D ISCUSSION - Relations intercellulaires dans les îlots de Langerhans et leur rôle dans la sécr

L’ensemble de nos résultats indiquent que les cellules bêta sont essentielles pour la sé-crétion du glucagon. En effet, comme nous avons pu le constater, les agrégats cellulaires com-posés de cellules alpha ne sont pas capables de moduler leur sécrétion de glucagon sans la présence de cellules bêta, bien que plusieurs études aient proposé que le glucose soit capable d’agir seul pour réguler la sécrétion des cellules alpha (Ravier and Rutter 2005; Vieira, Salehi, and Gylfe 2007). En outre, le fait que nos agrégats alpha soient également composés de cellules delta et PP permet de suggérer que ces cellules n’ont pas d’impact sur la régulation de la sécré-tion du glucagon en contexte hypoglycémique. Toutefois, sachant que les cellules delta et PP sont capables d’inhiber la sécrétion du glucagon en condition hyperglycémique, il est possible que ces cellules aient pu avoir une influence sur les cellules alpha en inhibant la sécrétion du glucagon (Figure 3). D’autre part, le fait que la sécrétion du glucagon soit perturbée dans la condition où les cellules alpha et bêta ne peuvent pas entrer en contact laisse penser que les cellules alpha et bêta doivent établir des contacts cellulaires directs pour permettre la régulation de la sécrétion du glucagon (Figure 6C). Depuis peu, plusieurs études suggèrent que ce type de mécanisme, dépendant des contacts cellulaires spécifiques, est impliqué dans la régulation de la sécrétion hormonale du glucagon. Cette signalisation dite « juxtacrine » pourrait notamment impliquer différents types de molécules comme les E-cadhérines, les jonctions communicantes ou les récepteurs EphA présents sur les cellules alpha ainsi que leurs ligands, les EphrinA, présents sur les cellules bêta (Olofsson et al. 2009; Orci et al. 1975; Hutchens and Piston 2015).

Nos résultats sont aussi compatibles avec le fait que les médiateurs paracrines provenant des cellules bêta doivent être sécrétés à proximité des cellules alpha pour avoir leurs effets.

Nos expériences menées in vitro nous permettent également d’aborder l’importance du système nerveux central dans la régulation de la sécrétion du glucagon. En effet, en réponse à une baisse de la glycémie, le système nerveux autonome va activer différents effecteurs per-mettant aux cellules alpha de sécréter du glucagon (Evans et al. 2004; Borg et al. 1997). Con-trairement à ce qui a pu être rapporté dans certaines études (Miki et al. 2001), nous avons pu observer que les îlots de rats isolés ainsi que les agrégats cellulaires alpha-bêta sont capables de sécréter du glucagon en réponse à une baisse de la concentration en glucose et indépendam-ment de toute innervation. Ce résultat corrobore ce qui a pu être observé dans d’autres études

SECONDE ETUDE

autonome (Munoz et al. 2005; Gylfe and Gilon 2014). Toutefois, étant donné son importante contribution dans l’effet de contre-régulation de l’hypoglycémie, nous ne pouvons exclure que le système nerveux autonome intervienne à un autre niveau de régulation et contribue à la sé-crétion du glucagon notamment in vivo (Taborsky and Mundinger 2012).

L’hypothèse switch-off stipule qu’une baisse de la concentration d’insuline, combinée à une baisse de la glycémie, induit un signal permettant aux cellules alpha de sécréter du gluca-gon. Basé sur cette hypothèse, nous avons voulu perturber ce signal en ajoutant de l’insuline dans le milieu. Cette expérience nous a permis d’observer que la sécrétion du glucagon après hypoglycémie n’est pas perturbée après l’ajout de 0.1 μM d’insuline (Figure 4). Cette concen-tration est 1000x plus élevée que l’insulinémie maximale rencontrée chez des sujets sains, et pourrait correspondre à la concentration d’insuline trouvée à proximité des cellules alpha (Un-ger & Orci 2010). Ce n’est qu’à des concentrations d’insuline plus élevées (1 et 10 μM) que la sécrétion du glucagon est perturbée suggérant que l’insuline module la sécrétion du glucagon, et ce, indépendamment de la concentration en glucose dans le milieu (Figure 4). La théorie d’une régulation paracrine intra-îlots a été proposée la première fois par Samol et al. qui ont suggéré que l’insuline sécrétée par les cellules bêta est responsable de la régulation de la cellule alpha (Samols 1972). De nombreuses études ont par la suite démontré que l’insuline a un rôle fondamental comme régulateur de la sécrétion du glucagon (Raju and Cryer 2005; Hope et al.

2004; Kawamori et al. 2009). De plus, l’étude menée par Kawamori et al. a mis en évidence un rôle essentiel de l’insuline et de ses récepteurs dans la régulation de la sécrétion du glucagon que ce soit en conditions normo- et hypoglycémique (Kawamori et al. 2009). Par conséquent, pour déterminer l’implication de l’insuline dans cette régulation, nous avons souhaité bloquer les récepteurs à l’insuline à l’aide de l’antagoniste S961. L’utilisation de cet antagoniste n’a pas provoqué de diminution de la sécrétion du glucagon en réponse à l’hypoglycémie, et ce, quelles que soient les doses d’inhibiteurs utilisées (Figure 5). Il semble donc que l’insuline et ses ré-cepteurs ne soient pas impliqués dans la sécrétion du glucagon après l’hypoglycémie. Naturel-lement, ces résultats n’excluent pas que d’autres médiateurs paracrines tels que le zinc puissent être responsables de l’augmentation de la sécrétion du glucagon (Zhou et al. 2007; Solomou et al. 2015). Des expériences complémentaires sont nécessaires pour comprendre si un autre mé-diateur paracrine ou si un signal dépendant des contacts intercellulaires directs est impliqué dans cette régulation.

RÉGULATION DE LA SÉCRÉTION DU GLUCAGON PAR LES CELLULES BÊTA EN CONTEXTE HYPOGLYCÉMIQUE

Les expériences in vivo sont quant à elles venues confirmer ce que nous avions observé in vitro, à savoir que les cellules bêta sont essentielles à la réponse du glucagon lors d’un chal-lenge hypoglycémique. Nos résultats nous ont notamment permis d’observer que la réponse du glucagon est très différente entre les souris traitées à la STZ et celles traitées à la DT. Cette différence peut s’expliquer par le fait que les cellules bêta résiduelles présentes après le traite-ment à la STZ soient toujours capables d’assurer la régulation des cellules alpha leur permettant ainsi de sécréter du glucagon. En effet, la persistance de cellules bêta après le traitement à la STZ peut suffire à assurer la régulation de la sécrétion des cellules alpha (Damond et al. 2016).

Au contraire, lorsque la quasi-totalité des cellules bêta sont détruites (avec le traitement à la DT), on constate que la sécrétion du glucagon en réponse à l’hypoglycémie est fortement dimi-nuée voire inexistante. Ce résultat vient confirmer les résultats de Zhou et al. qui montrent une perte de la sécrétion du glucagon lors d’un test de tolérance à l’insuline chez des rats traités à la STZ (Zhou et al. 2004). Toutefois, contrairement à nous, ces auteurs montrent qu’un traite-ment à la STZ suffit pour bloquer la réponse de sécrétion du glucagon en condition hypoglycé-mique. Ceci peut s’expliquer par les doses de STZ utilisées ainsi que par la sensibilité de l’es-pèce animale. Cependant, aucune information n’est apportée sur le pourcentage de destruction des cellules bêta dans cette étude. Notre modèle avec les souris traitées à la DT montre une destruction quasi-totale des cellules bêta. L’inconvénient majeur de ce modèle est que la dose d’insuline administrée à ces souris pour les rendre hypoglycémiques est supérieure à celle des souris témoins. En effet, nous avons constaté une sorte de résistance ou d’insensibilité à l’insu-line chez ces souris traitées à la DT. Bien que nous n’ayons pas d’explications sur ce phéno-mène, nous supposons que la glycémie des souris traitées à la DT est tellement haute qu’une dose plus importante d’insuline est nécessaire pour que ces souris tombent en hypoglycémie.

D’autre part, il est possible que la DT injectée aux souris puisse avoir un effet délétère sur certains organes et notamment sur le foie. De façon intéressante, nous avons pu observer que malgré une réponse compromise du glucagon chez nos souris traitées à la DT, celles-ci ont toutefois réussi à remonter en glycémie à la fin de l’expérience suggérant que d’autres méca-nismes de régulations, comme le système nerveux autonome, aient pu avoir un rôle à jouer dans la contre-régulation de l’hypoglycémie.

En résumé, nos résultats in vitro montrent que la régulation de la sécrétion du glucagon en contexte hypo- et hyperglycémique est dépendante des cellules bêta et que cette régulation

SECONDE ETUDE

peut se faire indépendamment de la régulation par le système nerveux central. In vivo, contrai-rement aux souris possédant des cellules bêta résiduelles, nous avons pu observer que les souris ayant subi une destruction totale de leurs cellules bêta ont une sécrétion de glucagon altérée en réponse à une hypoglycémie, ce qui démontre l’importance des cellules bêta dans cette régula-tion. D’autre part, nous pensons que l’effet switch-off de l’insuline n’a pas un rôle important à jouer dans cette régulation, même si les expériences que nous avons menées sont insuffisantes pour le prouver. Il est évident que les mécanismes impliqués dans la régulation de la sécrétion du glucagon sont nombreux et complexes et que d’autres expériences sont nécessaires pour discriminer de manière plus précise comment ces différents mécanismes interviennent dans cette régulation. Il serait particulièrement intéressant de mieux déterminer comment les contacts cellulaires entre les cellules alpha et bêta régulent la sécrétion du glucagon. Comprendre par quels moyens les cellules bêta régulent la sécrétion du glucagon permettrait de développer de nouvelles thérapies pour les personnes diabétiques souffrant d’épisodes hypoglycémiques.

DISCUSSION GÉNÉRALE

DISCUSSIONGÉNÉRALE Les îlots de Langerhans sont des mini-organes complexes aussi bien au niveau de leur organisation cellulaire que de leur vascularisation (Bosco et al. 2010; El-Gohary et al. 2012).

Les îlots sont principalement composés de quatre types cellulaires différents : bêta, alpha, delta et PP, qui sécrètent respectivement l’insuline, le glucagon, la somatostatine et le PP. Le posi-tionnement de ces cellules au sein de l’îlot favorise différents types d’interactions cellulaires qui jouent un rôle fondamental dans la physiologie de l’îlot (Brereton et al. 2015; Kelly, McClenaghan, and Flatt 2011). Les interactions entre ces différentes hormones sont également possibles par les voies interstitielles et vasculaires se trouvant dans l’îlot (Samols and Stagner 1988; Caicedo 2013). Cependant, la majorité des études se sont focalisées sur les cellules alpha et bêta (essentielles au maintien de l’homéostasie du glucose) et peu d’études ont été menées sur le rôle des cellules delta et PP dans le fonctionnement de l’îlot. En effet, les principales connaissances sur les cellules delta et PP se résument par l’effet inhibiteur de la STT sur la sécrétion du glucagon et de l’insuline (Schuit, Derde, and Pipeleers 1989; Rutter 2009) et sur l’implication du PP dans la sensation de satiété (Batterham et al. 2003), la régulation des sécré-tions exocrines du pancréas (Morisset 2008; Putnam, Liddle, and Williams 1989) et probable-ment dans la régulation de la sécrétion du glucagon (Aragon et al. 2015).

Par conséquent, un des objectifs de cette thèse était d’étudier la localisation des cellules delta et PP par rapport à la vascularisation et aux autres cellules endocrines des îlots humains pour essayer de mieux comprendre le rôle de ces cellules dans le fonctionnement de l’îlot. Au cours de notre étude, nous avons observé que les cellules non-bêta (alpha, delta et PP) se trou-vent majoritairement au contact des vaisseaux sanguins. Contrairement aux cellules alpha uni-formément réparties entre les vaisseaux périphériques et ceux qui s’invaginent à l’intérieur de l’îlot, nous avons pu constater que les cellules delta et PP présentent une distribution asymé-trique et opposée, avec les cellules PP principalement situées aux bords des vaisseaux périphé-riques et les cellules delta situées aux bords des vaisseaux qui s’invaginent à l’intérieur de l’îlot.

D’autre part, nous avons également pu constater que la quantité de cellules delta présente dans les îlots est corrélée négativement avec la quantité de cellules PP. Cette différence de localisa-tion entre les cellules delta et PP n’avait jusque-là pas été constatée et les conséquences de cette organisation n’ont jusqu’à aujourd’hui pas été élucidées. Ces observations nous permettent de penser que cette organisation particulière permet aux cellules delta et PP d’avoir un impact sur les cellules environnantes de l’îlot mais également sur les vaisseaux sanguins qui bordent ces cellules.

DISCUSSION GÉNÉRALE

Concernant les cellules delta, plusieurs études s’accordent à dire que la STT a un effet inhibiteur sur la sécrétion de glucagon et d’insuline et que le dysfonctionnement des cellules delta pourrait avoir des répercussions importantes sur ces sécrétions hormonales (Hauge-Evans et al. 2009; Rutter 2009; Schuit, Derde, and Pipeleers 1989). D’un point de vue morphologique, il a été observé que les cellules delta présentent une structure semblable à celle des neurones avec des prolongements cytoplasmiques capables d’aller de la périphérie au centre de l’îlot (Baskin, Gorray, and Fujimoto 1984). Bien qu’il y ait peu de cellules delta dans l’îlot, il est probable que leurs prolongements cytoplasmiques leur donnent la possibilité d’interagir avec une proportion importante de cellules adjacentes alpha et bêta (Grube and Bohn 1983; Brereton et al. 2015). Par conséquent, il est possible que la STT fasse partie d’un réseau de communica-tion coordonné avec l’insuline et le glucagon pour réguler la glycémie de l’organisme. La proxi-mité des cellules delta avec les vaisseaux sanguins laissent également supposer que les signaux (hormones ou nutriments) provenant des vaisseaux sanguins vont être transmis des cellules delta aux cellules alpha et bêta pour réguler leurs sécrétions hormonales. Notamment, il a été proposé que l’augmentation de la concentration en glucose est responsable de la sécrétion de STT qui agit directement sur les cellules alpha pour inhiber la sécrétion de glucagon (Hauge-Evans et al. 2009). D’autre part, des études ont également mis en évidence que les cellules alpha et bêta expriment différents types de SSTR (Strowski et al. 2000; Kumar et al. 1999). Il serait donc intéressant de voir si les SSTR présents sur les cellules alpha et bêta diffèrent en fonction de leur localisation par rapport aux cellules delta. Au vu de ces différentes observations, il est essentiel de mieux comprendre le rôle des cellules delta dans le fonctionnement de l’îlot dans l’optique de créer de nouveaux traitements thérapeutiques capables de réguler les sécrétions d’insuline et de glucagon (Strowski et al. 2006; Bosnak et al. 2002).

Une étude récente a montré que les cellules alpha de rongeurs et humaines expriment un récepteur du polypeptide pancréatique (PPYR1) contrairement aux autres types cellulaires de l’îlot. Comme pour la STT, il a été constaté que la stimulation des cellules PP par le glucose augmente la sécrétion de polypeptide pancréatique, qui va aller inhiber la sécrétion du glucagon via les récepteurs PPYR1 (Aragon et al. 2015). Au vu de ces résultats et de la localisation des cellules PP dans l’îlot, il nous paraît cohérent que ces cellules se trouvent à proximité des cel-lules alpha. D’autre part, le fait que les celcel-lules PP soient capables d’agir sur les sécrétions exocrines pancréatiques (Putnam, Liddle, and Williams 1989; Morisset 2008) pourrait expli-quer que les cellules PP se trouvent principalement à proximité des vaisseaux sanguins et à la

DISCUSSIONGÉNÉRALE périphérie des îlots. De même, la localisation distincte des cellules delta par rapport aux cellules PP nous permet également de penser que les vaisseaux situés en périphérie et ceux situés à l’intérieur de l’îlot ont la possibilité de drainer différents cocktails hormonaux capables d’af-fecter le fonctionnement des cellules acineuses situées à proximité.

D’un point de vue structurel, un certain nombre d’études ont réussi à établir que l’archi-tecture des îlots influence de façon non négligeable les communications intercellulaires et par conséquent le fonctionnement de l’îlot (Brereton et al. 2015; Kelly, McClenaghan, and Flatt 2011). En effet, des anomalies structurelles ont été observées dans différents modèles de souris diabétiques ou obèses mais également dans des îlots humains issus de patients diabétiques de type 1 et 2 (Starich et al. 1991; Kim et al. 2009; Butler et al. 2003; Clark et al. 1988; Brereton et al. 2015). Ces anomalies auraient comme conséquence de perturber les interactions cellu-laires contribuant ainsi aux problèmes de dérégulations hormonales que l’on rencontre dans le diabète. Dans notre étude, nous n’avons constaté aucune différence entre l’architecture des îlots issus de patients diabétiques de type 2 et ceux issus de patients témoins, suggérant que les dé-régulations observées dans le diabète de type 2 ne s’expliqueraient pas par une désorganisation structurelle des îlots. Toutefois, notre analyse s’étant limitée à certains paramètres, il est néces-saire de pouvoir examiner d’autres échantillons pancréatiques provenant de patients diabétiques pour déterminer si un changement structurel a bien lieu dans ces îlots. Bien qu’il ne soit pas encore clairement établi que les cellules delta subissent des modifications dans le contexte du diabète, il a été observé que l’expression des SSTR est altérée dans ces îlots (Portela-Gomes et al. 2010). En effet, dans le cadre du diabète de type 2, les SSTR5 augmentent alors que les SSTR1 et SSTR4 ne sont plus présents sur les cellules alpha (Portela-Gomes et al. 2010). Par conséquent, il est possible qu’une modification des SSTR puisse contribuer aux dérégulations hormonales.

Bien que les cellules delta et PP aient été sous-estimées depuis plusieurs années, il est très probable que ces cellules soient impliquées dans la régulation des sécrétions hormonales de l’insuline et du glucagon et que leur localisation ainsi que leurs interactions avec les autres cellules de l’îlot soient cruciales dans le maintien de ces régulations hormonales. D’autres études sont par conséquent nécessaires pour comprendre le rôle de ces cellules, aussi bien au niveau de l’îlot que du parenchyme exocrine. D’autre part, il est nécessaire que les futures stra-tégies thérapeutiques contre le diabète prennent en compte aussi bien l’aspect structurel que

DISCUSSION GÉNÉRALE

fonctionnel des cellules afin de rétablir au mieux les échanges, ou les communications intercel-lulaires et d’optimiser la régulation des sécrétions hormonales.

Comme nous l’avons déjà dit, les relations intercellulaires au sein de l’îlot sont des élé-ments clés pour la régulation de la sécrétion des diverses hormones de l’îlot. Les cellules de l’îlot sont notamment capables d’agir sur leur propre sécrétion via des régulations autocrines mais également d’agir sur les cellules adjacentes en sécrétant des facteurs paracrines (Caicedo 2013). À ces régulations, s’ajoutent également les signaux émis par le système nerveux ainsi que les hormones et nutriments apportés par la circulation sanguine. L’ensemble de ces régula-tions forme un réseau complexe de communicarégula-tions capable de moduler précisément les sécré-tions hormonales de l’îlot et ainsi d’assurer le maintien de la glycémie.

Le diabète se caractérise généralement par un manque ou un défaut d’utilisation de l’in-suline. Toutefois, ces dernières années, de nombreuses études ont pu mettre en évidence un dysfonctionnement des cellules alpha dans cette pathologie. Ces nouvelles observations ont permis de considérer le diabète comme une maladie « bi-hormonale », d’une part à cause de la perte de la sécrétion d’insuline et d’autre part, à cause de l’altération de la sécrétion du gluca-gon. En effet, on observe un excès de sécrétion du glucagon en hyperglycémie chronique ainsi que la perte de sécrétion du glucagon en condition hypoglycémique. Ce défaut de contre-régu-lation de l’hypoglycémie est un problème majeur pour les patients diabétiques de type 1 traités par insulinothérapie, et jusqu’à aujourd’hui les causes exactes de cette dérégulation n’ont pas été élucidées (Cryer 2008). Parmi les éléments capables de moduler la sécrétion du glucagon, de nombreuses études ont établi que des facteurs paracrines sécrétés par les cellules bêta (insu-line, GABA, Zn²⁺) pouvaient être impliqués dans la régulation de la sécrétion du glucagon (Gromada, Franklin, and Wollheim 2007). Les régulations intervenant au sein de l’îlot (intrin-sèques ou extrin(intrin-sèques) pour moduler les sécrétions hormonales sont complexes et trouver des modèles expérimentaux capables de mieux discriminer ces différentes interactions est un réel

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