L’épissage constitutif

2.1. L’épissage constitutif

Afin de générer un ARN mature, les exons doivent être identifiés et assemblés les uns à la suite des autres de façon précise et efficace. Ce mécanisme, appelé épissage constitutif, constitue donc une étape clé dans le contrôle de l’expression génique car elle détermine la nature de la phase codante du transcrit mature (Black, 2003).

2.1.1. Séquences nécessaires à l’identification des exons et des introns

L’épissage nécessite une reconnaissance précise des exons et des introns, qui dépend majoritairement de la séquence des sites 5’ et 3’ d’épissage, mais aussi de la taille des introns et des exons (Fox-Walsh et al., 2005). Ainsi, lorsque la taille de l’intron est supérieure à 250 nucléotides, le spliceosome commence à s’assembler autour de l’exon, et on parle alors de définition de l’exon (Berget et al., 1995).

Les introns et les exons sont limités par de courts éléments de séquences conservés et indispensables au recrutement de la machinerie d’épissage (figure 17).

x A l’extrémité 5’ de l’intron, la séquence consensus AG/GURAGU (ou « R » définie un nucléotide A ou G et « / » représente la jonction exon/intron) constitue le site donneur d’épissage (site 5’).

x A l’extrémité 3’ des introns se trouvent trois éléments de séquence : le site de branchement (A), une séquence riche en pyrimidines (Yn) et le site accepteur (ou site 3’), qui est situé à la jonction de l’intron et de l’exon. Le site 3’ d’épissage présente une séquence conservée de type YAG/G (Y définie une pyrimidine, soit les nucléotides U ou C). La séquence riche en pyrimidines est composée d’un enchaînement de 10 à 30 bases. Elle est limitée en amont par le site de branchement, situé 18 à 40 nucléotides du site 3’ d’épissage. Ce site est caractérisé par une séquence consensus très dégénérée de type YNYURAC, renfermant une adénosine indispensable à la réaction de branchement (Patel and Steitz, 2003).

Il est à noter qu’il existe deux classes d’introns : les introns majoritaires délimités par les di-nucléotides GT/AG qui sont éliminés par la machinerie d’épissage majeure dépendante de la snRNP U2 ; et des introns beaucoup plus rares, qui sont délimités par les di-nucléotides AU/AC et qui sont éliminés par la machinerie d’épissage mineure dépendante de la snRNP U12 (Patel and Steitz, 2003).

Figure 19 : Assemblage des acteurs de la réaction d’épissage.

(adaptée de Will and Luhrmann, 2011)

Les particules snRNP sont matérialisées par des sphères. PB : Point de branchement ; 5’SS : site 5’ d’épissage ; 3’SS : site 3’ d’épissage. Le noms des protéines ainsi que les noms des différents complexes formés sont indiqués ; Prp2, Prp5, Prp16, Prp28, Prp43 Brr2, Sub2 sont des ARN hélicases.

Introduction : Chapitre II

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2.1.2. Mécanisme général de la réaction d’épissage

La réaction d’épissage est caractérisée par deux réactions de transestérification (figure 18) (Wahl et al., 2009). La première réaction est une attaque nucléophile, par l’hydroxyle en 2’ du résidu adénosine du point de branchement, du phosphate du premier nucléotide de l’intron. Cette réaction libère l’exon amont et permet la formation d’une liaison phosphodiester entre le premier nucléotide de l’intron (la guanosine du site 5’) et l’adénosine du site de branchement résultant en un intermédiaire d’épissage formé de l’intron en lasso lié à l’exon aval. La seconde réaction est une attaque nucléophile, par l’hydroxyle situé en 3’ de l’exon amont libre, du phosphate situé à la jonction intron/exon aval de la structure en lasso, conduisant ainsi à la libération de l’intron sous forme de « lasso » et la liaison des deux exons. L’intron en lasso est ouvert par une réaction enzymatique de débranchement pour être ensuite hydrolysé et dégradé.

Ces deux étapes de transestérification sont catalysées par une macrostructure, la machinerie d’épissage, aussi nommée « spliceosome ». Cette machinerie est un complexe composé de cinq particules ribonucléoprotéiques appelées snRNP U (pour « Uridine rich small nuclear RiboNucleoprotein Particle ») et de plus d’une centaine de protéines. Il est à noter que les snRNP U1, U2, U4/U6, et U5 constituent le « spliceosome » principal, qui est responsable de l’élimination des introns de classe GU/AG. Au contraire, les snRNP U11, U12 et U4atac/U6atac et U5 constituent le « spliceosome » mineur qui élimine les rares introns de type AU/AC. Chaque snRNP U est composée d’un ARN de petite taille nommé snARN U1, U2, U4, U5 ou U6, d’un cœur de sept protéines Sm pour les snARN U1, U2, U4, U5 et LSm (Sm-Like) pour U6, ainsi que d’un nombre variable de protéines spécifiques (Branlant et al., 1982).

2.1.3. Les différentes étapes d’assemblage de la machinerie d’épissage

L’assemblage de la machinerie d’épissage sur un pré-ARNm se déroule séquentiellement selon une dynamique précise d’association et de dissociation des snRNP U1 à U6 (figure 19). La formation du complexe d’épissage commence ainsi par l’appariement entre l’extrémité 5’ de l’ARN U1 à la séquence du site 5’ d’épissage. Cette interaction ARN-ARN est stabilisée par les protéines de la snRNP U1, mais aussi par des protéines auxiliaires, dite protéines SR, car riches en sérines et arginines (Serine-aRginine) (Boukis et al., 2004 ; Bourgeois et al., 2004).

De façon concomitante, la protéine SF1 et le dimère formé des protéines U2AF65 et U2AF35 (facteur auxiliaire de U2), s’associent respectivement au niveau du point de branchement et de la séquence polypyrimidine (figure 19). La sous-unité de 65 kDa de U2AF (U2AF65) reconnaît la suite de pyrimidines tandis que la sous-unité de 35 kDa de U2AF (U2AF35) interagit avec le di-nucléotide AG de l’extrémité 3’ de l’intron. L’ensemble de ces interactions permet la reconnaissance des extrémités 5’ et 3’ de l’intron et génère le complexe spliceosomal E.

Suite à la reconnaissance des sites 5’ et 3’ d’épissage, la snRNP U2 s’engage dans un appariement ARN-ARN entre les nucléotides centraux du petit ARN U2 et les nucléotides du site de branchement. Cette interaction est stabilisée par les protéines de la snRNP U2 et par les protéines U2AF65 et 35 (Valcarcel et al., 1996). L’association de la snRNP U2 sur le site de branchement chasse la protéine SF1 et conduit à la formation du complexe A.

La tri-snRNP U4/U6.U5 préassemblée est alors recrutée, pour former le complexe B inactif. Lors de la conversion du complexe B inactif en complexe B* actif, les snRNP U1 et U4 sont déstabilisées et libérées et les snRNP U2 U6 et U5 sont remodelées grâce à l’intervention de plusieurs hélicases (figure 19). En effet, l’interaction entre le site 5’ d’épissage et le snARN U1 est rompue au profit d’une interaction entre le site 5’ et le snARN U6 ; l’interaction entre les snARN U4 et U6 est rompue au profit d’une interaction entre les snARN U2 et U6 et enfin la snRNP U5 se lie à l’extrémité 3’ de l’exon amont. Ces changements conduisent à un positionnement de l’adénosine du point de branchement à proximité de l’extrémité 3’ de l’exon amont (Wahl et al., 2009). Ce complexe B* catalyse la première réaction de transestérification ce qui génère le complexe C. Des réarrangements des snRNP U2 U6 et U5 se produisent, et notamment la snRNP U5 interagit avec l’extrémité 3’ de l’exon amont et l’extrémité 5’ de l’exon aval afin de rapprocher les deux exons et permettre la catalyse de la seconde transestérification. Enfin, le spliceosome se dissocie libérant l’ARNm sous forme d’une mRNP (messenger RiboNucleoprotein Particle) et les snRNP U2, U5 et U6 sont recyclées.