Animaux :
Pour réaliser les expériences in vitro, des rats mâles Sprague Dawley de 200-250 g provenant de chez Janvier Labs (Le Genest-Saint-Isle, France) ont été utilisés. Concernant la partie in vivo de cette étude, des souris mâles SCID et NSG-RIP-DTR de 10 semaines ont été utilisées. Les souris NSG-RIP-DTR ont été généreusement fournies par le Prof. Herrera (Département de médecine génétique et de développement, Centre Médical Universitaire, Genève). Les souris SCID proviennent quant à elles de chez Janvier Labs. Les animaux ont été hébergés dans des conditions respectant des cycles lumière/obscurité de 12 h avec un libre accès à l’eau et à la nourriture, et utilisés en expérimentation selon les directives de la Direction Générale de la Santé de l’état de Genève.
Isolement et culture des îlots :
Pour isoler les îlots, des pancréas de rats ont été perfusés avec de la collagénase de type V (Sigma, C9263, Buchs, Suisse) à une concentration de 1 mg/ml. Les îlots ont été séparés du tissu exocrine en réalisant un gradient de densité de Ficoll (Sigma, Buchs, Suisse). Après plu-sieurs lavages, les îlots ont été cultivés à 37°C dans des pétris avec du milieu DMEM (Gibco, 11966, Bâle, Suisse) (supplémenté avec 11.2 mM de glucose, du fœtal calf serum (FCS) à 10%, du sodium pyruvate à 1 mM, des antibiotiques (pénicilline-streptomycine) et de la glutamine).
Le milieu des îlots a été renouvelé après 1 et 3 jours.
Préparation et purification des cellules d’îlots :
Pour dissocier les îlots en cellules, les îlots ont été lavés deux fois avec du phosphate buffer saline (PBS) avant d’être re-suspendus dans de la trypsine-EDTA 0.05% (Gibco, 25300-054, Bâle, Suisse) et incubés pendant 4 min à 37°C avec une re-suspension des cellules toutes les 30 sec. Quand la dissociation s’est avérée complète, les cellules ont été diluées dans du Krebs-Ringer bicarbonate buffer froid (KRB : 125 mM NaCl, 4.74 mM KCL, 1 mM CaCl2, 1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 5 mM NaHCO3, 25 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique (HEPES), 0.5% bovine serum albumin (BSA), pH 7.4 et supplémenté avec
SECONDE ETUDE
2.8 mM glucose) avant d’être triées en utilisant un cytomètre de flux (Biorad S3). Le tri cellu-laire a été effectué en se basant d’une part sur la taille des cellules et d’autre part, par rapport à l’autofluorescence des cellules bêta (grâce à la flavine adénine dinucléotide (FAD) et le nicoti-namide adénine dinucléotide phosphate (NADP)). Cette méthode de tri permet d’obtenir deux populations cellulaires : une population cellulaire bêta et une seconde dite « non-bêta ».
Réagrégation des cellules d’îlots :
Une fois triées, les cellules non-bêta, les cellules bêta et un mélange de ces deux types cellu-laires (ratio 1:3, alpha:bêta) ont été disposées dans des microplaques d’agarose constituées de 256 puits (Sigma, Z764000-6EA, Buchs, Suisse). Les cellules présentes dans les microplaques d’agarose ont été immergées dans le même milieu que celui utilisé pour les îlots de rats. Le milieu a été renouvelé après 1 et 3 jours.
Test de sécrétion de glucagon :
La veille du test de sécrétion, les îlots et les agrégats cellulaires ont été incubés dans des
« transwells » (Millipore, PIXP01250, Zug, Suisse) contenant 800μl de milieu. Le jour de l’ex-périence, les îlots ou agrégats cellulaires ont été pré-incubés dans du milieu DMEM supplé-menté avec 11.2 mM de glucose, du sodium pyruvate et de l’HEPES (dépourvus de FCS, mais supplémenté avec 0.1% de BSA) pendant 1 h à 37°C, puis ont été successivement incubés pen-dant 1 h à 37°C dans des milieux contenant des concentrations décroissantes (11.2, 5.6 et 1 mM) ou croissantes (5.6, 11.2 et 16.7 mM) de glucose. Ces incubations ont été effectuées en absence ou en présence d’insuline (0.1, 0.5, 1, 5 ou 10 μM) (Novorapid, Novo Nordisk, Dane-mark) ou d’un antagoniste des récepteurs à l’insuline, le S961 (0.1, 0.5 ou 1 μM) (Novo Nor-disk, Danemark). À la fin de l’expérience, les agrégats cellulaires ainsi que les îlots ont été immergés dans de l’acide éthanol. Les surnageants de chaque condition ont été centrifugés (à 1200 rpm, 5 min) puis stockés à -20°C en attente des analyses. La quantité de glucagon sécrétée par les îlots et les agrégats cellulaires a été mesurée par enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Mercodia Glucagon, 10-1271-01, Uppsala, Suède) et exprimée en pourcentage par rapport au contenu total de l’hormone présent dans les îlots ou les agrégats.
RÉGULATION DE LA SÉCRÉTION DU GLUCAGON PAR LES CELLULES BÊTA EN CONTEXTE HYPOGLYCÉMIQUE
Traitements à la streptozotocine et à la toxine diphtérique :
Chez les souris SCID, le diabète a été induit par une injection intrapéritonéale (i.p.) de strepto-zotocine (STZ) (Sigma, S0130, Buchs, Suisse) à une dose de 200 mg/kg. Après l’injection de STZ, la glycémie a été mesurée tous les jours et les souris ont été considérées comme diabé-tiques lorsque leur glycémie dépassait les 16 mM de glucose sur deux mesures consécutives.
Les animaux ne développant pas de diabète dans les deux jours suivant l’injection ont été réin-jectés avec la même dose de STZ. Concernant les souris NSG-RIP-DTR, le diabète a été induit par trois injections i.p. successives de toxine diphtérique (ou DT pour « Diphteria Toxin ») (Sigma, D0564, Buchs, Suisse) (au jour 0, 3 et 4), contenant chacune 126 ng de DT dilués dans 200 μl de NaCl 0.9%. Après la première injection de DT, la glycémie a été mesurée tous les jours et les souris ont été considérées comme diabétiques lorsque leur glycémie dépassait les 16 mM de glucose sur deux mesures consécutives.
Tests de tolérance à l’insuline par voie intraveineuse :
Les tests de tolérance à l’insuline (ou IVITT pour « intravenous insulin tolerance test ») ont été réalisés sur des souris SCID témoins et des souris SCID traitées à la STZ préalablement mises à jeun pendant 6 h. Chaque souris a reçu une dose d’insuline de 0.75 U/kg (Novorapid, Novo Nordisk, Bagsvaerd, Danemark) par voie intraveineuse (i.v.) dans la veine caudale. Des prélè-vements de sang ont été effectués au niveau de la veine caudale avant injection (0 min) et à 10, 15, 20, 30 et 120 min après l’injection d’insuline pour doser le glucagon et le C-peptide par ELISA (Mercodia glucagon – 10μl, 10-1281-01, Uppsala, Suède ; Crystal Chem, mouse C-peptide, 90050, Zaandam, Pays-Bas). La glycémie a également été mesurée à partir du sang de la veine caudale à l’aide d’un glycomètre (Abbott, Freestyle Precision neo, Baar, Suisse) à des intervalles réguliers de 5 min pendant les 60 premières min de l’expérience, puis espacé toutes les 10 min jusqu’à la fin de l’expérience. Le même protocole a été appliqué pour les souris NSG-RIP-DTR témoins et celles traitées à la DT, excepté que les doses d’insuline injectées chez ces souris étaient de 0.75 U/kg chez les souris témoins et de 6 U/kg chez les souris traitées à la DT. Les échantillons de sang ont été prélevés en fonction de valeurs glycémiques des souris et non en fonction du temps c’est-à-dire avant l’injection d’insuline (0 min), puis après l’injec-tion à différents intervalles glycémiques ([5-4.5] ; [4.5-3.5] ; [3.5-3] ; [3-2.5] mM de glucose) et à la fin de l’expérience (150 min). Toutes les souris ont été sacrifiées à la fin de chaque
SECONDE ETUDE
expérience et leurs pancréas prélevés pour analyser la destruction des cellules bêta dans les îlots par immunofluorescence.
Immunofluorescence sur les agrégats cellulaires :
Après fixation dans du formol 10% pendant 20 min, les agrégats cellulaires ont été rincés trois fois avec du PBS avant d’être incubés dans du PBS-0.1% azide puis stockés à 4°C avant le marquage par immunofluorescence. Pour ce faire, les agrégats ont été perméabilisés avec du PBS-0.5% triton pendant 2 h à température ambiante avant d’être incubés pendant 24 h à 4°C avec différentes combinaisons d’anticorps primaires dirigés contre l’insuline (cochon d’Inde anti-insuline dilué à 1/200 ; Dako A564, Carpinteria, États-Unis), le glucagon (souris anti-glu-cagon dilué à 1/4000 ; Sigma, G2654, St. Louis, États-Unis), le PP (lapin anti-PP dilué à 1/200 ; Dako A619) et la somatostatine (lapin anti-somatostatine diluée à 1/200 ; Dako A566). Après un lavage d’1 h dans du PBS-0.1% BSA, les agrégats ont été incubés overnight à 4°C avec une combinaison adéquate d’anticorps secondaires : anti-cochon d’Inde couplé à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (Jackson Immunoresearch Laboratories, 706-095-148, Rheinfelden, Suisse), anti-lapin couplé à l’aminiméthylcoumarine (AMCA) (Jackson Immunoresearch La-boratories, 711-155-152) et anti-souris couplé à la rhodamine (Jackson Immunoresearch Labo-ratories, 715-025-150), tous dilués à 1/200. Après lavage, les agrégats cellulaires ont été placés dans des pétris contenant du PBS-0.1% BSA pour l’analyse au microscope confocal Nikon A1R. Le logiciel NIS a été utilisé pour la prise d’images et la reconstruction en 3D des agrégats.
Histologie et immunofluorescence sur les pancréas de souris :
Les pancréas de souris ont été fixés dans du formol 10% pendant 24-48 h avant d’être lavés au PBS, déshydratés puis enrobés en paraffine. Des sections de 10 μm ont été réalisées à trois endroits différents du pancréas. Les coupes de pancréas ont été perméabilisées à l’aide de PBS-0.5% triton pendant 5 min avant d’être incubées pendant 2 h à 37°C avec des anticorps primaires dirigés contre l’insuline (cochon d’Inde anti-insuline dilué à 1/200 ; Dako, A564) et le glucagon (souris anti-glucagon humain dilué à 1/4000 ; Sigma, G2654). Les coupes ont été lavées trois fois avec du PBS-0.1% BSA et incubées pendant 1h à 37°C avec les anticorps secondaires suivants : anti-cochon d’Inde couplé au FITC (Jackson Immunoresearch Laboratories, 106-095-003) dilué à 1/400 et anti-souris couplé à la rhodamine (Jackson Immunoresearch Laboratories,
RÉGULATION DE LA SÉCRÉTION DU GLUCAGON PAR LES CELLULES BÊTA EN CONTEXTE HYPOGLYCÉMIQUE
715-025-150) dilué à 1/200. Après rinçage, du milieu de montage composé de glycérol et p-phenylenediamine (Sigma, P6001, Buchs, Suisse) a été utilisé pour les coupes.
Estimation de la viabilité cellulaire :
Pour estimer la viabilité cellulaire, les agrégats cellulaires ont été immergés dans une solution de fluorescein diacetate (FDA : Sigma F7378, Buchs, Suisse) et propidium iodide (PI : Sigma P4170, Buchs, Suisse). Le marquage permet d’identifier les cellules viables (FDA : vert) et non-viables (PI : rouge).
Statistiques :
L’ensemble des résultats présentent la moyenne ± l’erreur standard à la moyenne (SEM) avec
*p <0,05, **p <0,01 et ***p <0,001 et ****p <0,0001. Les différences sont dites significatives si p <0,05. Le logiciel GraphPad Prism 7 a été utilisé pour analyser les résultats et calculer les valeurs p. Les tests statistiques utilisés sont indiqués dans la légende des figures.