de l'estimer à partir de leur grandissement et de la focale de la lentille de tube. Pour les Olympus celle-ci est généralement de 180 mm (200 mm pour Leica et Nikon, 165 mm pour Zeiss), d'où pour notre objectif (Apoplan, ON=1.45, Olympus) de grandissement gy = 60 une focale de
f = 180/gy = 3mm.
Figure C.3 Mesure de la focale d'un objectif de microscope. En haut : l'image de la mire en A0
1 est renvoyée à l'in ni par l'oculaire. L'observateur peut mesurer un grandissement gy1
en utilisant les graduations de la mire et celles de l'oculaire. En bas : en plaçant une rallonge entre l'objectif et l'oculaire, il faut déplacer l'échantillon pour que son image soit à l'in ni pour l'observateur. La nouvelle position, A0
2, de l'image de la mire par l'objectif donne un nouveau
grandissement gy1.
Nous donnons également ici une méthode pour mesurer cette focale. Celle-ci nécessite une mire graduée, un oculaire et une rallonge (dans notre cas un tube en laiton de dimension connue). Notre objectif est prévu pour faire l'image de l'objet à l'in ni, toutefois il est possible de faire l'image de l'objet, ici la mire, à une distance réelle nie sans que l'image ne soit trop détériorée (en éloignant légèrement la mire de l'objectif). La formule de Newton nous donne la relation du grandissement de l'objectif gy1 avec la focale de l'objectif et la position de l'image
de la mire, A0
1 par rapport au plan focal image de l'objectif, F'(voir gure C.3) :
gy1 =
F0A0 1
En plaçant une rallonge de longueur d entre l'objectif et l'oculaire et en déplaçant la mire pour que son image soit nette pour l'observateur, on a son image par l'objectif, A0
2, telle que
d = A0
1A02. Le nouveau grandissement vaut alors :
gy2 =
F0A0 2
f0 (C.5)
On démontre la relation suivante reliant la focale de l'objectif aux deux grandissements correspondant aux deux positions de l'image de la mire ainsi que la distance d :
f = d
|gy2− gy1| (C.6)
A l'aide de la mire graduée nous avons mesuré sans rallonge gy = 57, 6±0.3 et avec une rallonge (tube de 30.0 mm±0.3 placé entre l'objectif et l'oculaire) gy0 = 67, 5± 0.4 soit donc une focale
Préparation des billes pour la pince
optique
Cette annexe décrit le protocole utilisé pour la préparation des billes et de la surface des chambres micro uidiques pour les expériences en pince optique sur les oligonucléotides.
D.1 Fonctionnalisation des billes
Des billes carboxyles (COOH) en polystyrène de diamètre 0.974µm (Bangs Laboratories, Inc) sont fonctionnalisées avec l'anticorps anti-digoxigénine. Les tampons utilisés sont dispo- nibles chez le même fournisseur que les billes (PolyLink Protein Coupling Kit) et la fonc- tionnalisation est inspirée du protocole fourni avec le kit. La réaction consiste à faire réagir un carbodiimide (EDAC, Sigma) avec la fonction COOH de la bille pour créer un ester actif réagissant avec une fonction amine de l'anti-digoxigénine comme schématisé sur la gure D.1.
B E A D S A B O V E T H E R E S T ™
9025 Technology Dr. •Fishers, IN 46038-2886 800.387.0672 • 317.570.7020 •Fax 317.570.7034
info@bangslabs.com •www.bangslabs.com
Description
Carboxyl (COOH) microparticles can be used for covalent coupling of proteins by activating the carboxyl groups with water-soluble carbodiimide. The carbodiimide reacts with the carboxyl group to create an active ester that is reactive toward primary amines on the protein of interest.
Bangs Laboratories, Inc. offers the PolyLink Protein Coupling Kit for COOH Microspheres for the covalent coupling of proteins to carboxylated microspheres. The procedure that follows has been optimized for polymer microspheres 1µm or larger. The contents of the kit are sufficient for 50 coupling reactions using 200-500µg of protein per reaction. The kit has been optimized using purified IgG as the coupling protein.
Material
Material Supplied
• PolyLink Coupling Buffer (50mM MES, pH 5.2; 0.05% Proclin® 300): 55mL
• PolyLink Wash/Storage Buffer (10mM Tris, pH 8.0; 0.05% Bovine Serum Albumin; 0.05% Proclin 300): 45mL
• PolyLink EDAC (Carbodiimide): 750mg. Note: Store powder desiccated at -20˚C. Flood headspace with N2 gas for best
preservation. Warm the sealed vial to room temperature in a desiccator to avoid condensate formation in the bottle. Make working solutions just before use.
Material Required
• Carboxylated polystyrene or silica microspheres • Centrifuge
• Test tubes
Procedure
Researchers are advised to optimize the protein to microsphere ratio and incubation times for their particular protein. 1. Warm microparticles, PolyLink Coupling Buffer, and PolyLink Wash/Storage Buffer to room temperature. 2. Pipet 12.5mg of microparticles into a 1.5-2mL polypropylene microcentrifuge tube.
3. Pellet the microparticles via centrifugation for 5-10 minutes at approximately 500-1000 x G. Note: Centrifugation times will vary according to the size of the particle.
4. Resuspend microparticle pellet in 0.4mL of PolyLink Coupling Buffer.
5. Pellet again via centrifugation for 5-10 minutes at approximately 500-1000 x G. 6. Resuspend the microparticle pellet in 0.17mL of PolyLink Coupling Buffer.
7. Just before use, prepare a 200 mg/mL EDAC solution by dissolving 10mg PolyLink EDAC in 50µL PolyLink Coupling Buffer. Use
immediately.
8. Add 20µL of the EDAC solution to the microparticle suspension.
Product Data Sheet 644
PolyLink Protein Coupling Kit
for COOH Microspheres
COOH
Microparticles EDAC Active Intermediateon Microparticles Protein Protein Coupledto Microparticle
Figure 1
Figure D.1 La fonctionnalisation des billes carboxyles (COOH) avec l'anti-digoxigénine se fait en deux étapes. La première réaction consiste à créer une fonction ester sur les billes en faisant réagir l'EDAC avec la fonction COOH des billes. La seconde réaction se fait ensuite entre la fonction amine de la protéine d'intérêt avec la fonction ester de la bille.
Matériel :
Environ 235 µl de billes carboxyles (COOH) en polystyrène de diamètre 0.974µm (Bangs Laboratories, Inc)
Tampon "PolyLink Coupling buer" (PLC), réchaué à température ambiante
Tampon "Storage" auquel on rajoute de la BSA fraîche à 1 g/L, réchaué à température ambiante
Tampon d'activation, réchaué à température ambiante Centrifugeuse
Bain à ultrasons Rinçage des billes :
Prélever 6.25 mg de billes (Soit environ 235 µl). 145
Centrifuger 6 minutes à 1000G
Retirer le surnageant et rajouter 200 µl avec du PolyLink Coupling buer (PLC). Répéter l'opération deux fois (en soniquant après chaque étape pendant 5 minutes) puis une dernière fois mais en rajoutant cette fois-ci 85 µl du PLC buer et ne pas retirer le surnageant. Bien vortexer avant de passer à l'étape suivante.
Remarque : la vitesse de centrifugation dépend du diamètre et de la densité des billes utilisées.
Activation de la surface des billes :
On fait ici réagir l'EDAC avec la fonction -COOH des billes pour ajouter une fonction ester qui nous permettra ensuite de xer la protéine d'intérêt.
Diluer 10 mg d'EDAC (aliquot) dans 50 µl d'activation buer (pour une solution nale à 200 mg/ml)
Mettre 20 µl de cette solution dans celle de billes Vortexer puis soniquer 5 minutes
Laisser incuber 30 minutes.
Fixation de la protéine (ici l'anti-digoxigénine) :
On ajoute ensuite la protéine dont la fonction amine réagit avec la fonction ester de la bille. Ajouter 100 à 250 µg de protéine à la solution de billes
Laisser incuber une nuit sous agitation à 4C. Rinçage :
On rince à présent les protéines en excès n'ayant pas réagi avec une fonction ester des billes. Centrifuger 10 minutes les billes à 1000G
Resuspendre le culot dans 100 µl de tampon PLC.
Répéter l'opération deux fois puis resuspendre le dernier rinçage dans 235 µl de tampon "Sto- rage" auquel on a ajouté de la BSA fraîche à 1 g/L. Soniquer 15 secondes puis conserver la solution sous agitation permanente à 4C.
Cette solution nale contient 26.8 mg/ml (soit 2.68 %) ou 5.54 1010billes/ml.