L’activation de la cellule dendritique

Lors du contact avec l’haptène et en réponse aux signaux de danger perçus, la DC est activée (i.e. augmentation des molécules de co-stimulation et d’adhésion, sécrétion de cytokines, perte des fonctions de capture d’antigènes). Jouant un rôle clé dans l’initiation de la sensibilisation, les DC ont rapidement été proposées et identifiées comme des candidates prometteuses pour le développement de systèmes in vitro dans l’étude de l’événement clé n°3 de l’AOP de la sensibilisation cutanée (Figure 34).

Au début des années 2000, plusieurs groupes ont rapporté des résultats encourageants obtenus à partir de DC humaines différenciées à partir de cellules précurseurs du sang (à partir de monocyte CD14+ (mo-DC) ou de cellules souches de sang de cordon CD34+ (CD34-DC), après exposition aux allergènes. Ces tests sont basés sur les changements phénotypiques des DC, tels que l’augmentation de l’expression du CD86 et CD54, le relargage de l’interleukine IL-1β, l’internalisation de molécules du CMH-II. Concernant les marqueurs, la surexpression de CD86 semble être clairement identifiée comme un marqueur de la sensibilisation cutanée qui varie selon un profil dose-réponse. Mais l’augmentation simultanée de la cytotoxicité en cas de contact avec une substance sensibilisante (apoptose) ou irritante (nécrose) a fait craindre une interférence entre ces deux facteurs, crainte supprimée par le groupe Ade et al. (2006) qui a prouvé l’indépendance des deux facteurs (cytotoxicité et index de stimulation des CD86). Bien que de nombreuses études montrent que les DC issues de précurseurs de sang (modèle le plus pertinent physiologiquement) ont la capacité de discriminer les molécules sensibilisantes sur la base d’un set de marqueurs (dos Santos et al., 2009), elles présentent un certain nombre d’inconvénients, dont le coût, l’approvisionnement et la complexité des procédures d’obtention et de préparation, ainsi que leur inhérente variabilité inter-donneurs (Casati et

al., 2005b). Comme possible alternative et pour pallier aux problèmes de variabilité, les lignées

cellulaires myéloïdes THP-1, KG-1, U937 et MUTZ-3 sont utilisées (Casati et al., 2005b). Elles représentent des candidats appropriés en tant que DC de substitution et ont démontré leur capacité à afficher un phénotype proche des DC humaines après traitement par des cytokines (dos Santos et al., 2009). Kao et Shiseido (Ashikaga et al., 2006; H. Sakaguchi et al., 2006) ont évalué l’expression du CD86 et l’internalisation de molécules du CMH-II dans les cellules THP-1 après exposition à des substances sensibilisantes. Ils ont montré que certains sensibilisants induisent une augmentation de l’expression du CD86 après 24h d’exposition et une internalisation des molécules du CMH-II après 2h. De même, Yoshida et al. (Yoshida et al.,

2003) ont démontré que les cellules immatures THP-1 (non pré-traitées par des cytokines) répondent aux sensibilisants en modulant l’expression des marqueurs de surface CD54 et CD86. La lignée cellulaire MUTZ-3 a également été évaluée en tant que méthode in vitro pour l’évaluation du potentiel sensibilisant en mesurant l’expression de HLA-DR, CD54 et CD86 par cytométrie en flux. De même, les cellules U937 issues d’une lignée cellulaire myéloïde qui regroupe les cellules immunitaires telles que les monocytes, les polynucléaires et les cellules dendritiques ont aussi été choisies pour ce type de test.

Figure 34 : Mesure de l’activation de la cellule dendritique selon l’AOP (OCDE, 2012)  U-SENS™

Ce test in vitro permet d’évaluer la capacité d’une substance à induire l’activation des DC. La viabilité cellulaire ainsi que l’expression de la molécule de co-stimulation CD86 sont analysées en cytométrie en flux. Les protocoles basés sur la lignée cellulaire U937 ont été développés initialement par L’Oréal, Cosmital SA ainsi que Procter & Gamble (Ade et al., 2006; Python et

al., 2007). L’Oréal a ensuite affiné le protocole comme décrit par Piroird et al. (2015). La

détermination préalable de la CV70 (concentration induisant une viabilité cellulaire de 70%) est réalisée afin de s’affranchir de l’effet cytotoxique de la substance. Le principe du test est représenté en Figure 35.

Les cellules de lymphome histiocytaire humaines U937 sont exposées en plaques 96 puits pendant 48h à une gamme de six concentrations de la molécule à tester (choisies en fonction de la CV70). Les cellules sont ensuite lavées et incubées avec des anticorps anti-CD86 couplés à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et sont analysées par cytométrie en flux. La viabilité cellulaire est mesurée par exclusion à l’iodure de propidium (IP). L'IP est utilisé pour déterminer la viabilité cellulaire pour chacune des concentrations d'essai, à partir desquelles est extrapolée linéairement une CV70 (concentration ayant une viabilité de 70%). Pour les concentrations d'essai ayant une viabilité d'au moins 70%, la mesure de l’expression du CD86 sert à déterminer l'indice de stimulation (SI) par rapport au témoin solvant/véhicule correspondant. A partir de ces données, l'EC150 (concentration avec un SI de 150) est calculée par interpolation linéaire.

Une molécule est prédite sensibilisante si elle induit une augmentation du CD86 supérieure à 150% des cellules non traitées et si cette induction est dose-dépendante par rapport aux doses non toxiques (viabilité > 70%) dans au moins deux expériences indépendantes. Le test à lui seul n’est pas suffisant pour faire la discrimination entre un sensibilisant d’un non sensibilisant et doit donc s’intégrer au sein d’une ITS. De même, d’autres paramètres tels que la pénétration cutanée, la liaison aux protéines ou encore l’activation métabolique sont autant d’autres facteurs à prendre en compte.

Cosmetics Europe a jugé la reproductibilité du test U-SENS™ comme robuste après deux essais interlaboratoires. Le protocole U-SENS™ a été transféré à l’ECVAM, dont les recommandations ont été émises en 2017, et validé par l’OCDE en octobre 2017 sous la ligne directrice 442E (OECD, 2017b).

 Le h-CLAT : human Cell Line Activation Test

Ce test in vitro repose sur le même principe que celui de l’U-SENS™, mais sur une lignée cellulaire différente et en mesurant l’expression d’un marqueur supplémentaire. Ce test utilise la lignée THP-1 (lignée leucémique pro-monocytaire humaine) comme substitut des DC de la peau. Après incubation des cellules avec la substance chimique, l’augmentation de l’expression de marqueurs membranaires (CD54 et CD86) sur les cellules THP-1 est mesurée par cytométrie en flux. Dans une première étude de 2003, il a été trouvé que l’expression du CD86 et du CD54 dans les cellules THP-1 ou U937 (lignée cellulaire humaine de lymphome histiocytaire) était augmentée après une exposition de 24h à l’allergène. Ces lignées cellulaires

présentent l’avantage d’être faciles à garder en culture, tout en conservant un nombre de caractéristiques des cellules in vivo, telles que l’activité estérase, la production de lysozyme et la phagocytose. L’optimisation du protocole du h-CLAT a été réalisée en coopération par deux équipes japonaises : Kao (H. Sakaguchi) et Shiseido (T.Ashikaga). Le h-CLAT quantifie donc les changements dans l'expression des molécules de surface costimulatrices CD54 et CD86 dans les cellules THP-1 après 24h d'exposition à une substance à tester, comme présenté dans la Figure 36.

Figure 36 : Principe du test h-CLAT (Wong et al., 2015)

Le protocole du h-CLAT se décompose en deux parties (OECD, 2016a). La première étape consiste à déterminer la CV75 correspondant à la concentration en substance testée entraînant une viabilité cellulaire de 75%. Cette concentration est déterminée grâce à un test de cytotoxicité qui consiste à mesurer la fluorescence de l’IP par cytométrie en flux. Dans une seconde étape, l’expression des marqueurs CD86 et CD54 est analysée par cytométrie en flux après traitement des cellules THP-1 pendant 24h par 8 concentrations différentes, proches de la CV75 (de 0,335*CV75 à 1,2*CV75). Les cellules sont ensuite préalablement marquées avec la FITC couplée à trois différents types d’anticorps (anticorps CD54, CD86 et anti-IgG1). Les anticorps anti-IgG1 (isotype de souris) ne peuvent théoriquement pas se lier aux cellules de la lignée THP-1 puisque ces dernières sont des cellules humaines. L’utilisation de ces anticorps permet de mesurer l’intensité de fluorescence moyenne du bruit de fond. La moyenne géométrique de l’intensité de fluorescence (MFI) est mesurée par cytométrie en flux. La viabilité cellulaire pour chaque concentration testée est mesurée simultanément avec l’IP (elle doit être supérieure à 75% pour que le résultat soit exploitable).

L’intensité de fluorescence relative (Relative Fluorescence Intensity (RFI)) est utilisée afin d’interpréter les résultats. Elle est calculée en déterminant l’intensité moyenne de fluorescence (MFI) pour chaque type d’exposition des cellules :

substance) la avec traitées cellules des isotypique (contrôle MFI -substance) la avec traitées (cellules MFI RFI =

La RFI du CD86 et du CD54 pour les cellules témoins positifs et les cellules traitées par la substance sont calculées.

Un modèle prédictif a été établi afin de conclure sur le potentiel sensibilisant de la substance testée (OECD, 2016a). Si la RFI du CD86 est égale ou supérieure à 150% à n'importe quelle dose testée (≥ 50% de viabilité cellulaire) dans au moins deux séries indépendantes et/ou si la RFI du CD54 est égale ou supérieure à 200% (≥ 50% de la viabilité cellulaire) dans au moins deux essais indépendants, la substance d'essai sera considérée comme positive. Sinon, celle-ci sera classée négativement.

Le test du h-CLAT a été validé par l’ECVAM pour transférabilité et fiabilité, et les recommandations de l’ECVAM ont été publiées en Mars 2015. Le test a été validé par l’OCDE sous la ligne directrice 442E en Juillet 2016 (OECD, 2016a).

Les applications et limites du h-CLAT

La capacité prédictive globale a été évaluée comme étant bonne, même si celle-ci présente néanmoins quelques faux positifs et faux négatifs. Par exemple, les produits chimiques faiblement solubles ainsi que les pré- et pro-haptènes sont source de résultats faux négatifs. De même, les produits chimiques classés comme faiblement sensibilisants en LLNA semblent peu répondre au h-CLAT et donc être aussi source de faux négatifs (comme par exemple le 1-bromohexane, le cyclamen aldehyde, le butyl glycidyl ether,…).

Ce test n’est pas applicable aux substances non solubles dans l’eau ou le DMSO (risque de faux négatifs avec les chimiques dont le logP > 3,5). De même, la lignée cellulaire THP-1 ayant une capacité métabolique limitée, les pro-haptènes peuvent donner des résultats faussement négatifs.

 IL-8 Luc : IL-8 THP-1 /THP-G8

Les études sur les DC ont été très développées et se sont particulièrement intéressées à la recherche de biomarqueurs qui seraient exprimés uniquement après traitement par une substance sensibilisante. Ces études ont montré que les sensibilisants sont à l’origine dans les DC d’une expression modifiée des CD40, CD54, CD83, CD86, HLA-DR et CCR7, ainsi que d’une production augmentée des interleukines IL-8, IL-12p40, de TNF-α (Tumor Necrosis Factor) et d’IL-1β (Cumberbatch et al., 2003; Enk and Katz, 1992). Comme décrit précédemment, différentes lignées cellulaires ont été étudiées en tant que substituts de lignées cellulaires

dendritiques dont les THP-1, U937, KG-1 ou encore MUTZ-3. Dans la plupart de ces études, les marqueurs de surface CD54 ou 86 ont été choisis en tant que biomarqueurs spécifiques de la sensibilisation. Mais l’augmentation du taux d’ARN messager de l’IL-8 ou de sa protéine correspondante semblent également être de bons indicateurs pour discriminer les sensibilisants des non sensibilisants. Il a été établi que l’IL-8 était un peptide chimiotactique puissant que ce soit pour les neutrophiles, les lymphocytes T, les basophiles et les cellules NKT. L’équipe de Takahashi a développé en 2011 une lignée cellulaire THP-1 transfectée par un vecteur de l’IL-8 : la THP-G8. Dans ces vecteurs, l’expression des gènes codant pour la luciférase SLO (Orange) et SLR (Red) est régulée respectivement par les promoteurs de l’IL-8 et de la Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH). Les activités transcriptionnelles sont ensuite mesurées comme l’activité de la luciférase-SLO et de la luciférase-SLR. L’expression de l’ARNm pour 8 des THP-1 et l’activité du promoteur de l’IL-8 des cellules THP-Gl’IL-8 ont été examinées après traitement des cellules par différentes substances, et l’équipe a confirmé la corrélation entre l’induction de l’expression d’ARNm de l’IL-8 (dans les THP-1) et l’activité promotrice de l’IL-8 (dans les THP-G8). Ce test n’est pas dose-dépendant, il est seulement qualitatif (sensibilisant ou non) (Takahashi et al., 2011). Par ailleurs, sur la base des résultats obtenus lors de sa validation, le test IL-8 Luc n’est pas adapté pour tester les tensioactifs, les anhydrides ainsi que les produits chimiques interférant avec la luciférase (OECD, 2017b).

Le protocole de l’IL-8 Luc a été validé par l’OCDE en octobre 2017 sous la ligne directrice 442E (OECD, 2017b).

Le 3ème événement clé de l’AOP, correspondant à l’activation de la DC suite à l’exposition à une molécule allergisante, va conduire à un ensemble de changements fonctionnels au sein de celle-ci. Par exemple, des changements dans la sécrétion de chimiokines, de cytokines et dans l'expression des récepteurs aux chimiokines (dos Santos et al., 2009). De plus, au cours de la maturation des DC, le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH), les molécules de costimulation et les molécules d'adhésion intercellulaires (CD40, CD86, DC11 et CD54, respectivement) sont régulées (dos Santos et al., 2009; Kimber et al., 2011; Vandebriel and Loveren, 2010). De même, les cascades de transduction du signal précèdent les changements dans l'expression des marqueurs de protéines de surface et dans la sécrétion de chimiokines

phosphorylent et déphosphorylent une variété de substrats afin d'induire un changement dans l'expression ou la sécrétion des molécules cibles. En conséquence, l’ensemble des composants de la cascade de transduction du signal peuvent être des biomarqueurs qui vont distinguer les sensibilisants (Lambrechts et al., 2010). Peu d’investigations ont examiné cette possibilité en mesurant les changements dans l'expression de la kinase dans différentes voies de transduction du signal (comme par exemple la voie p38 MAP-K, ERK, PGK et NFκB) (dos Santos et al., 2009; Trompezinski et al., 2008). Miyazawa et al. (Miyazawa et al., 2008a, 2008b) ont étudié p38 MAP-K, une protéine kinase activée par un mitogène, et ERK, une kinase régulée par un signal extracellulaire dans les cellules THP-1. Il est important de noter que les sensibilisants modérés et faibles ont respectivement besoin d’une concentration d’exposition 10x et 100x plus élevée que les sensibilisants puissants pour activer les différentes voies des kinases. Des études sur le rôle possible de l'afflux de calcium en tant qu'événement précoce dans l'activation des DC suggèrent que celui-ci est un second événement après l'induction de formes réactives de l'oxygène (FRO) (Migdal et al., 2010). La complexité du rôle des DC dans la sensibilisation cutanée est encore plus évidente dans les études de « crosstalk » entre les activités des kinases, l'afflux de calcium et le stress oxydant (Aeby et al., 2010).

Les études génomiques et protéomiques ont également le potentiel de révéler des biomarqueurs dans les tests basés sur les DC. Des arrays spécialisés ou des PCR quantitatives de gènes sélectionnés ont été utilisés pour distinguer les sensibilisants des non sensibilisants (dos Santos et al., 2009). En effet, plusieurs études génomiques ont été réalisées sur des DC (moDC, CD34-CD, lignées U937 et THP-1) afin d’identifier les sets de gènes directement induits au cours de la DCA (Cluzel-Tailhardat et al., 2007; Gildea et al., 2006; Python et al., 2009; Ryan

et al., 2004; Schoeters et al., 2007). Ces études ont testées différentes molécules, de

sensibilisants forts (DNCB) à faibles et modérés (eugenol, HCA, hydroxycitronellal). Même si les sets de gènes permettant de discriminer les sensibilisants diffèrent en fonction des conditions expérimentales d’études, la plupart activent des marqueurs spécifiquement modulés par les sensibilisants, qui sont des gènes cibles de Nrf2 (nqo1, ho-1, il-8) sous le contrôle du promoteur ARE. Actuellement plusieurs tests de prédiction issus de ces approches génomiques sont disponibles et présentent relativement de bonnes performances (Sensitiv GARD® (Johansson et al., 2011), Vitosens® (Hooyberghs et al., 2008; Lambrechts et al., 2009)).

 GARD : Genomic Allergen Rapid Detection Test

Le GARD est un test développé par la société SenzaGen en partenariat avec l’université de Lund (Suède), basé sur l’activation de marqueurs de la DC utilisant la lignée cellulaire humaine myelomonocytaire MUTZ-3. Cette méthode à un intérêt particulier car elle permet d’obtenir de nouvelles informations mécanistiques et de connaître ainsi le mode d’action des molécules. Après stimulation des cellules avec la substance chimique, les niveaux d’expression de 200 gènes sont analysés, permettant d’obtenir une signature génique spécifique (GARD Prediction Signature, GPS) du potentiel sensibilisant d’une substance. Après stimulation de ces cellules par les produits chimiques pendant 24h, l’expression des gènes est analysée par RT-qPCR en temps réel. Les biomarqueurs identifiés sont impliqués dans certaines voies biologiques avec des composantes immunologiques pertinentes, telles que le stress oxydatif et la réponse induite aux xénobiotiques. Le GARD a démontré sa fonctionnalité ainsi que sa capacité à prédire avec précision la sensibilisation des produits chimiques dans des essais à l'aveugle (Johansson et al., 2014). Il présente des performances prédictives élevées par comparaison avec ses homologues in vitro (Johansson and Lindstedt, 2014).

Le protocole dont le principe est schématisé en Figure 37 est le suivant (Johansson et al., 2017, 2014, 2011).

Figure 37 : Principe du test GARD (Wong et al., 2015)

Les MUTZ-3 sont ensemencées puis stimulées avec le chimique à tester pendant 24h à une concentration maintenant la viabilité cellulaire supérieure à 90%. Au bout de 24h, une analyse phénotypique est réalisée. L’ARN est ensuite collecté et hybridé à des puces. Les profils d’expression sont créés, puis comparés à des signatures de biomarqueurs prédictifs. Enfin, la valeur de prédictivité (sensibilisant ou non) est calculée.

 Peripheral Blood Monocyte-Derived Cells (PBMDCs)

Devant les inconvénients de l’utilisation d’une lignée cellulaire (fonctionnalités réduites dont la capacité métabolique, l’instabilité génomique, la performance variable selon le passage cellulaire), l’utilisation d’un test stable basé sur les DC dérivées de monocytes du sang périphérique (PBMDCs) a ressurgi. En effet, les PBMDCs sont des cellules majoritairement exemptées de dégénération génomique qui présentent la plupart des capacités physiologiques et métaboliques des DC fonctionnelles. La variabilité interindividuelle dans le taux basal d’expression du CD86 est très limitée (possibilité de réaliser le test à partir de cellules issues d’un même donneur, sans nécessité de réaliser des pools de cellules isolées de différents donneurs). Plusieurs marqueurs d’activations ont été testés mais le plus significatif et pertinent retenu est le CD86 (Eschrich et al., 2007; Guironnet et al., 2000).

Le protocole de Reuter et al. (Beiersdorf) (Reuter et al., 2011) est le suivant. Des monocytes humains de sang périphérique sont isolés, provenant de 5 donneurs. Ces monocytes sont différenciés en DC par ajout dans le milieu de culture d’IL-4 et de GM-CSF pendant 5 jours. La concentration de la substance à tester est choisie pour induire une viabilité ≥ 80%. Les PBMDCs sont ensuite exposées pendant 48h à la substance puis analysées par cytométrie en flux afin de mesurer l’expression du marqueur d’activation CD86. Le pourcentage de cellules exprimant le CD86 est déterminé pour chaque échantillon et la différence entre les résultats obtenus dans l’échantillon traité et le contrôle négatif est calculée (ΔCD86). Une substance induisant un ΔCD86 > 20% dans le domaine cytotoxique acceptable (correspondant à une cytotoxicité < 20%) est considérée comme sensibilisante. Sur 12 substances testées, seul le Benzalkonium chloride été mal classé (Reuter et al., 2011).

 VITOSENS®

Ce test utilise des progéniteurs cellulaires CD34+ dérivés du sang de cordon ombilical humain comme substitut aux DC. Il est basé sur la mesure quantitative du changement d’expression du gène CREM (Cyclic adenosine monophosphate-Responsive Element Modulator) modulateur sensible à la réponse à l’AMPc et le gène CCR2 (C-C chemokine receptor type 2), spécifiques de la sensibilisation, par RT-qPCR (Schoeters et al., 2007). Ces DC de sang de cordon humain CD34+ ont montré un comportement discriminant après exposition à une substance sensibilisante.

de donneurs différents, à une concentration induisant au minimum une cytotoxicité de 5% et ne dépassant pas 20% (IC20) pendant 6h. Le taux d’expression génique pour CCR2 et CREM est mesuré par RT-qPCR. Le protocole a ensuite été optimisé en testant 21 substances connues (10 sensibilisants et 11 non sensibilisants) avec 73 donneurs. Le set de gènes a été élargi à 13 gènes et 9 temps d’exposition testés. L’expression génique est déterminée en accroissement (« Fold Change » ou ratio des niveaux d’expression génique exposé à la substance sur son solvant contrôle correspondant) par rapport au contrôle négatif. Ces résultats sont prometteurs et ont démontré une corrélation linéaire avec les données du LLNA.La méthode prédit correctement certains pro-haptènes montrant certaines capacités métaboliques, mais pourrait ne pas être adéquate pour les cytotoxiques extrêmes (European Chemicals Agency, 2016).

 SensiDerm

Ce test développé par Proteomics a pour but de discriminer les substances sensibilisantes des non sensibilisantes à travers l’expression de biomarqueurs protéiques spécifiques des cellules dendritiques MUTZ-3 sur la base de biomarqueurs protéiques spécifiques. Le panel de biomarqueurs comprend 10 protéines qui ont démontré un profil d’expression différent dans les cellules MUTZ-3 en fonction du potentiel sensibilisant de la substance testée. Les cellules MUTZ-3 sont exposées à des concentrations non toxiques (viabilité > 80%) pendant 24h. Les protéines cellulaires sont ensuite extraites et analysées par spectrométrie de masse. Les résultats sont exprimés par un ratio de l’expression protéique entre les cellules exposées et les cellules témoins. Ce ratio est transformé en score via un modèle mathématique, et