Outils analytiques de caractérisation de la matière organique dissoute

3.1.1.1

Dosage du carbone organique dissous

L’échantillon est d’abord acidifié avec 5% en volume d’acide orthophosphorique (H3PO4) à 0,7 mol.L-1 puis conservé à 4°C jusqu’à analyse. L’analyse est effectuée dans un

délai inférieur à une semaine. Le dosage du carbone organique dissous est effectué avec un analyseur de carbone de type TOC-V CSN de la marque Shimadzu. Le principe de la mesure consiste en une oxydation catalytique à haute température (680°C) du carbone organique contenu dans les échantillons filtrés sur des filtres en microfibres de verre (0,7 µm - Whatmann GF/F), acidifiés à pH 2 et purgés avec de l’azote pour éliminer le carbone inorganique. La concentration en carbone organique dissous transformé en CO2 par l’oxydation est alors

déterminée par spectroscopie infrarouge. L’appareil est étalonné à l’aide d’une solution standard d’hydrogénophtalate de potassium C6H4(COOK)(COOH) diluée à différentes

concentrations. La limite de quantification est de 0,5 mgC.L-1 avec une incertitude de 0,3 mgC.L-1 _{dans la gamme de concentrations analysées. Chaque échantillon est analysé en}

triplicata, le résultat final correspond à la moyenne de ces valeurs.

3.1.1.2

Spectroscopie d’absorption UV-visible

L’aromaticité de la matière organique est déterminée par une mesure de l’absorbance à 254 nm. Les mesures d’absorbance UV-visible ont été réalisées à l’aide d’un spectrophotomètre Jasco V-560. Des cuves de 1 cm en quartz ont été utilisées avec un balayage de longueurs d’onde entre 200 et 800 nm. Chaque mesure a été effectuée en triplicata. La normalisation de cette absorbance par la concentration en carbone organique dissous de l’échantillon permet de déterminer le SUVA (specific ultra-violet absorbance) qui est considéré comme un bon indicateur de la présence de structures aromatiques de la MOD (Leenheer and Croué, 2003). Le SUVA s’exprime en m-1.L.mgC-1.

Équation 12

SUVA =Abs_{[COD] . 100}GH

Le pourcentage d’aromaticité peut être obtenu à partir du SUVA suivant l’équation :

Équation 13

Aromaticité (%) = 6,5. SUVA + 6,74

3.1.1.3

Spectroscopie de fluorescence moléculaire

Avant l’analyse en spectrofluorescence, l’absorbance de l’échantillon (254 nm) est mesurée. Si l’absorbance est supérieure à 0,1, l’échantillon est dilué afin de limiter les effets de filtre interne dus à des concentrations trop élevées en fluorophores (Murphy et al., 2010). Les échantillons ont ensuite été analysés en fluorescence dans une cuve en quartz de trajet optique de 1 cm avec un spectrofluorimètre JASCO FP-8300 piloté par un ordinateur à l’aide du logiciel 3D spectra manager. La fluorescence des échantillons a été mesurée aux longueurs d’onde d’excitation de 240 à 450 nm pour un domaine d’émission entre 300 et 600 nm avec une vitesse de 1000 nm.min-1 et un pas de 5 nm. Des blancs ont été réalisés avec de l’eau ultra-pure analysée dans les mêmes conditions que l’échantillon. Pour le calcul des intensités de fluorescence, le spectre des blancs a été soustrait aux spectres des échantillons (mais pas pour

la représentation graphique des spectres 3D). Les spectres des échantillons ont été multipliés par le facteur de dilution.

Les intensités de fluorescence sont exprimées en unités arbitraires normalisées par les concentrations en carbone organique dissous (A.U L.mg.C-1_{). Les intensités de fluorescence}

sélectionnées sont celles des maximums locaux dans les plages de longueurs d’onde d’excitation et émission décrites dans le Tableau 1. En plus de la détermination des différentes pics (α, α’, β et γ), les indices de fluorescence HIX et BIX ont été calculés afin d’avoir des informations sur la maturation de la MOD fluorescente. L’indice HIX est calculé à partir du rapport H/L des deux aires dans les intervalles L (300-345 nm) et H (435-480 nm) à une excitation de 254nm (Ohno, 2002; Zsolnay et al., 1999). Plus les valeurs de HIX sont élevées plus la matière organique est aromatique et de poids moléculaire élevé (Tableau 3). Des valeurs de HIX comprises entre 10 et 16 correspondent à de la matière organique d’origine terrigène, et des valeurs inférieures à 4 sont associées à une matière organique autochtone.

Le BIX est calculé à partir des valeurs mesurées pour une excitation à 310 nm en divisant les valeurs d’émission à 380 nm (maximum de la bande β) par celles à 420 nm (maximum de la bande α). L’indice BIX détermine la présence de fluorophores β et donne des informations sur l’origine et la maturation de la MOD : plus les valeurs du BIX sont élevées, plus la matière est récente et autochtone (Tableau 4). Comme le fluorophore β est lié à l’activité biologique autochtone, l’indice BIX permet de juger de la production de matière organique dissoute due à cette activité. Des valeurs supérieures à 1 correspondent à une production autochtone et des valeurs d’environ 0,6 à 0,7 à une faible production autochtone (Huguet et al., 2009).

3.1.1.4

Fractionnement de la matière organique dissoute selon

l’hydrophobicité

Le protocole de fractionnement de la MOD que nous avons utilisé a été adapté des travaux développés par Malcolm et MacCarthy (1992) et Matar (2012). Il permet de fractionner la matière organique selon son hydrophobicité par passage sur deux résines (DAX-8 et XAD- 4) placées en série. Cette technique de chromatographie permet de quantifier les fractions hydrophobes (HPO), transphiliques (TPI) et hydrophiles (HPI) de la MOD.

Les résines macroporeuses non ioniques DAX-8 Supelite® _{(Supelco) et XAD-4}

Amberlite® (Supelco) ont été utilisées. La DAX-8 est de type ester acrylique avec des pores de diamètre compris entre 20 et 60 Ǻ et une surface spécifique de 160 m2.g-1. La résine XAD-4 est de type styrènedivinylbenzène avec des pores de diamètre de 40 Ǻ et une surface spécifique de 725 m2.g-1. Le protocole de fractionnement sur résines est une technique chromatographique contrôlée par les propriétés physico-chimiques des résines. Dans le cas des résines étudiées, le phénomène d’adsorption est principalement de type physique (forces de Van der Waals).

Avant utilisation, le flaconnage en verre, les colonnes en acrylique et les tuyaux en téflon ont été lavés au détergent (TFD4, 5 %) et rincés abondamment avec de l'eau ultra-pure. Le flaconnage en verre a été grillé pendant 5 h à 500°C.

Les résines sont commercialisées sous forme sèche et doivent donc être conditionnées avant utilisation. Le protocole de conditionnement consiste en deux lavages successifs : le premier lavage est effectué avec la soude (0,1 mol.l-1) pendant une semaine sous agitation. Le second lavage se fait dans un extracteur solide-liquide (soxhlet) avec du dichlorométhane pendant 24 h puis de l’acétonitrile pendant 48 h (Aiken, 1992). Entre chaque cycle de lavage,

les résines ont été rincées une fois à l’eau ultra-pure, sauf pour le dernier cycle pour lequel le rinçage a été poursuivi jusqu’à l’obtention d’un COD inférieur à 0,5 mgC.L-1. Après utilisation, les résines peuvent être reconditionnées pour d’autres utilisations. Entre deux échantillons, un protocole de décontamination des résines est réalisé : deux cycles de lavage à l’acétonitrile/eau (75/25) ont été réalisés, le premier de 1 heure et le deuxième de 12 heures. Comme pour le conditionnement, ce protocole de décontamination des résines se termine par un rinçage à l’eau ultra-pure jusqu’à obtention d’un COD inférieur à 0,5 mgC.L-1_{. Les résines une fois}

conditionnées sont conservées dans un flaconnage en verre ambré dans de l’eau ultra-pure en prenant soin de ne jamais laisser les résines au contact de l’air.

Le montage utilisé pour le fractionnement est constitué de deux colonnes contenant un volume de 10 à 12 ml de résine DAX-8 pour la première et XAD-4 pour la deuxième. Des blancs ont été réalisés en passant de l’eau ultra-pure dans tout le système (tuyaux, et colonnes remplies de résine). Le système a été considéré comme propre et utilisable pour fractionner les échantillons lorsque la concentration en COD dans le blanc est inférieure à 0,5 mgC.L-1.

Après filtration sur un filtre en microfibres de verre (GF/F Whatman) de porosité 0,7 µm et acidification à l’acide chlorhydrique (37%) jusqu’à un pH 2, un volume de 2 litres d’échantillon est injecté à l’aide d’une pompe péristaltique dans les colonnes par un tuyau en téflon à un débit de 10 volumes d’échantillon par volume de résine et par heure (10 v/v/h). Pour 10 mL de résine utilisés ici, le débit a donc été fixé à 1,6mL.min-1 _{(environ 100 mL/h) en}

respectant le facteur de capacité (K’) de 100 (Labanowski, 2004). Ces différentes étapes permettent de séparer les composés de type hydrophobe, qui sont adsorbés sur la résine DAX- 8, des composés hydrophiles non adsorbés sur les résines comme le montre le schéma de la Figure 16. La résine DAX-8 retient les substances humiques tandis que la résine XAD-4 retient les composés transphiliques. Les colonnes sont équipées d’un robinet pour récupérer l’effluent de chaque résine. Les concentrations en COD des effluents de sortie de résine DAX-8 et XAD- 4 sont mesurées afin de quantifier les fractions HPO, TPI et HPI. Les pourcentages des fractions HPO et TPI sont déterminés par mesure de la différence des concentrations en carbone organique dissous entre l’entrée et la sortie des colonnes, respectivement DAX-8 et XAD-4 (Figure 16). Le pourcentage en composés HPI est obtenu par mesure de la concentration en COD de l’échantillon en sortie de résine XAD-4.

Figure 16 : Schéma de fractionnement de la MOD selon l’hydrophobicité. La répartition du COD selon les différentes fractions a été déterminée par analyse du COD grâce aux formules mentionnées dans la figure.