des extraits de thé ... 79
3.1.Mesure de la quantité en polyphénols ... 79
3.2.Analyse de la composition en catéchines, acide gallique et caféine ... 79
4. Evaluation de la capacité antioxydante des extraits de thé ... 80
II. APPROCHE SUR MODÈLE CELLULAIRE ... 82
1. Modèle expérimental : Hépatocytes de rat en culture primaire ... 82
1.1.Isolement des hépatocytes de rat ... 82
1.2.Ensemencement des cellules ... 82
2. Protocoles expérimentaux ... 83
2.1.Protocole n°1 – Effets des extraits aqueux de thé sur les lipides intracellulaires hépatiques ... 83
2.2.Protocole n°2 – Capacité antioxydante et hépatoprotectrice des extraits aqueux de thé ... 84
2.3.Protocole n°3 – Impact du stress oxydant sur l'accumulation de lipides hépatiques et effets des extraits de thé ... 84
3. Tests réalisés ... 85
3.1.Mesures de la viabilité cellulaire ... 85
3.1.1.Test MTT ... 85
3.1.2.Test rouge neutre ... 85
3.1.3.Mesure de l'impédance cellulaire ... 86
3.2.Mesures par microscopie à fluorescence ... 87
3.2.1.Mesures de l'accumulation de lipides intracellulaires – Test LipidTox ... 87
3.2.2.Evaluation de la production d'anion superoxide (O2-) – Test MitoSox ... 87
3.2.3.Evaluation du potentiel membranaire mitochondrial – Test TMRE ... 88
III. APPROCHE SUR UN MODÈLE DE RAT NAFLD ... 90
1. Modèle expérimental : Rats Wistar nourris avec un régime hypercalorique ... 90
2. Mesures longitudinales ... 92
2.1.Mesure du poids, de la prise alimentaire et de la boisson ... 92
2.2.Homéostasie du glucose ... 92
2.2.1.Test d'insulino-tolérance ... 93
2.2.2.Test de tolérance au glucose ... 93
3. Sacrifice des animaux et prélèvements des organes ... 94
4. Analyses biochimiques ... 94
4.1.Analyses plasmatiques ... 94
4.1.1.Profil lipidique plasmatique ... 94
4.2.Analyses hépatiques ... 95
4.2.1.Dosages des lipides hépatiques ... 95
Extraction des lipides totaux ... 95
Dosage des lipides ... 95
4.2.2.Analyses de l'expression des gènes du métabolisme lipidique ... 96
Extraction des ARN totaux ... 96
Transcription inverse ... 96
PCR quantitative en temps réel ... 97
4.2.3.Mesure de la capacité antioxydante globale du foie ... 98
4.2.4.Mesure de la peroxydation lipidique hépatique ... 99
5. Analyses statistiques ... 99
RÉSULTATS ... 100
I. APPROCHE CELLULAIRE ... 101
1. Étude n°1 : Effets des extraits aqueux de thé sur les lipides hépatiques ... 101
1.1.Rappel de l’intérêt de l’étude n°1 ... 101
1.2.Résultats et discussion ... 102
2. Étude n°2 : Capacité antioxydante et hépatoprotectrice des extraits aqueux de thé ... 104
2.1.Rappel de l’intérêt de l’étude n°2 ... 104
2.2.Résultats majeurs de l’étude n°2 ... 105
2.3.Article n°1 ... 105
II. APPROCHE SUR UN MODÈLE DE RAT NAFLD ... 125
1. Étude animale : Effets d'une infusion aqueuse de thé sur la NAFLD chez le rat Wistar modèle de syndrome métabolique ... 125
1.1.Rappel de l’intérêt de l’étude in vivo ... 125
1.2.Résultats majeurs de l’étude in vivo ... 126
1.3.Article n°2 ... 126
2. Résultats additionnels ... 155
DISCUSSION ... 160
CONCLUSION ET PERPECTIVES ... 168
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Liste des abréviations
ABC Transporteurs à ATP Binding
Cassette
ACC Acetyl-CoA carboxylase
ACL Acetyl-CoA lyase
ACOX Acetyl-CoA oxydase
ACS Acetyl-CoA synthase
ADNmt ADN mitochondrial
AG Acide gras
AGL Acide gras libre
ALT Alanine transaminase
AMPc AMP cyclique AMPK AMP kinase
Apo Apolipoprotéine
ARNm ARN messager
AST Aspartate transaminase
ATGL Adipose triglyceride lipase C/EBP CCAAT/enhancer-binding protein
CAR Carnitine translocase
CAT Catalase
CE Cholestérol estérifié
CEL Carboxyl ester lipase
CETP Protéine de transfert des esters de cholestérol
ChREBP Carbohydrate responsive element binding protein CL Cholestérol libre CM Chylomicron COX Cyclooxygènase CPT-1 Carnitine palmitoyltransferase I CT Cholestérol total CycloA Cyclosporine A CYP Cytochrome P450
DGAT Diacylglycerol acyltransferase
DHA Acide docosahexaénoïque
EC Epicatéchine
ECG Epicatéchine gallate
EGC Epigallocatéchine
EGCG Epigallocatéchine gallate
EPA Acide ecosapentaénoïque
ETC Chaine de transfert d’électron
FABPpm Protéine de transport des acides gras de la membrane plasmique
FAS Acide gras synthase
FATP Protéine de transport des acides gras
G3P Glycérol-3-phosphate
GAPDH Glycéraldéhyde 3 phosphate déshydrogénase
GK Glucokinase
GLUT4 Transporteur de glucose
GPx Glutathione peroxydase
GR Glutathione reductase
GSH Glutathion forme réduite
GSSH Glutathion forme oxydée H2O2 Peroxyde d'hydrogène
HDL Lipoprotéine de haute densité
HFS Régime riche en lipides et en
saccharose
HL Lipase hépatique
HMGR HMG-CoA réductase 4-HNE 4-Hydroxynonénal 4-HHE 4- Hydroxyhexenal
HOCl Acide hypochloreux
HOMA-IR Indice de résistance à l’insuline
HSL Lipase hormono-sensible
IDL Lipoprotéine de densité intermédiaire IL6, IL1 Interleuline 6,1
IMC Indice de masse corporelle
INSIG Gène de la protéine induite par l’insuline
IR Insulino-résistance
IMR Image à résonnance magnétique
ITT Test de tolérance à l'insuline LCAT Lécithine-cholestérol acyltransférase
LDH Lactate déshydrogènase
LDL Lipoprotéine de faible densité
LDLr Récepteur LDL
LOX Lipoxygénase
L-PK Pyruvate kinase hépatique
LPL Lipoprotéine lipase
LPS Lipopolysaccharide
LRP Protéine liée aux LDL
LXR Récepteur nucléaire des oxystérols
MDA Malondialdéhyde
MGAT Monoacylglycérol acyltransférase
MGL Monoglycéride lipase
MPO Miéloperoxydase
MTP Protéine microsomale de transfert
des triglycérides
NAFLD Stéatose hépatique non-alcoolique NASH Stéatohépatite non-alcoolique NEFA Acides gras non-estérifiés NF-κB Facteur nucléaire kappa B
NO Monoxyde d'azote
NOX NADPH oxydase
O2 Anion superoxyde
OGTT Test de tolérance au glucose
OH Radical hydroxyl
OMS Organisation mondiale de la santé
ONOO Peroxynitrite
PDH Pyruvate déshydrogénase
PKA Protéine kinase A
PL Phospholipides
PPar Récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes
RCT Transport inverse du cholestérol
RE Réticulum endoplasmique
ROO Radical peroxyle
ROS Espèces réactives de l’oxygène
RXR Récepteur X de rétinoïdes
SCAP Protéine de clivage SREBP
SOD Superoxyde dismutase
SR-B1 Récepteur scavenger B1
SREBP Sterol responsive element-binding protein
t-BHP Hydroperoxyde de tert-butyl
TG Triglycérides
TNF-α Facteur de nécrose tumorale
UCP Protéine découplante
VLDL Lipoprotéine de très faible densité
XO Xanthine oxydase
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Liste des figures
Partie Revue de littératureFigure 1. Syndrome métabolique et maladies cardiovasculaires ... 10
Figure 2. Organisation structurale du foie ... 13
Figure 3. Développement et progression de la NAFLD selon la théorie des "two hits" ... 17
Figure 4. Origine et transport des lipides hépatiques ... 18
Figure 5. Digestion et absorption intestinales des lipides alimentaires ... 20
Figure 6. Régulation des principales voies métaboliques énergétiques dans l’hépatocyte ... 29
Figure 7. Principales étapes du développement de la stéatose hépatique "First hit"... 36
Figure 8. Voies de production des ROS, défenses antioxydantes et dommages du stress oxydant ... 41
Figure 9. Principales étapes du développement de la stéatohépatite "Second hit" ... 46
Figure 10. Processus de fermentation des différents types de thés ... 51
Figure 11. Classification des polyphénols ... 52
Figure 12. Structures des principales molécules des thés non fermentés et fermentés ... 53
Figure 13. Principaux composés des thés vert et noir ... 54
Figure 14. Métabolisme et biodisponibilité des polyphénols de thé dans l'organisme ... 58
Figure 15. Effets du thé sur la NAFLD ... 71
Partie Matériel et Méthode Figure 16. Caractérisation du produit utilisé ... 81
Figure 17. Hépatocytes de rat en culture primaire (Objectif x40) ... 83
Figure 18. Protocoles expérimentaux et expérimentations des études cellulaires ... 89
Figure 19. Protocole expérimental et expérimentations de l'étude animale ... 91
Figure 20. Schéma de plaque qPCR array ... 97
Partie Résultats Figure 21. Le thé diminue l’accumulation de lipides dans les hépatocytes isolés de rat ... 102
Figure 22. Les composés de l’extrait aqueux de thé modifient l’expression de certains gènes impliqués dans la lipogenèse et dans la β-oxydation dans les hépatocytes isolés de rat ... 103
Figure 23. Effet du thé sur les facteurs de risque du syndrome métabolique chez des rats Wistar. ... 157
Figure 24. Effet du thé sur le profil lipidique hépatique ... 158
Figure 25. Effet du thé sur l’expression des gènes du métabolisme lipidique ... 159
L’ensemble des figures a été réalisé par Laura BRAUD à partir de la banque d’images non-annotées Servier pour certaines d’entre elles (http://www.servier.fr/smart/banque-dimages-powerpoint)
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Liste des tableaux
Tableau 1. Critères d’évaluation du syndrome métabolique ...9 Tableau 2. Système de notation du stade de progression de la NAFLD établi par le réseau de recherche clinique sur les NASH (adapté de Kleiner et al. 2005) ... 15 Tableau 3. Facteurs de transcription et voies métaboliques ... 27 Tableau 4. Études animales des effets du thé sur la NAFLD (description des études en Tableau 5) ... 67 Tableau 5. Description des études animales étudiées ... 68 Tableau 6. Composition en polyphénols totaux, catéchines et acide gallique de l’infusion de thé ... 91 Tableau 7. Composition des régimes alimentaires ... 92
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Page 5
elon l'Organisation Mondiale de la Santé, la prévalence de l'obésité est en constante augmentation et a plus que doublé entre 1980 et 2014. Alors que l’obésité était un problème de santé touchant principalement les pays industrialisés, on observe désormais une globalisation du phénomène qui touche près d'un tiers de la population mondiale et constitue un enjeu primordial de santé publique. L’obésité représente en effet un facteur de risque important dans le développement du diabète de type II et des maladies cardiovasculaires. Par conséquent, la prévalence du syndrome métabolique, caractérisé par une obésité viscérale associée à plusieurs facteurs de risque cardiovasculaire tels que l’insulino-résistance, l’hyperglycémie et la dyslipidémie, est en constante augmentation elle aussi.
Au-delà de ces facteurs de risque reconnus et pris en compte dans le diagnostic du syndrome métabolique, la stéatose hépatique non-alcoolique ou NAFLD (Non-alcoholic Fatty Liver Disease) représente à l’heure actuelle la maladie hépatique la plus fréquente dans les pays industrialisés. Ayant été reconnue comme fortement associée aux facteurs de risque du syndrome métabolique, elle est désormais considérée comme la "manifestation hépatique du syndrome métabolique" (Vernon et al., 2011). Le terme NAFLD regroupe un large spectre d’atteintes hépatiques n’ayant pas pour origine une consommation excessive d’alcool. La forme la moins avancée est la stéatose hépatique simple caractérisée par une accumulation excessive de lipides dans le foie. La stéatose peut alors progresser en stéatohépatite non-alcoolique ou NASH (non-alcoholic steatohepatitis) caractérisée par une augmentation du stress oxydant et de l’inflammation conduisant à des lésions hépatiques. Enfin, la NASH peut évoluer en cirrhose et ultimement en une forme cancéreuse, l'hépatocarcinome. Le modèle actuellement reconnu pour décrire le développement de la NAFLD a été proposé il y a une vingtaine d’année par Christopher Day et Oliver James (Day and James, 1998). Dans ce modèle, le développement de la pathologie est décrit en deux étapes principales : une première étape d’accumulation des lipides dans le foie considérée comme un pré-requis pour les dérégulations sous-jacentes qui mènent à l’augmentation du stress oxydant, à la peroxydation lipidique et enfin à des lésions hépatiques constituant la deuxième étape de ce modèle. Cependant, les mécanismes à l’origine de la pathogenèse de la NAFLD restent encore à clarifier et suscitent de nombreuses controverses (Polimeni et al., 2015; Rector et al., 2010; Serviddio et al., 2013; Tilg and Moschen, 2010).
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En effet, plusieurs questions restent en suspend comme par exemple, est ce que le développement de la NAFLD consiste d’abord réellement en une augmentation des lipides hépatiques puis ensuite apparaît l’installation d’un stress oxydant avec état inflammatoire fort, ou est ce que le développement de la NAFLD nécessite la présence de tous ces facteurs en même temps ?
L’origine multifactorielle de la pathologie rend donc difficile son appréhension et de ce fait sa prise en charge. A l’heure actuelle, il n’existe d’ailleurs aucun traitement spécifique pour la NAFLD. Ces pathologies étant étroitement liées aux facteurs de risque des maladies cardiovasculaires (insulino-résistance, dyslipidémies, inflammation), les seuls traitements proposés visent à traiter un de ces facteurs (antidiabétiques, hypolipidémiants, antioxydants tel que la vitamine E principalement) mais ne sont pas spécifiques de la pathologie en elle-même, et les résultats obtenus sont très hétérogènes (Le and Loomba, 2012).
Par ailleurs, de plus en plus d’études s’intéressent au rôle de la NAFLD dans le développement des pathologies cardiovasculaires et dans la survenue de ses facteurs de risque. En effet, si l’insulino-résistance est reconnue comme étant à l’origine de la NAFLD, le rôle de la NAFLD dans la survenue de la dyslipidémie associée suscite des interrogations (Gaggini et al., 2013). Une très récente étude réalisée chez des patients atteints de NASH a montré que l’atténuation des lésions hépatiques, à l’aide d’un traitement de pioglitazone (anti-diabétique) ou de vitamine E (antioxydant), permettait de réduire deux des facteurs de risque importants des maladies cardiovasculaires en diminuant l’hypertriglycéridémie et en augmentant le taux de HDL plasmatique (Corey et al., 2015). Dans ce cas, il est légitime de se demander si la NAFLD constitue à lui seul un facteur de risque des maladies cardiovasculaires, et si leur prise en charge peut être intéressante pour diminuer ce risque. Autant de questions qui sont à l’heure actuelle au cœur du débat sur la NAFLD (Targher et al., 2008; Vanni et al., 2010) et qui nécessitent de plus amples investigations expérimentales et cliniques.
Dans ce contexte, il apparaît important de comprendre les mécanismes à l’origine des dérégulations hépatiques, à la fois lipidique et redox, au cours de la NAFLD et de définir des stratégies thérapeutiques ciblées et adaptées.
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Le thé est la deuxième boisson la plus consommée au monde après l’eau. Il provient d’une plante originaire de Chine, Camellia sinensis, à partir de laquelle sont cueillies les feuilles de thé. Des études épidémiologiques ont rapporté un effet bénéfique du thé pour lutter contre les désordres hépatiques (Imai and Nakachi, 1995; Kuriyama, 2008) et les facteurs de risques cardiovasculaires notamment la dyslipidémie (Nakachi et al., 2000).
Il est effectivement rapporté que le thé possède des propriétés hypolipidémiantes et permet d’atténuer la stéatose hépatique chez des patients atteints de NAFLD (Ruhl and Everhart, 2005; Sakata et al., 2013). De plus, le thé possède des propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires permettant de lutter contre le stress oxydant notamment impliqué dans la NAFLD (Park et al., 2011). La consommation de thé semble donc constituer une approche nutritionnelle prometteuse pour lutter contre le développement de la NAFLD et des facteurs de risque associés telle que la dyslipidémie. Cependant, les mécanismes par lesquels le thé atténue la stéatose hépatique et la dyslipidémie associée ne sont pas encore clairement élucidés.
Ce mémoire de thèse est composé de cinq parties. La première partie aborde l’ensemble des données bibliographiques relatives au sujet de thèse. Cette revue de littérature définit tout d’abord le syndrome métabolique associé à la NAFLD. Ensuite, la physiopathologie de la
NAFLD est décrite en expliquant dans un premier temps le développement de la stéatose
hépatique (accumulation de lipides hépatiques, « First hit ») et dans un second temps l’augmentation du stress oxydant et des lésions hépatiques (« Second hit »). Enfin, les effets
bénéfiques du thé sur la NAFLD sont détaillés. La deuxième partie de ce mémoire développe
les objectifs du travail de thèse basés sur la revue de littérature. La troisième partie décrit le matériel et méthodes utilisés afin de répondre aux objectifs fixés. La quatrième partie expose les résultats obtenus et ayant donnés lieu à des publications scientifiques. Enfin, la dernière partie propose une discussion générale des résultats obtenus et dresse les perspectives potentielles soulevées par ce projet.
Page 8
REVUE DE
LITTÉRATURE
Page 9
I.
S
YNDROME
M
ÉTABOLIQUE ET
NAFLD
1.
Syndrome métabolique
1.1.
Définition et critères d'évaluation
Le syndrome métabolique, encore appelé syndrome X ou syndrome d'insulino-résistance, désigne un état pour lequel sont présents différents facteurs de risque pouvant conduire au diabète de type II, aux maladies cardiovasculaires de façon générale, et à un accident vasculaire cérébral de façon plus spécifique (Alberti et al., 2006). Ce syndrome est en constante progression du fait de l’augmentation de la prévalence de l’obésité. Parmi les nombreux critères d'évaluation permettant de définir une personne atteinte du syndrome métabolique, deux classifications prévalent : celle de l’Organisation mondiale de la Santé (OMS) (Alberti and Zimmet, 1998) et celle du National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III (NCEP ATP III) (Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults, 2001)(Tableau 1).
Tableau 1. Critères d’évaluation du syndrome métabolique
Critères d’évaluation chez l’adulte selon l’OMS (1999)
Critères d’évaluation chez l’adulte selon le NCEPATP III (2001)
Anomalies de la régulation du glucose et/ouInsulino-résistance associée à au moins 2 des facteurs de
risque suivants
Au moins 3 des facteurs de risque suivants
Glycémie Hyperglycémie à jeûn > 110 mg/dL, intolérance au glucose ou Diabète de type II Hyperglycémie à jeûn > 110 mg/dL, intolérance au glucose ou Diabète de type II Obésité
Indice de masse corporelle > 30 kg/m2
et/ou
Rapport taille/hanche > 0,9 (Homme), > 0,85 (Femme)
Tour de taille > 102 cm (Homme), > 88 cm (Femme) Hypertension ≥ 140/90 mmHgou traitement antihypertenseur ≥ 130/85 mmHg ou traitement antihypertenseur Dyslipidémie Triglycérides ≥ 1,5 g/L et/ou HDL cholestérol < 0,35 g/L (Homme), < 0,39 g/L (Femme) Triglycérides ≥ 1,5 g/L et/ou HDL cholestérol < 0,4 g/L (Homme), < 0,5 g/L (Femme) Albuminurie ≥ 20 µg/min ou Rapport albumine/créatine ≥ 30 mg/g Non incluse Facteurs de risque Critères
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Parmi ces critères, quatre principaux facteurs de risque prédominent pour diagnostiquer le statut de syndrome métabolique : une obésité abdominale, une hypertension, une hyperglycémie chronique conduisant à une insulino-résistance, et une dyslipidémie (Figure 1). Un état pro-inflammatoire est aussi généralement présent chez les personnes atteintes de syndrome métabolique et est identifié par des niveaux élevés de la protéine C-réactive (CRP), de l’inhibiteur de l'activateur du plasminogène 1 (PAI-1), du Facteur de nécrose tumorale α (TNF-α) et de cytokines pro-inflammatoires telles que les interleukines IL-1 et IL-6 (Dandona et al., 2005) (Figure 1). L'association de l’ensemble de ces facteurs entraîne une augmentation du risque de survenue de maladies cardiovasculaires. En effet, les personnes atteintes du syndrome métabolique sont exposées à un risque trois fois plus élevé de subir un infarctus du myocarde, un accident vasculaire cérébral et d’autres pathologies cardiaques, et ont un risque deux fois plus élevé d'en mourir, par rapport à des personnes non atteintes du syndrome métabolique (Grundy et al., 2005).
Hypertension >130/85 mmHg Hyperglycémie Insulino-résistance Glycémie à jeun >1,1 g/l Maladies cardiovasculaires
Insuffisance cardiaque, arythmie, infarctus, Accidents vasculaires cérébral, maladies périphériques artérielles
Dyslipidémie TG >1,5 g/l HDL < 0,5 g/l Syndrome métabolique Etat pro-inflammatoire CRP, PAI-1, TNF-α, IL-1, IL-6 Obésité abdominale Tour de taille 102 cm (Homme), 88 cm (Femme), IMC 30 kg/m2
Figure 1. Syndrome métabolique et maladies cardiovasculaires
CRP: protéine C-réactive; CT: Cholestérol total; HDL: Lipoprotéine de haute densité; IL6, IL1: Interleukine 6, 1; IMC : Indice de masse corporelle; LDL: Lipoprotéine de faible densité; PAI-1: inhibiteur de l'activateur du plasminogène 1; TG: Triglycérides; TNFα: Facteur de nécrose tumorale α.
Page 11
1.2.
Prévalence
La prévalence du syndrome métabolique est difficile à évaluer du fait de la non-harmonisation des critères d'évaluation clinique, des populations ethniques concernées, de l'âge et de l'année de l'étude. Aux Etats-Unis, une étude basée sur les critères du NCEP ATP III montre une prévalence de 30 % de la population, avec une incidence de 7 % pour les 20-29 ans qui augmente jusqu’à 44 % pour les 60-69 ans (Ford et al., 2002). Parmi les adolescents américains (entre 12 et 19 ans), la prévalence du syndrome métabolique est estimée à 10% et augmente à 30% chez les adolescents en surpoids ou obèses (Ferranti et al., 2004). En France, l’étude DESIR (Data Epidemiological Study on the Insulin Resistance syndrome) publiée en 2003 et également basée sur les critères du NCEP ATP III, estime une prévalence du syndrome métabolique à 16 % chez les hommes et 11 % chez les femmes (Balkau et al., 2003).
L'obésité et le diabète de type II sont les deux principaux acteurs du développement du syndrome métabolique. Selon les données de l'OMS, la prévalence de l'obésité a doublé depuis 1980. En 2014, plus de 1,9 milliard d’adultes (18 ans et plus) étaient en surpoids. Sur ce total, plus de 600 millions étaient obèses. Le surpoids et l'obésité concernaient près de 42 millions d’enfants de moins de 5 ans en 2013. En 2014, la prévalence mondiale du diabète, dont 90% de diabète de type 2, était estimée à 9% chez les adultes âgés de 18 ans et plus. Ainsi, l'augmentation de la prévalence de ces deux facteurs explique l'augmentation de la prévalence du syndrome métabolique.
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2.
NAFLD : manifestation hépatique du syndrome métabolique
2.1.
Le foie : généralités
Le foie est un organe annexe du système digestif qui assure trois fonctions principales : stockage/redistribution, synthèse et épuration. A l’issue du processus de digestion/absorption, le foie reçoit différents nutriments provenant de l’alimentation directement de l’intestin grêle via la veine porte (acides aminés, glucose, vitamines hydrosolubles) ou via la circulation générale en période postprandiale (lipides et vitamines liposolubles), et est capable de les stocker et/ou de les redistribuer sous forme de molécules modifiées ou plus complexes, si nécessaire, aux autres organes. Il participe ainsi activement aux métabolismes des protéines, des glucides, des lipides, et de certaines vitamines. Le foie est également un organe de détoxification et assure la biotransformation de nombreux xénobiotiques en vue de leur élimination (par voie urinaire ou biliaire). Enfin, le foie synthétise la bile qui est déversée dans les canalicules biliaires et stockée dans la vésicule biliaire, et qui sera ensuite libérée dans l'intestin grêle et participera à la digestion/absorption des lipides (Desvergne et al., 2006).
Le foie est l’organe abdominal le plus imposant du corps humain et pèse en moyenne 1,5 kg, ce qui représente environ 2% de la masse corporelle. Cet organe est très vascularisé, principalement par l’artère hépatique (apport d’oxygène) et par la veine porte (apport de nutriments issus de l’absorption intestinale) (Figure 2). Le retour veineux est assuré par les veines hépatiques.
Le foie est constitué à 80 % d’hépatocytes et 20% d’autres types cellulaires (cellules des canaux biliaires, cellules endothéliales, cellules de Küpffer, cellules immunitaires). Les cellules hépatiques sont regroupées en lobules hépatiques, eux-mêmes assemblés grâce à du tissu conjonctif. Au centre de chaque lobule se trouve une veine centrolobulaire et sa limite hexagonale est définie par des espaces portes rassemblant les branches de l'artère biliaire, de la veine porte et du canal biliaire. Enfin, des sinusoïdes naissent à la périphérie du lobule, cheminent entre les hépatocytes et convergent vers la veine centrolobulaire (Figure 2).
Page 13 Veine centrolobulaire Veine porte Artère hépatique Canal biliaire Foie Vésicule biliaire
Circulation
hépatique
Lobule
hépatique
Coupe
transversale
Sinusoïde Cellule de Küpfer Hépatocyte Branche du canal biliaire Branche de la veine porte Branche de l’artère hépatique Canalicule biliaire Capillaires sinusoïdes Cellule de Küpffer Hépatocytes Fibre de réticuline Hématie Zones lobulaires Canalicule biliaire Espace porte Lobule hépatique 23 Zones lobulaires 1 Veine centrolobulairePage 14
2.2.
Définition et critères d'évaluation de la NAFLD
La stéatose hépatique non-alcoolique ou NAFLD (non-alcoholic fatty liver disease) regroupe un large spectre de maladies du foie allant de la simple stéatose (accumulation de lipides dans les hépatocytes de 5 à 66% du poids total du foie) en progressant vers la stéatohépatite non-alcoolique ou NASH (non-alcoholic steatohepatitis), la fibrose hépatique pouvant entraîner une cirrhose, et finalement l’hépatocarcinome (Willebrords et al., 2015).
Le terme « non-alcoolique » vient du fait que les lésions hépatiques, comparables à celles observées lors d’intoxications alcooliques chroniques (> 20 à 30 g/j chez l’homme, > 20g/j chez la femme), apparaissent en absence de prise significative d’alcool ou d’association à d’autres maladies hépatiques chroniques (virales, toxiques).
A l’heure actuelle, la NAFLD représente les maladies chroniques du foie les plus émergentes (Vernon et al., 2011). De nombreuses études ayant mis en évidence son association avec les facteurs de risque du syndrome métabolique (obésité, insulino-résistance, hypertension, dyslipidémies), la NAFLD est désormais considérée comme la "manifestation hépatique du syndrome métabolique" (Vernon et al., 2011).
Cependant, le diagnostic de la NAFLD n’est pas aisé car, chez la plupart des patients, elle reste asymptomatique jusqu’au développement d’une cirrhose hépatique lorsque les patients souffrent de fatigue ou d’hépatalgie. De plus, les outils de diagnostic de cette pathologie restent très limités. On soupçonne habituellement une NAFLD chez les patients présentant une hypertrophie hépatique à la palpation et présentant des bilans plasmatiques reflétant une souffrance hépatique (rapport alanine transaminase (ALT) / aspartate transaminase (AST) > 1). Néanmoins, le bilan ALT/AST peut être normal chez des patients ayant une stéatohépatite ou encore une cirrhose. Des techniques d’imagerie (IRM, échographie) peuvent également être utilisées pour diagnostiquer la NAFLD sans pour autant pouvoir définir précisément le stade de développement de la pathologie. Pour l’instant, la biopsie du foie reste la méthode de diagnostic la plus précise pour diagnostiquer et préciser l’état d’avancement d’une NAFLD (Ahmed, 2015).
Afin de déterminer au mieux le stade de progression de la NAFLD, le Comité de pathologie du réseau de recherche clinique sur les NASH a établi un système de notation permettant d’évaluer un large spectre d’atteintes hépatiques de la NAFLD dont le degré de stéatose (pourcentage d'hépatocytes affectés, légère 5-33%, modéré 33-66% et sévère >66%), de fibrose (F2 légère, F3 sévère, F4 répandue dans tout le foie ou stade de cirrhose), d’inflammation et de lésions hépatiques (Kleiner et al., 2005) (Tableau 2).
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Tableau 2. Système de notation du stade de progression de la NAFLD établi par le réseau de recherche
clinique sur les NASH (adapté de Kleiner et al. 2005)
CRITÈRES DÉFINITION SCORE
Stéatose (0-3) Grade <5% 5-33% >33-66% >66% 0 1 2 3 Localisation Zone 3 Zone 1
Pas de zone particulière Panacinaire, panlobulaire 0 1 2 3 Microvésicules Absentes Présentes 01 Fibrose
Zone de fibrose Absente
Périsinusoïdale ou périportale Sévère, zone 3, périsinusoïdale Modérée, zone 3, périsinusoïdale Portale/Périportale Périsinusoïdale et portale/périportale Ponts fibreux Cirrhose 0 1 1 1 1 2 3 4 Inflammation
Inflammation lobulaire Pas de foyer d’inflammation
<2 foyers 2-4 foyers >4 foyers 0 1 2 3
Petits agrégats de macrophages Absents
Présents 01
Lipogranulomas larges Absents
Présents 01
Inflammation portale Absente ou minime
Plus que minime 01
Lésions des hépatocytes
Ballonisation Absents
Quelques cellules ballonnées Beaucoup de ballonnements
0 1 2 Corps acidophiles (cytoplasme condensé
avec ou non disparition du noyau) Absents ou rares Beaucoup 01
Macrophages pigmentés Absents ou rares
Beaucoup 01
Mitochondries gonflées Absentes ou rares
Beaucoup 01
Autres
Corps de Mallorys Absents ou rares
Beaucoup 01
Noyaux glycogénés Absents ou rares
Beaucoup 0 1
DIAGNOSTIC (Grade stéatose + Inflammation lobulaire + Ballonisation)
Pas de NASH 0-2
Stéatose et NASH possible 3-4
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2.3.
Prévalence et mortalité
La prévalence exacte de la NAFLD est inconnue en raison de la difficulté de son diagnostic. Elle a cependant été estimée à environ 30% de la population globale dans les pays industrialisés et oscille entre 65 et 90% pour une population obèse, et une prévalence générale d’environ 3% a été estimée pour la NASH. La mortalité par maladie du foie est d’environ 18% pour les personnes présentant une NASH et 3% pour les patients ayant une simple stéatose non NASH (Vernon et al., 2011).
Page 17
II.
P
HYSIOPATHOLOGIE DE LA
NAFLD
Chez des sujets ayant un syndrome métabolique, la stéatose hépatique non-alcoolique est caractérisée par l'accumulation de lipides dans le foie en raison de la résistance périphérique à l'insuline. L'accumulation de graisse est considérée comme le "first hit" dans la progression de la simple stéatose à la NASH. Les foies stéatosés sont alors plus sensibles à l'oxydation médiée par le stress oxydant ce qui constitue le "second hit" conduisant à la peroxydation des lipides, l'inflammation et aux lésions hépatiques (Day and James, 1998) (Figure 3). Le développement de la NAFLD en deux étapes est désormais bien connu sous le nom de "two hits theory", modèle développé en 1998 par Christopher Day et Oliver James.
Syndrome métabolique Obésité Diabète type II Dyslipidémie NASH Métabolisme lipidique dérégulé ↑ Lipogenèse hépatique ↓ Sécrétion de VLDL ↓ β-oxydation des AG Accumulation de lipides hépatiques (1) "First Hit" Métabolisme Redox dérégulé ↑ ROS ↑ Peroxydation lipidique ↑ Inflammation Etat inflammatoire, nécrose, apoptose (2) "Second Hit" Pathogenèse de la NAFLD
Théorie des « two hits »
Conditions physiologiques (1) Métabolisme lipidique (2) Métabolisme Redox Homéostasie Simple Stéatose Foie sain
Figure 3. Développement et progression de la NAFLD selon la théorie des "two hits"
1.
Accumulation de lipides hépatiques "First hit" de la pathogenèse
de la NAFLD
La première étape dans la progression de la NAFLD est une accumulation de lipides dans les hépatocytes (stéatose hépatique) due à une dérégulation du métabolisme lipidique hépatique. Afin d’appréhender au mieux ces dérégulations, il est nécessaire de connaitre les différentes voies du métabolisme lipidique ainsi que ces mécanismes de régulation en condition physiologique.
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1.1.
Métabolisme lipidique hépatique en conditions physiologiques
Les lipides forment un groupe vaste et hétérogène de molécules d’origine biologique qui ont la caractéristique principale d’être peu ou pas solubles dans l’eau (hydrophobes). On distingue notamment les lipides à base d'acides gras tels que les acides gras libres (AGL), les triglycérides (TG) et les phospholipides (PL) et les lipides à base d'isoprène tel que le cholestérol qui peut être sous forme estérifiée (CE) ou libre (CL). Au niveau hépatique, les lipides sont soit d’origine exogène (lipides alimentaires captés en phase postprandiale) ou soit d’origine endogène (synthèse de novo des AG, AGL provenant du tissu adipeux, cholestérol recyclé des autres tissus), et seront pour la plupart véhiculés vers les différents autres organes sous forme de lipoprotéines via le sang (Figure 4).
VLDL CII B 100 α HDL A1 CM CII E B48
Foie
Intestin
LDL B 100 IDL B 100 Lipides alimentaires LDLr CE TG SR-BI AG LDLr CETP AG Lipides alimentaires (AG, CE, TG, PL) LRP LPL Lipides endogènesVoie exogène
Voie endogène
Capillaires LPL AG Excrétion biliaire β HDL A1 LCAT CL CL A1 pre β HDL CE
Muscle
Tissu adipeux
Tissus périphériques
LPL ABCA1 ABCG1 ABC G5/G8 Transport inverse du cholestérol E B48 Remnants CM CM CII E B48 ATP TG HL
Figure 4. Origine et transport des lipides hépatiques
ABC : Transporteurs ATP Binding Cassette de type A1, G1, G5/G8 ; AG: Acide gras; CE: Cholestérol estérifié ; CETP : Protéine de transfert des esters de cholestérol ; CL: Cholestérol libre ; CM : Chylomicron ; HDL: Lipoprotéine de haute densité; HL: Lipase hépatique ; IDL: Lipoprotéine de densité intermédiaire; LCAT : Lécithine-cholestérol acyltransférase ; LDL: Lipoprotéine de faible densité; LDLr : LDL récepteur ; LPL : Lipoprotéine lipase ; LRP : Récepteur LDL ; PL : Phospholipides ; SR-B1 : Récepteur scavenger B1 ; TG : Triglycérides; VLDL: Lipoprotéine de très faible densité.
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1.1.1. Origine exogène des lipides du foie
Les lipides principalement présents dans l’alimentation humaine sont majoritairement les TG et les PL, et en quantités moindres les AGL et le CE ou le CL. Pour être biodisponibles, les lipides alimentaires (50-150g TG, 2-8 g PL et 0,3-1,5 g CL et CE par jour) doivent être digérés puis absorbés (Figure 5). Pour être optimalement digérés, ils doivent être organisés sous forme de gouttelettes dispersées dans le système aqueux digestif (ou émulsion), ce qui permet la création d’une interface lipides/eau, rendant possible l’action des lipases solubles sur un substrat insoluble (Armand et al., 1996). L’estomac est le premier site important dans la digestion car les lipides y sont organisés (émulsification pour les lipides non structurés, ou ré-arrangement pour les émulsions alimentaires déjà préformées) (Favé et al., 2004), et l’hydrolyse des triglycérides y est amorcée grâce à la lipase gastrique (Armand, 2007). La digestion des lipides se poursuit dans le duodénum grâce à l’action de plusieurs lipases pancréatiques et à la présence de la bile (micelles de sels biliaires/cholestérol/phospholipides) (Armand, 2007). Les différentes molécules issues de la digestion des lipides (AGL, 2-monoglycéride (2-MG), CL, lysoPL) sont ensuite solubilisées sous forme de micelles mixtes biliaires et de liposomes (nanoparticules) et transportées vers l’entérocyte pour leur absorption (Favé et al., 2004). Cette dernière se fait soit par diffusion directe à travers la membrane plasmique de la bordure en brosse des entérocytes (Hamilton, 2007), soit avec l’aide de transporteurs protéiques spécifiques tels que le transporteur CD36 pour les AGL, FABPpm pour les AGL et les 2-MG, le récepteur Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) et le transporteur scavenger de classe B1 (SR-B1) pour le cholestérol (Iqbal and Hussain, 2009). Le système multi-enzymatique FAS (monoacylglycerol acyltransferases –MGAT, diacylglycerol acyltransferases –DGAT) permet ensuite de resynthétiser des TG à partir des 2-MG et d’AGL activés sous forme d’Acyl-CoA (voie du 2-monoacylglycérol). Toutes ces molécules sont ensuite assemblées au niveau du réticulum endoplasmique (RE) sous forme de chylomicrons (CM), classe de lipoprotéine uniquement produite suite à la prise d’un repas. Les CM sont constitués d’un cœur hydrophobe renfermant les TG, le CE et les vitamines liposolubles, stabilisés par une monocouche de phospholipides et de cholestérol libre dans laquelle s’intègrent des protéines spécifiques, appelées apolipoprotéines (ApoB48, ApoCII, ApoE) (Mahley et al., 1984).
Page 20 Lipides alimentaires Intestin Estomac Entérocytes CM B48 Lipase gastrique Micelles mixtes AGL CL lysoPL AGL CL AGL NCP1L1 Diffusion passive CL CE AGL 2-MG TG MGAT DGAT AGL Apo B48 Chylomicrons RE Lymphe CII E lysoPL PL 2-MG 2-MG ABCG5/G8 Lipases pancréatiques Bile Gouttelettes lipidiques CM B48 lysoPL AGL CD36 FABPpm
Figure 5. Digestion et absorption intestinales des lipides alimentaires
ABCG5/G8: Transporteurs à ATP Binding Cassette G5/G8; AGL: Acide gras libre; Apo: Apolipoprotéine; CD36: transporteur des AGL; CL: Cholestérol libre; CM: Chylomicron ; DGAT: Diacylglycérol acyltransferase; FABPpm: Protéine de transport des acides gras de la membrane plasmique; lysoPL: lysophospholipide ; 2-MG: 2-monoglycéride; MGAT: monoacylglycérol acyltransferase; MTP: Protéine microsomale de transfert des triglycérides; NPC1L1: Niemann-Pick C1 protéine Like 1; PL: phospholipide ; RE: Réticulum endoplasmique.
Les CM matures sont alors sécrétés dans la lymphe puis regagnent la circulation générale (Figure 4). Au niveau des muscles et du tissu adipeux, les TG contenus dans les CM sont hydrolysés en AGL et glycérol par la lipoprotéine lipase (LPL) activée par l’ApoCII, et les AGL serviront à la production ou au stockage d’énergie, respectivement. Suite à l’hydrolyse de leurs TG, les CM rétrécissent progressivement pour donner des résidus de chylomicrons (remnants de CM) qui seront finalement captés par le foie, par le biais des récepteurs de l’ApoE (le LRP ou LDL related protein), où leurs constituants seront recyclés pour la production des lipoprotéines hépatiques (Mahley et al., 1984). À noter cependant que les AG à chaînes courtes ou moyennes sont directement transportés de l’entérocyte vers le foie via la veine porte associés à l’albumine.
Page 21
1.1.2. Origine endogène des lipides du foie
Synthèse des acides gras et des triglycérides hépatiques
Au sein des hépatocytes, la lipogenèse hépatique est l’ensemble des voies métaboliques permettant la synthèse des AG et des TG hépatiques. Les TG sont issus de l’estérification de trois AG avec un glycérol-3-phosphate. Les AG utilisés pour la synthèse des triglycérides proviennent soit des AG néosynthétisés à partir du glucose par la voie de la synthèse de novo des AG, soit du pool plasmatique d’AG non estérifiés issus de la lipolyse du tissu adipeux (Figure 6).
La synthèse de novo des acides gras se déroule dans le cytoplasme à partir de l’acétyl-CoA. Celui ci provient du pyruvate formé au cours de la dégradation du glucose. Les cellules captent le glucose dans le sang grâce au transporteur GLUT4 et le métabolisent via la glycolyse. Durant la glycolyse, il se forme du glycérol 3-phosphate (G3P) sous l’action de la glycérol kinase (GK) transformé ensuite en phosphoenolpyruvate sous l’action de la glycérol-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) et enfin en pyruvate sous l'action de la pyruvate kinase hépatique (L-PK, Liver Pyruvate Kinase), enzyme limitante de la glycolyse. Le pyruvate entre alors dans les mitochondries et permet la formation d’acétyl-CoA, sous l’action de la pyruvate déshydrogénase (PDH), qui est transformé en citrate et transféré vers le cytosol. Le citrate est alors retransformé en acétyl-CoA qui va être utilisé pour la synthèse des acides gras sous l’action de l’ATP citrate lyase (ACL). L’acétyl-CoA est alors transformé en acide gras grâce à deux enzymes clés de la lipogenèse, l’acétyl-CoA carboxylase (ACC) et l'acide gras synthase (FAS) (Figure 6). La lipogenèse a lieu principalement dans deux organes, le foie et le tissu adipeux (mise en réserve).
La lipolyse est le processus de dégradation des TG, principalement stockés dans le tissu adipeux, qui conduit à la libération d’AG et de glycérol sous l’action de trois lipases principales : la triglycéride lipase adipocytaire (ATGL), la lipase hormono-sensible (HSL) et la monoglycéride lipase (MGL). Les AG sont ensuite libérés dans la circulation sanguine et captés par le foie (Figure 6).
Dans le foie, les AG captés sont soit stockés sous forme de TG, soit métabolisés via la béta-oxydation (β-béta-oxydation) pour former de l’acétyl-CoA qui entre alors dans le cycle de Krebs pour produire de l’ATP ou permet la production de corps cétoniques via la cétogenèse (Schulz, 1991).
Page 22
La β-oxydation se déroule à la fois dans les mitochondries, les peroxysomes et les microsomes. Les mitochondries catalysent l'oxydation des AG à chaine courte, moyenne et longue et les peroxysomes catalysent l'oxydation des AG à très longues chaines grâce à l'enzyme acétyl-CoA oxydase (ACOX). Les AG à longue chaine sont également oxydés par le cytochrome P450 CYP4A dans les microsomes (M. Sambasiva Rao and Reddy, 2001). Pour la β-oxydation mitochondriale, les AG sont activés, donnant naissance à des acyl-CoA. Ces réactions sont catalysées par plusieurs acyl-CoA synthétases (ACS). Les acyl-CoA ainsi formés sont transportés dans la matrice mitochondriale à l’aide de la carnitine acyltransférase de la membrane mitochondriale externe (CPT-1), la carnitine-acylcarnitine translocase (CACT) et enfin la carnitine acyltransférase de la membrane interne (CPT2), puis sont dégradés par β-oxydation (hélice de Lynen) (Schulz, 1991). Cette réaction fournit de l’acétyl-CoA, utilisée dans le cycle de l’acide citrique (ou cycle de Krebs), et des coenzymes réduites (NADH et FADH2), utilisées dans la chaîne respiratoire pour la production d’ATP (Figure 6). En effet, le
gradient électrochimique de protons H+ entretenu par la chaîne respiratoire active l’ATP synthase et permet la production d’ATP. Ce gradient peut également être utilisé par les Thermogénines (ou Uncoupling Protein UCP) pour fournir de la chaleur. Le rendement énergétique des AG est élevé et fait des lipides une forme de réserve idéale de l’énergie métabolique. Au cours de la β-oxydation, le rapport NAD+/NADH est un régulateur important. Si la chaîne respiratoire n’utilise pas de NADH, le cycle de Krebs et la β-oxydation ralentissent (Serviddio et al., 2013). La vitesse de la β-oxydation est également déterminée par le taux d’entrée des acyl-CoA dans la matrice mitochondriale par l’intermédiaire de CPT-1. Ce taux peut être modifié par le malonyl-CoA qui inhibe CPT-1, favorisant ainsi la lipogenèse (Foster, 2012).
La cétogenèse est, après le cycle de Krebs, la deuxième voie la plus importante d'utilisation de l'acétyl-CoA par les cellules. Lorsque le niveau de glucose intracellulaire baisse, la
néoglucogenèse se déclenche pour produire du glucose à partir de l'oxaloacétate et par
conséquent le cycle de Krebs ralentit. La β-oxydation des AG, uniques substrats énergétiques du foie, provoque l'accumulation d'acétyl-CoA dans les cellules hépatiques. L'acétyl-CoA est alors convertie en corps cétoniques qui sont exportés dans le sang pour être utilisés comme substituts au glucose par les tissus péripériques (Figure 6).
Page 23 Synthèse de cholestérol hépatique
Dans le cytoplasme, la 3-HMG-CoA réductase (HMGR), enzyme clé de la biosynthèse du cholestérol, permet la transformation de l’acétyl-CoA en mévalonate. Le mévalonate donne ensuite naissance au squalène qui sera à son tour cyclisé et transformé en cholestérol. L’HMGR peut être inhibée par son produit direct le mévalonate ainsi que le produit final le cholestérol (Miller et al., 1989) (Figure 6). Une grande partie du cholestérol synthétisé est utilisé pour l’édification des membranes cellulaires. Une autre fraction est transformée en acides biliaires (ou sels biliaires) grâce à la cholesterol 7α-hydroxylase ou cytochrome P450 7A1 (CYP7A1) et est transporté dans les canalicules biliaires via les transporteurs ABCG5/G8 (Desvergne et al., 2006). Le reste servira à la formation des lipoprotéines hépatiques.
Synthèse des lipoprotéines
Hors repas, le foie synthétise des lipoprotéines de très faible densité (VLDL, Very Low Density Lipoprotein) qui permettent le transport des lipides hépatiques (TG, CL, CE, PL, vitamines liposolubles) vers les tissus extrahépatiques (voie endogène, Figure 4). Comme les CM, les VLDL rétrécissent progressivement sous l’action de la LPL et évoluent en lipoprotéines de densité intermédiaire (IDL, Intermediate Density Lipoprotein) puis en lipoprotéines de faible densité (LDL, Low Density Lipoprotein). Les cellules ayant besoin de cholestérol fixent les LDL et captent la particule complète grâce à une endocytose médiée par un récepteur à LDL (LDLr), le reste est collecté par le foie (Mahley et al., 1984). Le foie synthétise également des lipoprotéines de haute densité (HDL, High Density Lipoprotein) qui accumulent le CL en excès formé dans les tissus et le conduisent au foie en vue de son élimination (voie inverse du cholestérol, Figure 4) (Fielding and Fielding, 1995). Ce sont les transporteurs de la famille des ATP-Binding Cassette (ABCA1, ABCG1) qui sont responsables de la sortie cellulaire du CL (Gelissen et al., 2006). Au sein des HDL, le CL est estérifié à l’aide de la lécithine-cholestérol-transférase (LCAT). Grâce à la protéine de transfert du cholestérol (CETP), les HDL peuvent également échanger avec les VLDL du CE contre des TG. Enfin, les HDL matures (riches en CE) sont captées par les hépatocytes grâce au récepteur SR-B1, puis internalisées par endocytose et finalement dégradées. Par ailleurs, quelques cellules de l’organisme, en particulier les macrophages, possèdent également des récepteurs scavengers grâce auxquels ils peuvent fixer les HDL afin de décharger leur contenu (Naik et al., 2006).
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En accumulant le cholestérol provenant des tissus périphériques et en le transférant au foie directement ou par l’intermédiaire des LDL, les HDL participent de façon importante à la diminution du niveau plasmatique de cholestérol (van der Velde and Groen, 2005). Contrairement au cholestérol véhiculé par les LDL (cholestérol-LDL), celui véhiculé par les HDL (cholestérol-HDL) est donc considéré comme étant du « bon cholestérol ».
1.1.3. Régulations des voies métaboliques lipidiques
L'ensemble des voies métaboliques a comme finalité d'assurer qualitativement et quantitativement les besoins indispensables à la vie de l'organisme. Il est donc nécessaire que l'ensemble de ces voies soit finement régulé. Le métabolisme lipidique est contrôlé par différentes voies de régulation allostérique, transcriptionnelle, enzymatique et hormonale. Dans ce mémoire de thèse, nous nous intéresserons uniquement aux régulations transcriptionnelle et hormonale du métabolisme lipidique (Figure 6).
Régulation transcriptionnelle
Plusieurs facteurs de transcription spécifiques de séquence et inductibles sont impliqués dans la régulation de l’expression de gènes impliqués dans le métabolisme des lipides, à savoir SREBPs, ChREBP, PPARs et LXR. Suite à l’interaction avec leurs ligands spécifiques, ils se comportent comme des activateurs du complexe transcriptionnel en se fixant sur des séquences régulatrices spécifiques (dites « élément de réponse spécifique ») en amont du promoteur de leurs gènes cibles déclenchant l’expression du gène (production d’ARNm) (Tableau 3).
Les SREBPs (Sterol regulatory element binding protein) sont des facteurs de transcription qui se lient aux éléments régulateurs des stérols (SRE, Sterol Regulatory Element) sur les régions promotrices des gènes impliqués dans la synthèse d'acides gras et de cholestérol. Il existe trois isoformes de SREBPs (SREBP 1a, 1c et 2) (Shao and Espenshade, 2012).
Les isoformes SREBP1a et SREBP2 sont principalement régulés par la concentration intracellulaire des stérols. La diminution du taux de stérols intracellulaires entraîne la maturation et l’activation des facteurs de transcription SREBP1a et SREBP2 (Shao and Espenshade, 2012). Une fois mature, le facteur de transcription SREBP2 migre vers le noyau où il induit l'expression de LDLr et HMGR conduisant à l'augmentation de l'entrée de cholestérol dans la cellule et l'augmentation de sa synthèse intracellulaire (Miserez et al., 2002).
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L'isoforme SREBP1c est régulé de manière plus spécifique par l'insuline. En effet, des études in vivo et in vitro dans le foie ont montré que l’expression de SREBP1c était très faible quand l’animal était à jeun, et fortement induite s’il était ensuite soumis à un régime hyperglucidique (Foretz et al., 1999; Kim et al., 1998). De plus, dans des hépatocytes de rats en culture primaire, l'insuline stimule la transcription de SREBP1c tandis que le glucagon, via la stimulation de l’AMPc, l’inhibe (Foretz et al., 1999). Enfin, l’expression de SREBP1c est pratiquement nulle dans le foie de rats devenus diabétiques par l’injection de streptozotocine, mais augmente si ces animaux sont traités par l’insuline (Shimomura et al., 1999). Il apparaît donc que l’expression de SREBP1c et les mécanismes de son activation sont directement contrôlés par l’état nutritionnel de l’organisme. La forme mature de SREBP1c induit l'expression des gènes de la glycolyse (GK) et de la lipogenèse (FAS et ACC) (Desvergne et al., 2006). En revanche, SREBP1c est inactivé par la kinase activée par l’AMP (AMPK) (Foretz et al., 2005; Iizuka and Horikawa, 2008; Li et al., 2011). L’AMPK est en effet reconnu comme senseur énergétique cellulaire et activée par phosphorylation lorsque le rapport ATP/AMP diminue. Ainsi, afin de réajuster la balance énergétique cellulaire, l’activation de l’AMPK stimule des voies cataboliques impliquées dans la synthèse d’ATP (oxydation des AG, glycolyse) et inhibe des voies anaboliques ou consommatrices d’ATP telle que la synthèse des AG activée par SREBP1c.
Le ChREBP (Carbohydrate responsive element binding protein) est un facteur de transcription activé par des concentrations élevées de carbohydrates et réprimé par l'AMPc. L'activation de ChREBP par l'augmentation de glucides induit l'expression de gènes impliqués dans le métabolisme du glucose comme la pyruvate kinase hépatique (L-PK), enzyme limitante de la glycolyse, augmentant ainsi l'utilisation du glucose. ChREBP, en synergie avec SREBP1c, permet également l'augmentation des gènes lipogéniques impliqués dans la conversion des produits issus de la glycolyse en AG tels que ACC et FAS (Iizuka et al., 2004; Iizuka and Horikawa, 2008; Uyeda et al., 2002). L'augmentation de glucides induit l'activation du facteur de transcription ChREBP qui entraîne l'augmentation de l'expression des gènes L-PK, ACC et FAS dans des cultures primaires d'hépatocytes de souris. L'importance de ChREBP dans la régulation du métabolisme glucidique et lipidique a également été mis en évidence in
vivo chez la souris (Dentin et al., 2006; Iizuka et al., 2004; Iizuka and Horikawa, 2008) et chez
