Etirement d'un brin d'ADN

Après une incubation de plusieurs heures du mélange de billes-ADN dans la cellule, les billes non accrochées à la surface sont rincées avec une solution de tampon TRIS+BSA (1 g/L). Les billes accrochées à la surface par un ADN sont identiées par le fait que leur position uctue autour d'un emplacement xe sur la lamelle. Pour déterminer le point d'ancrage de la bille sur la surface, la bille est piégée puis ramenée à une hauteur inférieure à un micron de la lamelle. A l'aide de la platine piézoélectrique, un déplacement sinusoïdal de l'échantillon autour de sa position initiale est eectué tout en mesurant sur la QPD la déviation du faisceau laser par la bille lorsque l'ADN force celle-ci à sortir de sa position d'équilibre. La position initiale de la platine est alors ajustée de sorte que le signal mesuré par la QPD sur l'axe parallèle au déplacement de la platine soit maximisé et centré. Une fois la position du piège et le point d'ancrage de la bille superposés, la platine est à nouveau translatée sinusoïdalement avec une vitesse de 100 nm/s et le signal de la QPD ainsi que la position correspondante de la platine sont enregistrés pour être analysés.

La calibration du piège (en utilisant les méthodes décrites dans les paragraphes 2.4 et 2.3.4) est faite après les mesures de force-extension de l'ADN, ceci an de minimiser le temps d'ex- position de l'ADN avec le laser de pince. Bien que la longueur d'onde du laser soit choisie pour éviter d'endommager les échantillons biologiques étudiés, dans le proche infrarouge des oxygènes singulets sont générés par le faisceau laser et dégradent l'ADN réduisant son temps de vie [31].

Une fois les données enregistrées et le piège calibré, les mesures sont analysées sous IGOR PRO. La sensibilité β étant connue grâce à la calibration, la position de la bille par rapport

X_platine X_bille

L_DNA

Ѳ

Déplacement de la platine

Figure 2.29  Schéma représentant l'étirement d'un brin d'ADN accroché entre la surface et la bille piégée. Alors que la platine piézoélectrique déplace l'échantillon, l'ADN tire la bille hors de sa position d'équilibre. La direction de la force appliquée entre la bille et l'ADN dépend alors de la hauteur de la bille.

au centre du piège peut être déterminée à partir des déviations du spot laser sur la QPD. La position de la bille dans le piège et la raideur de celui-ci nous permettent alors de remonter à la force appliquée pour chaque position de la platine. Pour connaître l'extension de l'ADN pour chaque position de la platine, il convient ensuite de corriger le signal de celle-ci du rayon de la bille rbille, du déplacement de la bille Xbillepar rapport à son point d'équilibre mais aussi

de l'angle entre la surface et l'ADN. Ce dernier peut être déterminé connaissant la hauteur hbille de la bille piégée. Dans le cas idéal, une calibration de la raideur du piège dans le plan

longitudinal serait nécessaire pour connaître la composante de la force appliquée dans cette direction. Cependant, en positionnant la bille à une distance inférieure à 1 µm de la surface et en travaillant avec un ADN d'une longueur théorique de 2.5 µm, la mesure de la composante transversale uniquement introduira une erreur faible (<10%) par rapport à la force réelle im- pliquée.

En utilisant les notations de la gure 2.32, l'extension de l'ADN l est donnée par : l =(Xplatine− Xbille− rbille)2+ h2bille

1 2

(2.35) A ce stade on a donc la force appliquée pour chaque extension de l'ADN. Bien que l'on ait pris soin de superposer le piège avec la position d'ancrage de l'ADN, il reste souvent un oset résiduel. Pour le déterminer et le corriger, on utilise le fait que la courbe de force- extension obtenue expérimentalement doit être symétrique par rapport à ce point d'ancrage puisque le déplacement de la platine est sinusoïdal par rapport à celui-ci. Dans [14], les auteurs déterminent le centre de symétrie de leur courbe de force-extension en eectuant un ajustement de la courbe de force-extension de leur ADN par un polynôme de degré 7 dont l'expression pour une fonction impaire peut s'écrire :

y = g(x) = y0+ b1(x− x0) + b3(x− x0)3+ b5(x− x0)5+ b7(x− x0)7 (2.36)

où les termes x0 et y0 sont les coordonnées du centre de symétrie de la courbe. Le graphique

2.30 représente une courbe d'extension avec l'ajustement de l'équation 2.36.

-10x10-12 -5 0 5 Force (N) 1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0 -1.5 Extension de l'ADN (µm)

Figure 2.30  Courbe de force-extension d'un ADN double brin de 7500bp (cercle) pour un piège de 0.072 pN/nm et son ajustement par l'équation 2.36 (trait plein). L'ajustement permet alors de déterminer le point de symétrie de la courbe, ici de x0 = 0.058 µm et y0 = 0.72 pN.

longueur de persistance ainsi que le facteur d'élasticité de l'ADN étudié. Seuls ces paramètres sont utilisés pour eectuer un ajustement des données expérimentales.

8x10-12 6 4 2 0 Force (N) 1.5 1.0 0.5 0.0 Extension de l'ADN (µm)

Figure 2.31  Données expérimentales d'une courbe force-extension d'un ADN double brin de 7500bp (cercle). L'ajustement (trait plein noir) de ces données par l'équation 2.33 pour des forces inférieures à 5pN donne une longueur de contour de 1.94 µm et une longueur de persistance de 23.7nm. La courbe de force-extension théorique pour un ADN double brin de même longueur de contour et de longueur de persistance de 50 nm est tracée en trait plein gris. Sur le graphique 2.31 l'ajustement des données expérimentales de force-extension d'un ADN double brin de 7500 paires de bases par l'équation 2.33 donne une longueur de contour de 1.94 µm et une longueur de persistance de 23.7 nm. Les valeurs théoriques attendues pour un tel ADN sont de 2.5 µm pour la longueur de contour et 50nm pour la longueur de persis- tance. L'écart entre les valeurs expérimentales et théoriques peut provenir soit d'une erreur de calibration du piège, soit du fait que l'accroche de l'ADN sur la bille n'est pas unique. Cette dernière explication est très probable puisque les ratios d'ADN par bille utilisés ici sont élevés (100 : 1). Dans le cas où on tire sur une bille accrochée à la surface via plusieurs ADN, on doit logiquement mesurer une longueur de contour plus courte que celle d'un ADN unique, ce qui est bien ce que l'on observe. Lorsque l'on tire sur plusieurs ADN entre la bille et la surface, alors pour une extension donnée on doit exercer une force plus élevée par rapport au cas où on tire sur un ADN unique : d'après l'équation 2.33 on doit donc avoir une longueur de persistance qui est plus faible. Ceci est également en accord avec nos mesures. Pour trouver un meilleur accord entre la théorie et nos mesures, nous avons cherché à obtenir des accroches d'ADN unique entre les billes et la surface en ajustant les ratios d'ADN par bille. Avec 100 ADN par bille dans le mélange le nombre d'accroches de billes à la surface est optimal, par contre la majorité des billes observées uctuent peu autour de leur point d'ancrage ce qui peut eectivement laisser penser que plusieurs ADN relient les billes et la surface. En diminuant le nombre d'ADN par bille le nombre d'accroches diminue sans laisser observer des accroches uniques. La fonctionnalisation des billes et les quantités d'ADN à mélanger avec les billes restent donc encore actuellement les paramètres à optimiser pour la suite des expériences.