I. A PPROCHE CELLULAIRE
1. Étude n°1 : Effets des extraits aqueux de thé sur les lipides hépatiques
1.1. Rappel de l’intérêt de l’étude n°1
La NAFLD est caractérisée par une accumulation de lipides dans les hépatocytes qui a été décrite comme étant la première étape (« first hit ») dans le développement de la pathologie (Day and James, 1998). Les études réalisées chez le rongeur mettent en évidence une diminution de l'accumulation lipidique hépatique et plus particulièrement des triglycérides et du cholestérol suite à la consommation de thé (Axling et al., 2012; Bruno et al., 2008; Li et al., 2006). Cependant, les mécanismes impliqués dans cette baisse des lipides hépatiques sont encore loin d’être élucidés. En effet, il a été montré que le thé permettait de diminuer les gènes impliqués dans la lipogenèse hépatique et d'augmenter ceux impliqués dans la β-oxydation mais les mécanismes précis mis en jeu dans cette régulation ne sont pas clairement décrits. Au niveau cellulaire, plusieurs études se sont penchées sur l’effet lipotrope des catéchines du thé vert et plus particulièrement de l’EGCG (Goto et al., 2012; Kim et al., 2013; Lin et al., 2007) mais peu d’études ont recherché les effets lipotropes d’un extrait global de thé, et encore moins d’un mélange de plusieurs thés.
Dans ce contexte, il était donc nécessaire de s’intéresser dans un premier temps à l’effet d’un extrait de thé Hao Ling sur l’accumulation de lipides intracellulaires. Pour cela, des hépatocytes de rat en culture primaire ont été traités durant 24h avec différentes doses d’extrait de thé (400 et 600 µg/mL), et d’EGCG seul (30 et 100 µM) afin de comparer ses effets à l’extrait de thé global, puis les lipides intracellulaires hépatiques ont été dosés par marquage fluorescent des lipides neutres avec le fluorochrome LipidTox. Afin de déterminer quels pouvaient être certains des mécanismes impliqués dans la diminution des lipides hépatiques par le thé, l’expression de certains gènes de la lipogenèse a été évaluée par PCR quantitative.
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1.2. Résultats et discussion
Les composés d’extrait aqueux de thé diminuent le taux de lipides intracellulaires dans les hépatocytes de rat en culture primaire. Un traitement de 24h avec deux concentrations différentes de composé d’extrait aqueux de thé (400 et 600 µg/mL de milieu de culture) a permis de mettre en évidence une diminution significative des lipides intracellulaires dans les hépatocytes (-51 et -56%) en comparaison avec les hépatocytes non-traités (Figure 21). Le traitement par l’EGCG, principale catéchine présente dans notre extrait de thé, à 30 µM n’a eu aucun effet significatif sur le taux de lipides intracellulaires, en revanche, la plus forte concentration d’EGCG (100 µM) a permis une diminution significative des lipides (-19%) (Figure 21). Cependant, cette baisse est significativement moins importante que celle observée lors du traitement avec l’extrait global de thé aux deux concentrations alors que ces dernières contiennent beaucoup moins d’EGCG (8 et 12 µM, respectivement) (Figure 21). Un mélange global natif d’antioxydants de thé est donc plus efficace.
Hoechst LipidTox Merge Ctrl CycloA 10 µM EGCG 100 µM Thé 600 µg/ml (A) (B)
Figure 21. Le thé diminue l’accumulation de lipides dans les hépatocytes isolés de rat
Les hépatocytes ont été ensemencés en plaque 96 puits puis traités 24 h avec différentes concentrations d’un extrait de thé Hao Ling (400 et 600 µg/mL), d’EGCG pur (30 et 100 µM) ou de cyclosporine A (10 µM, utilisé comme contrôle positif de l’accumulation de lipides intracellulaires). Les cellules ont été marquées avec Hoechst 33342 et LipidTox (A et B) durant 30 minutes avec analyse de la fluorescence à l’aide de l’appareil HCS (High content screening). Les résultats sont exprimés en moyenne ± erreur standard à la moyenne (SEM) (n=3 en triplicat). *p<0.05 comparé au contrôle (cellules non traitées) et #p<0.05 comparé aux cellules traitées au thé.
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Le thé diminue l’expression de gènes impliqués dans la lipogenèse hépatique. Dans un deuxième temps, l’expression de gènes sélectionnés pour leur implication dans la lipogenèse hépatique (facteurs de transcription PPar-γ et Srebp1c, système enzymatique clé Fas) et dans la β-oxydation des acides gras (PPar-α, facteur de transcription impliqué dans la synthèse d’enzymes de la β-oxydation tel qu’Acox) a été évaluée suite à un traitement de 24h avec l’extrait de thé à la dose de 600 µg/mL. Le thé a induit une diminution significative de l’expression de Srebp1c (- 22%) et Fas (- 37%) suggérant que la diminution des lipides intracellulaires provoquée par le thé était due à une diminution de la lipogenèse hépatique (Figure 22). Le thé a également induit une augmentation significative de l’expression de
PPar-α, suggérant que la diminution de lipides intracellulaires pouvait également résulter d’une augmentation de l’utilisation des acides gras via une augmentation de la β-oxydation (Figure 22). Cependant, aucune différence significative n’a été observée entre les cellules non-traitées et les cellules traitées avec le thé pour l’expression de l’Acox, enzyme majeure de la β-oxydation peroxysomale (Figure 22). Pour mieux cerner la régulation de ce processus par le thé, il aurait fallu mesurer l’expression d’autres enzymes de la β-oxydation mitochondriale, telle que CPT-1, voire procéder via une approche par puces à ADN pour regarder les variations d’expression d’un plus grand nombre de gènes. A noter que l’expression de
Srebp1c est aussi diminuée avec la forte dose d'EGCG mais de façon moins prononcée qu’avec le thé global (- 13%).
Figure 22. Les composés de l’extrait aqueux de thé modifient l’expression de certains gènes impliqués
dans la lipogenèse et dans la β-oxydation dans les hépatocytes isolés de rat
Les hépatocytes ont été ensemencés en plaque 96 puits puis traités 24 h avec une concentration d’un extrait de thé Hao Ling (600 µg/mL). L’expression des gènes de la lipogenèse a été évaluée par PCR quantitative. Les résultats sont exprimés en moyenne ± erreur standard à la moyenne (SEM) (n=4-6). *p<0.05 comparé au contrôle (cellules non traitées).
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