Chapitre II : Concept DiCoFluV : principe et pilote
II.2 Mise en œuvre et contrôle d’une culture de Spiruline
II.2.1 Souche et précultures
La souche utilisée lors de cette étude est Arthrospira platensis PCC 8005 (Institut Pasteur, Paris, France). Cette souche est conservée au laboratoire par repiquages réguliers de culture stériles en erlenmeyers. Le passage de ces petits volumes de conservation au réacteur DiCoFluV (environ 20 litres) se fait par une culture intermédiaire dans un réacteur cylindrique à éclairage extérieur de 5 litres (photobioréacteur 3 dans Cornet (2009)).
II.2.2 Composition du milieu de culture
Concentration (mol.L-1).103 (g.L-1) NaCl 17,1 1 CaCl2 0,27 0,03 K2SO4 5,7 1 MgSO4,7H2O 0,81 0,2 NaNO3 29,4 2,5 K2HPO4 2,9 0,5 NaHCO3 128,0 10,5 Na2CO3 72,0 7,6 EDTA 0,22 0,08 FeSO4,7H2O 0,036 0,01 MnCl2,4H2O 0,0012 0,00023 ZnSO4,7H2O 0,00038 0,00011 1L’humidité est contrôlée en faisant passer le gaz de référence et le gaz de mesure dans des cartouches de Drierite®.
2 Cela signifie que si les conditions de débit, pression et/ou humidité changent l’étalonnage doit être
CuSO4,5H2O 0,00012 0,00003
Tableau 1 : Composition du milieu de culture d’Arthrospira platensis (Cogne et al., 2003b)
Dans toutes les cultures le milieu de culture utilisé est le milieu Zarrouk modifié (Cogne et al., 2003b) dans lequel le carbonate de sodium a été remplacé par un mélange carbonate/bicarbonate de sodium afin d’obtenir un effet tampon pH. La composition du milieu est donnée dans le tableau 1. La composition de ce milieu correspond à la composition d’un milieu naturel d’Arthrospira Platensis. En considérant la stœchiométrie de la photosynthèse donnée au chapitre 1 ce milieu permet d’atteindre une concentration en Spiruline d’environ 4 g.L-1 en réacteur fermé (les carbonates sont alors les éléments limitants). Pour pouvoir atteindre des concentrations supérieures les concentrations du milieu sont augmentées proportionnellement à la concentration visée.
II.2.3 Température et pH
La température dans le réacteur est régulée à 36°C et le pH dans la plage 8 – 10 (voir les détails de la régulation dans la section II.4.2). Dans cette plage on se place préférentiellement à des pH élevés autour de 9,5 pour limiter le développement d’autres microorganismes (il n’est pas possible de stériliser le réacteur).
II.2.4 Mesure de la concentration en biomasse sèche
La concentration en biomasse sèche est la valeur de référence pour quantifier la concentration en biomasse. Elle est déterminée expérimentalement en filtrant un volume donné de suspension de microalgues sur des filtres membranes Millipore dont le diamètre de pores n’excède pas 0,65 microns préalablement séchés (au moins 4 heures à 110°C) et pesés (des diamètres de pores plus importants pourraient être utilisés, les spirulines mesurent environ 6 microns de diamètre et jusqu’à une centaine de microns de long). Les filtres sont ensuite séchés pendant 24 heures dans une étuve à 110°C. La masse sèche ainsi pesée ramenée au volume filtré nous donne la concentration en biomasse sèche de l’échantillon.
La concentration en biomasse sèche est la valeur de référence, mais elle nécessite un délai de 24 heures pour être déterminée, ce qui est trop long pour piloter un photobioréacteur. Nous utilisons donc en complément deux corrélations qui permettent un suivi plus rapide : la densité optique à 750 nm hors ligne et la densité optique en ligne à 620 nm.
II.2.5 Densité optique à 750 nm
La densité optique à 750 nm de chaque échantillon prélevé est mesurée dans un spectrophotomètre (Thermo Scientific Biomate 3S). 750nm est une longueur d’onde qui n’est pas absorbée par les microalgues, l’atténuation du rayonnement dans le spectrophotomètre
n’est donc due qu’à la diffusion par les membranes cellulaires (turbidité), proportionnellement à la concentration en microalgues. Avec les mesures de poids sec nous avons pu établir la corrélation
(II.13)
avec la concentration en biomasse sèche et la densité optique à 750 nanomètres mesurée avec le spectrophotomètre mentionné ci-dessus. Cette corrélation a été établie en diluant les échantillons 4 fois pour déterminer . Comme la lumière est diffusée par les microorganismes, cette corrélation n’est valable que dans ce spectromètre (voir section chapitre 5). Cette corrélation permet d’estimer la concentration en biomasse sèche sans attendre 24 heures.
II.2.6 Densité optique en ligne
Le réacteur est équipé d’une sonde de turbidité OPTEK AS16 qui est un spectrophotomètre immergé dans la suspension de microalgues. Mais contrairement à un spectrophotomètre, la longueur d’onde ne peut pas être réglée sur ce modèle, qui émet à 620 nanomètres. Cette longueur d’onde étant absorbée et diffusée par les microalgues, cette mesure est moins précise que la DO à 750 nanomètres prise sur un échantillon, mais elle a l‘avantage d’être mesurée directement dans le réacteur. De même que pour la DO à 750 nanomètres, nous avons établi la corrélation
(II.14) Cette mesure est assez sensible à l’orientation de la sonde par rapport au flux liquide qui la balaye, la corrélation ci-dessus a été obtenue avec la sonde tournée vers le bas. Elle est également très sensible à des particules en suspension, notamment de polysaccharides (voir II.6.3), qui viennent éventuellement perturber la mesure. Il arrive alors que la mesure soit tellement parasitée qu’elle devient inexploitable. Ces perturbations sont un bon indicateur pour estimer la quantité de polysaccharide formé dans le réacteur (voir II.6.3).
II.2.7 Dosage des carbonates
Le dosage des carbonates permet de s’assurer de l’absence de carence en carbonate. Ce dosage se fait sur un échantillon de microalgues entières, directement prélevées dans le réacteur. Il s’agit d’un dosage double par l’acide chlorhydrique. Le pH de la solution est suivi avec un pHmètre Metler Toledo (boîtier : SevenMulti, sonde : Inlabs Solids Pro) lors de l’ajout d’acide. Le premier saut de pH correspond au titrage du couple il a lieu à pH=8,3 le volume d’acide ajouté est le titre alcalimétrique . Le second saut de pH correspond au titrage du
couple il a lieu à pH compris entre 4 et 4,6 le volume d’acide ajouté est le titre alcalimétrique complet .
La quantité d’ions et contenus dans l’échantillon de départ est donnée par :
(II.15) Avec la normalité de la solution d’HCl servant au titrage et est le volume de l’échantillon de départ.
À pH 9,5, la concentration en carbone inorganique total est maintenue au dessus de (Marty and Gros, 1997).
II.2.8 Détermination des concentrations en nitrates,
phosphates et sulfates
La détermination des concentrations en minéraux (nitrates, sulfates et phosphates) se fait par chromatographie anionique. Connue sous le nom de résine échangeuse d’ions, la chromatographie ionique permet de doser différents ions dans une solution. Pour doser des anions, une colonne chargée positivement est utilisée. L’interaction entre les ions et la résine de la colonne étant différente pour chaque ion, ces derniers seront élués par la phase mobile à des temps différents pour chaque espèce dosée. La détection est réalisée par conductimétrie. Grâce à un étalonnage de l’appareil, il est alors possible d’avoir une évaluation précise de la concentration de chaque ion dans l’échantillon testé.
La chromatographie ionique utilisée pour ces analyses est une 882 Compact IC plus fournie par Metrohm. Les anions sont dosés avec une colonne à résine positive Metrosep A Supp 5, Metrohm. La phase mobile est composée de bicarbonate de sodium à 0,084 g/L et de carbonate de sodium à 0,339 g/L. La boucle d’injection présente un volume de 20 µL, et il est nécessaire d’injecter 1 mL d’échantillon pour une analyse.
Les échantillons doivent être déproténéisés et filtrés sur 0,22 µm avant d’être injectés dans la chromatographie cationique. La déproténéisation est réalisée en ajoutant 50 µL de baryte 0,3 M et 50 µL de sulfate de zinc à 5%, à 4,9mL d’échantillon. L’ensemble est vortexé et centrifugé pendant 5 minutes à 10000 g avant d’être filtré à 0,22 µm.
Cette méthode a été peu utilisée, seulement pour vérifier qu’aucun nutriment n’était épuisé. Cependant pour éviter toute limitation le milieu de culture utilisé présente un large excès en nutriments.
II.2.9 Analyse de la composition des polysaccharides
Le détail des protocoles utilisés pour extraire et caractériser les polysaccharides contenus dans la culture de microalgues est donné à l’annexe 2.