Cibler les transcrits contenant l’expansion de répétitions CUG

cellulaire de DICER. Enfin, ces petits ARNs CUG n’ont pas été identifiés dans des modèles cellulaires de la DM (Denis Furling, communication personnelle).

2.3. Les stratégies thérapeutiques

Certains symptômes de la DM, tels que la myotonie, les troubles de la conduction cardiaque, la somnolence ou la cataracte peuvent être améliorés par des traitements, des appareillages ou des opérations spécifiques ; mais aucun traitement curatif n’existe. Cependant, la meilleure compréhension des mécanismes moléculaires à l’origine des DM a permis de développer des stratégies thérapeutiques basées soit sur la dégradation des répétitions CUG ou CCUG, soit sur l’inhibition de la liaison de MBNL à ces répétitions.

Ainsi, plusieurs études ont montré que diminuer l’expression des répétitions CTG entraîne une diminution des symptômes des DM dans des modèles murins ou cellulaires de ces maladies (Mahadevan et al., 2006 ; Yadava et al., 2008 ; Mulders et al., 2009 ; Wheeler et

al., 2009 ; François et al., 2011 ; Wheeler et al., 2012).

2.3.1. Cibler les transcrits contenant l’expansion de répétitions CUG

Afin de cibler l’ARN pathogène, plusieurs approches thérapeutiques se sont basées sur la complémentarité entre des acides nucléiques modifiés et l’ARN DMPK contenant les répétitions CTG. Les approches suivantes peuvent être citées :

x Réparer l’ARN muté par substitution de l’expansion par un nombre plus réduit de répétitions par trans-épissage (Chen et al., 2009).

x Dégrader les transcrits DMPK sans tenir compte du nombre de répétitions. Cette approche entraîne malheureusement la perte de la protéine DMPK. Il est à noter que seul un léger phénotype est observé chez les souris invalidées pour le gène Dmpk (Berul et al., 1999 ; Saba et al., 1999 ; Berul et al., 2000), suggérant ainsi que cette stratégie serait envisageable (Furling et al., 2003 ; Langlois et al., 2003 ; Krol et al., 2007).

x Faciliter l’export des transcrits DMPK muté dans le cytoplasme. Cette stratégie utilise une séquence d’export virale de type WPRE (« Woodchick Post-transcriptional Regulator Element ») incluse dans un transcrit contenant les répétitions CUG (Mastroyiannopoulos et

al., 2005). L’export de ces répétitions ne semble pas avoir d’effet pathogène (Dansithong et al., 2008). Cependant, il reste à déterminer comment insérer cette séquence WPRE dans

 



Tableau 4 : Stratégies ciblant l’ARN contenant les longues répétitions CUG.

AON: Oligonucléotide antisens; MOE : 2’-O-méthoxyéthyle, PS : phosphorothioate ; LNA: Locked Nucleic Acid; hACTA1: transgène de l’actine humaine comportant 250 répétitions CTG dans la région 3’UTR, chez la souris HSA^LR.

 

ARN antisens Myoblastes de patients DM1 Diminution de 80% de l'ARN DMPK muté

(CUG)13 infectés par rétrovirus Diminution de 50% de l'ARN DMPK normal

"hammerhead" Myoblastes de patients DM1 Diminution de 63% de l'ARN DMPK muté

ribozymes Diminution de 50% de l'ARN DMPK normal

siARN (CAG)7 Fibroblastes de patients DM1 Diminution de l'ARN DMPK muté

Peu de diminution de l'ARN DMPK normal

oligonucléotides Myoblastes et myotubes de patients DM1 100% de diminution de l'ARN DMPK muté

antisens (AON) modèles murins DM500 et HSALR Diminution des foci nucléaires

(CAG)7 Correction des défauts d'épissages

hsnARN U7 Myoblastes de patients DM1 Diminution de 80% de l'ARN DMPK muté

(CAG)15 Diminution du nombre de cellules ayant

des foci nucléaires

Correction des défauts des épissages

MOE (20 nucléotides) Injection sous-cutanée des souris HSA^LR Diminution des foci nucléaires

ciblant la séquence codante Libération de MBNL1

et la région 3'UTR dehACTA1 Correction des épissages

flanquant les répétitions CUG Correction de la myotonie

MOE/PS Injection intramusculaire de Diminution de 50% de l'ARN DMPK muté

(CAG)14 & 16 souris EpA960/HSA-Cre Diminution de 40% du nombre de foci/noyau

Faible correction des défauts épissages

2'O méthyl (CAG)7 Myoblastes de patients DM1 Diminution de 65-95% de l'ARN DMPK muté

Myotubes de souris DM500 Diminution de 80% de l'ARN hDMPK muté

siARN (CAG)4 & (CAG)5 Injection intramusculaire Diminution de 70-80% de l'ARN muté

suivie d'électroporation des souris HSA^LR Diminution des foci nucléaires

Correction des épissages dépendant de MBNL1 Correction de la myotonie

Stratégies Modèles d'études Résultats Références

Sobczak et al., 2013 Furling et al., 2003

Langlois et al., 2003

Wheeler et al., 2012 François et al., 2011 Mulder et al., 2009a et 2009b

Krol et al., 2007

Lee et al., 2012

Introduction : Chapitre I

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x Eliminer sélectivement les ARNs contenant les expansions de répétitions CUG ou CCUG et conservant l’expression de l’allèle de DMPK contenant un nombre normal de répétitions CTG. Plusieurs stratégies ont été développées (tableau 4) :

- Ainsi, l’équipe du Dr Furling a développé un ARN complémentaire aux répétitions CUG inséré dans un snARN U7 artificiel. L’expression de cet ARN hU7-(CAG)15x dans des cultures primaires de cellules musculaires de patients DM1 conduit à la dégradation de l’allèle

DMPK contenant les longues répétitions CUG, et ceci sans modifier l’expression de l’allèle

non muté (François et al., 2011).

- De même, l’équipe de Rick Wansink a montré qu’un oligonucléotide (CAG)7X modifié par des groupements 2’-O-méthyl-phosphorathioate diminue de 50% les transcrits

DMPK mutés dans des modèles cellulaires de la DM1. De plus, l’injection de cet

oligonucléotide dans le muscle de souris HSA^LR diminue la quantité de transcrits mutés et améliore l’épissage, prouvant le potentiel thérapeutique de cette approche (Mulders et al., 2009). Cependant, les mécanismes moléculaires entraînant la diminution du transcrit muté restent encore mal compris.

- Toujours en 2009, l’équipe de Charles Thornton a mis au point un oligonucléotide CAG25 de type morpholino qui inhibe la fixation de MBNL1 aux agrégats d’ARN CUG dans le modèle murin HSA^LR (Wheeler et al., 2009). Toutefois, l’incorporation de cette molécule nécessite une injection intramusculaire suivie d’une électroporation in vivo du muscle de souris. C’est pourquoi, de nombreuses équipes travaillent sur des modifications chimiques de ces oligonucléotides pour obtenir une meilleure pénétration tissulaire.

- Ainsi, en 2012, l’équipe de Charles Thornton a généré des oligonucléotides antisens dirigés contre les régions codantes et 3’UTR du gène hACTA1 (des souris HSA^LR) flanquant les répétitions CUG. Ces oligonucléotides antisens sont modifiés par des groupements 2’-O-méthoxyéthyle à ses extrémités, mais conservant une partie centrale non modifiée. Ce type d’oligonucléotide (gapmère) permet une dégradation des ARN cibles par la RNAse H. Cet oligonucléotide, injecté par voie sous-cutanée, dégrade l’ARN muté contenant les longues répétitions CUG, rétablit un épissage normal et guérit la myotonie dans un modèle murin (HSA^LR) de la DM1 (Wheeler et al., 2012).

- De même, l’équipe de Thomas Cooper a utilisé des oligonucléotides antisens CAG contenant à la fois des modifications phosphorothioates et LNA (« Locked Nucleic Acid ») ou 2’O-méthoxyéthyle qui induisent une dégradation de l’ARN toxique de façon RNAse H dépendante dans des modèles souris (EpA960/HSA-Cre) (Lee et al., 2012).

Tableau 5 : Stratégies visant à libérer MBNL1 des expansions CUG.



 

Diminution des foci nucléaires

Injection intramusculaire Libération de MBNL1

suivie d'électroporation des souris HSA^LR Correction des épissages

Correction de la myotonie

Diminution des foci

Cellules HeLa et souris HSALR Diminution de la liaison de MBNL1

Correction partielle des épissages

Lee et al., 2009a et 2009b

Molécules Pushechnikov et al., 2009

dérivés de kanamycine, néamines Myoblastes C2C12 et souris HSA^LR Diminution de la liaison de MBNL1/(C)CUG Gareiss et al., 2008

liés par des liaisons peptidiques Childs-Disney et al., 2012

Haghighat Jahromi et al., 2013

Diminution des foci nucléaires

Drosophile et souris HSALR Libération de MBNL1

Correction des épissages

Wheeler et al., 2009

García-López et al., 2011 Pentamidine

D amino-acide hexapeptide Morpholino CAG25

Stratégies Modèles d'études Résultats Références

Introduction : Chapitre I

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- Enfin, d’autres oligonucléotides antisens du transcrit DMPK et portant différentes modifications chimiques (PS et 2’-O-methyl ou morpholino phororodiamidate) ont été testés et diminuent la quantité d’ARNm DMPK muté indépendamment de l’action de la RNAse H dans des cellules DM1 en culture (Gonzalez-Barriga et al., 2013).