3.3.1 Cellules micro uidiques
Travailler avec des cellules micro uidiques permet de faire des économies considérables en produits à injecter. Etant donné que seuls quelques mm2 de la surface de la lamelle de
microscope sur une profondeur n'excédant pas les 100 nm sont utilisés pour observer des pro- cessus biologiques, il su t d'injecter les produits dans des canaux micro uidiques de section de quelques centaines de µm2. Au cours de cette thèse nous avons travaillé avec deux types de
cellules micro uidiques faites maison. Les premières, qui consistaient à injecter les produits en les poussant (pression positive dans la cellule), ont été remplacées par des cellules plus économes dont le principe est d'injecter les produits en les aspirant (pression négative). Cellules à pression positive Les cellules sont constituées d'une lame de microscope standard en verre d'épaisseur 3 mm, percée de deux trous de diamètres 0.8 mm espacés de 33 mm,
scotchée à une lamelle de microscope (préalablement nettoyée ou silanisée). Le scotch double face d'épaisseur 200 µm est d'abord déposé sur la lame et un canal de largeur 3 mm et de longueur 35 mm est découpé avec une lame de rasoir. La lamelle est ensuite déposée sur le scotch et est ainsi solidement attachée à la lame. Le capillaire pour l'injection possède un dia- mètre interne de 150 µm pour une longueur de 30 cm et est connecté à une seringue par un adaptateur (P-662 Microtight, Upchurch scienti c) et par son autre extrémité à la lame par un adaptateur diérent (6-32 FB NanoPort, Upchurch scienti c). Le plot de sortie de la cellule est quant à lui constitué de PDMS dans lequel est inséré un tube de 300 µm de diamètre interne pour l'évacuation des produits.
De telles cellules nécessitent d'injecter 40 µl de produits pour remplir le canal dont plus de la moitié est perdue dans les volumes morts du tuyau et des connecteurs. Un pousse-seringue (PHD 2000, Harvard-Apparatus) permet d'injecter les produits avec un débit constant (typi- quement 100 µl/min). L'utilisation de seringues pour l'injection pose toutefois un problème lors de l'utilisation de produits visqueux tels que les extraits cellulaires pour les expériences avec le ribosome. Lors de l'insertion du produit dans la seringue, il est souvent di cile d'em- pêcher la formation de bulles dans la solution. Pour éviter alors d'injecter ces bulles en même temps que le produit, il convient d'insérer un volume plus important dans la seringue et d'en injecter une partie seulement tout en penchant la seringue pour que les bulles se regroupent au niveau du piston.
Figure 3.10 Cellules micro uidiques. A gauche : les produits déposés dans une seringue sont injectés dans la cellule via un capillaire de diamètre interne 150 µm et de longueur 30 cm. A droite : les produits sont déposés dans un réservoir à l'entrée du canal micro uidique et sont injectés en aspirant avec une seringue par l'autre extrémité de la cellule. Pour les deux types de cellules micro uidiques la vitesse d'injection est contrôlée par un pousse-seringue.
Cellules à pression négative Un deuxième type de cellule micro uidique a été mis au point. Celui-ci possède un réservoir dans lequel les produits sont déposés avant d'être aspirés dans le canal. Pour ce faire, la seringue est branchée sur le tuyau de sortie et le pousse-seringue a été modi é de sorte que la partie amovible tire sur le piston de la seringue au lieu de pousser. On garde ainsi un système d'injection des produits à débit constant et contrôlable. Ce système possède trois avantages majeurs par rapport au premier type de cellules. D'une part il n'y a plus de perte de produits dans les volumes morts des tuyaux d'injections. Pour ces cellules il ne faut déposer dans le réservoir que le volume nécessaire pour remplir le canal, soit une vingtaine de microlitres. D'autre part, on évite l'injection de bulles dans les cellules puisque la seringue n'est utilisée qu'au niveau de la sortie. En n, en aspirant, on applique dans la cellule une pression négative limitant les risques de fuites des produits.
Vitesse d'injection Lors du rinçage des produits incubés ou même de l'injection des extraits cellulaires pour les expériences avec le ribosome, on peut se poser la question de l'in uence des forces de friction qui s'appliquent sur le système biologique par le ux dans le canal. Ces forces de friction s'expriment comme le produit du coe cient de friction du milieu par la vitesse du liquide à l'endroit considéré dans le canal. Pour un débit d'injection de 100 µl/min dans un canal de section 200 µm sur 3 mm, la vitesse moyenne du liquide vaut alors 2.78 mm/s. Nous allons voir ci-après comment estimer la vitesse locale connaissant cette vitesse moyenne. Le coe cient de friction est quant à lui corrigé des eets de surface en utilisant la loi de Faxen (equ. 2.20) connaissant la distance à la surface et la dimension du système biologique considéré. Le nombre de Reynolds est un nombre sans dimension permettant de caractériser la nature d'un écoulement. Ce nombre s'écrit :
Re = U d
ν (3.4)
avec U la vitesse du uide, d la dimension caractéristique du système et ν la viscosité ciné- matique du liquide. Pour un écoulement d'eau (de viscosité cinématique de 0.884.10−6 m2/sà
25 degrés) de vitesse moyenne 2.78 mm/s dans notre canal d'épaisseur 200 µm, le nombre de Reynolds vaut Re = 0.63. Or, lorsque la valeur de ce nombre est inférieure à 1, l'écoulement est laminaire (absence de turbulences). Le champ de vitesse d'un liquide entre deux plaques situées en z = ±h/2 pour un écoulement laminaire s'écrit :
v(z) = vmax 1−4z 2 h2 (3.5) On peut en utilisant cette équation exprimer la vitesse moyenne sous la forme :
vmoy= vmax Rh/2 −h/2 1−4z2 h2 dz h (3.6)
d'où la vitesse maximale vmax = 3vmoy/2. On peut donc en utilisant l'équation 3.5 calculer
la vitesse locale dans le canal et donc calculer les forces de friction sur un système biologique xé à la surface. Dans le cas d'un ribosome complexé sur un ARNm assimilé à une sphère de rayon 15 nm à une distance de 50 nm de la surface, cette force vaut alors 1.4 fN (pour une vitesse d'injection de 100 µl/min dans notre canal d'épaisseur 200 µm) tandis que dans le cas d'une bille de rayon 500 nm positionnée à 2 µm de la surface via un ADN, la force de friction s'élève à 1.8 pN.
Ces calculs ne prétendent pas donner des valeurs exactes des forces de friction mais permettent néanmoins d'avoir un ordre de grandeur des forces exercées sur le système biologique lors du rinçage des cellules micro uidiques. On pourra ainsi être con ant lors des expériences sur le ribosome que le rinçage ne risque pas de décrocher notre système biologique de la surface. Pour les expériences de pince optique il sera cependant plus prudent de rincer les canaux avec des débits plus faibles, de l'ordre de 10 µl/min (soit des forces de friction de 0.18 pN).
3.3.2 Contrôle en température de la cellule micro uidique
La température est souvent un paramètre important pour les études de processus biolo- giques. C'est le cas par exemple de la synthèse des protéines par le ribosome dont la cinétique
dépend fortement de la température. Il est donc préférable pour se placer dans les conditions optimales de pouvoir contrôler ce paramètre. Nous avons conçu à cet eet un support per- mettant d'accueillir une cellule micro uidique et de réguler sa température à une trentaine de degrés ( gure 3.11). Pour ce faire un module Peltier est xé à une extrémité d'un support en cuivre a n de chauer ou refroidir l'ensemble. Une sonde placée à environ 1 cm du module Peltier mesure la température et un asservissement électronique régule le courant traversant le Peltier de sorte que la valeur mesurée par la sonde corresponde à une température de consigne. Ce système permet ainsi de thermaliser la cellule micro uidique placée sur le support à une trentaine de degrés en quelques minutes. Pour éviter une déperdition de chaleur de la cellule micro uidique à travers l'objectif de microscope, ce dernier est entouré d'une gaine chauf- fante permettant de contrôler indépendamment sa température. On obtient par ce système un contrôle de la température de la cellule micro uidique avec une précision de l'ordre de ±1 degré.
Figure 3.11 Contrôle en température de la cellule micro uidique. La cellule est placée sur un support en cuivre sur lequel est monté un module Peltier chauant ou refroidissant l'ensemble pour atteindre une valeur de consigne. Un radiateur monté sur le module Peltier permet d'aider ce dernier à dissiper sa chaleur. Une gaine chauante est enroulée autour de l'objectif pour thermaliser celui-ci avec la cellule micro uidique et ainsi éviter des fuites de chaleur vers le bâti du microscope.
3.3.3 Autofocus
Garder la mise au point sur un échantillon sur des échelles de temps relativement longues (plusieurs minutes) pose souvent des di cultés dues aux dérives lentes du système (dérives mécaniques de l'objectif par exemple). De plus, dans notre cas, l'injection des produits en- traîne une dilatation ou une compression de la chambre micro uidique causant une perte de la mise au point sur l'échantillon. Pour pallier ce problème, nous avons incorporé au montage un système de mise au point automatique. Celui-ci utilise la position du faisceau totalement ré échi à l'interface lamelle-échantillon pour rétroagir sur la position verticale de la platine pié- zoélectrique [119, 120]. Une dérive verticale de la position relative de l'échantillon par rapport à l'objectif entraîne une déviation du faisceau retour ( gure 3.12). En imposant une position à ce dernier on peut alors contrôler la distance entre l'échantillon et l'objectif et donc la mise au point. Pour ce faire le signal mesuré par une photodiode à quatre quadrants (QPD) position- née sur le trajet du faisceau retour est numérisé et exploité sous Labview. Un régulateur PID
(proportionnel intégral dérivé) est programmé pour réguler la position verticale de la platine piézoélectrique a n que le faisceau totalement ré échi soit toujours positionné au même endroit sur la QPD.
Figure 3.12 Principe du contrôle automatique de la mise au point. La direction du faisceau totalement ré échi à l'interface lamelle/échantillon dépend de la distance séparant l'objectif de l'échantillon et donc de la mise au point. En rétroagissant sur la position verticale de la platine piézoélectrique pour que le faisceau retour prélevé par une lame séparatrice soit toujours positionné au même endroit sur une photodiode quatre quadrants on peut alors garder la mise au point sur l'échantillon.
Parce que dans notre situation l'éclairement de l'échantillon n'est pas continu mais synchro- nisé avec l'acquisition des images, on ne peut pas utiliser le faisceau d'excitation pour contrôler su samment rapidement la mise au point sans détériorer la qualité de l'image. On utilise alors un second faisceau (faisceau sonde) issu du même laser (bleu ou vert) légèrement décalé a n qu'il n'excite pas les uorophores dans la zone d'observation. Pour ce faire un cube séparateur de polarisation est placé après une lame demi-onde sur le trajet des faisceaux vert et bleu a n de prélever une fraction du faisceau en tournant une lame réglable demi-onde ( gure 3.13). Un second cube séparateur de polarisation placé après le télescope permet de recombiner le faisceau sonde sur le trajet du faisceau d'excitation avec un léger décalage introduit à l'aide du miroir M5. Le faisceau sonde n'étant pas agrandi par le télescope, sa zone d'excitation dans le plan de l'échantillon sera petite (typiquement quelques microns de côté) et située en dehors de la zone d'observation. Le faisceau sonde totalement ré échi à l'interface lamelle/échantillon est séparé du faisceau principal d'excitation par un diaphragme et un polariseur et sa position est mesurée par une photodiode à quatre quadrants.
Le signal issu de la QPD est ampli é et ltré par un circuit électronique (le ltre, de fréquence de coupure 10 Hz, permet d'amortir les oscillations de la rétroaction). Le signal est ensuite numérisé (USB-6008, National instrument) pour être traité sous Labview. Typiquement on observe une relation linéaire de la réponse de la QPD sur 2 V pour un déplacement vertical de la platine de 1.2 µm (celle-ci dépend de la taille des quadrants de la QPD, ici de 3 mm, et de la taille du faisceau sonde, ici de ≈ 1 mm). La gamme de tensions analogiques de la carte USB-6008 étant de -10 à 10 V codées sur 12 bits, on a donc une résolution théorique de 3 nm
EM1 EM2 M2 M1 M4 M3 T MG L1 MD objectif Obt.
Séquenceur
CCD
Lt Notch Fém Sources Laser M5 λ/2 CSP Rétroaction Pol. Diaphr. QPD Laser Ble u Laser Rou ge Laser Ver tFigure 3.13 Mise en place du faisceau sonde pour la mise au point automatique sur l'échan- tillon. Une fraction du faisceau d'excitation est prélevée par un cube séparateur de polarisation (CSP) et renvoyée sur le trajet du faisceau principal avec un léger décalage à l'aide du miroir M5. Une lame demi-onde (λ/2) placée devant le premier CSP permet d'ajuster la puissance du faisceau sonde. Ce dernier, totalement ré échi à l'interface lamelle/échantillon, est ensuite séparé du faisceau principal d'excitation par un diaphragme (Diaphr.) et un polariseur (Pol.) et sa position est mesurée par une photodiode à quatre quadrants (QPD).
sur la mise au point limitée par la conversion analogique/numérique. Le temps de réponse de la rétroaction est quant à lui d'une centaine de millisecondes, limité par le ltre passe bas du circuit électronique de la QPD.
Ce système de mise au point automatique possède donc une résolution spatiale et temporelle su sante pour nos expériences, tout en fonctionnant sur une gamme de déplacements supé- rieure aux pertes de mise au point observées lors de l'injection des produits dans nos cellules micro uidiques. On notera cependant que l'asservissement reste très sensible à la présence de bulles d'air, souvent présentes dans l'huile pour l'immersion de l'objectif de microscope, ainsi qu'à des variations de l'indice du milieu d'observation (passage d'une bulle d'air par exemple) puisqu'elles provoquent des variations de l'intensité du faisceau sonde ré échi et donc une perte de la mise au point.