Formation d’agrégats à partir de cellules d’îlots
Pour étudier l’importance des cellules bêta dans la réponse au glucagon lors d’hypogly-cémies, nous avons décidés de développer un modèle in vitro nous permettant de tester des îlots de rats ainsi que différents types d’agrégats cellulaires en les soumettant à un test d’incubation statique conçu pour mimer les conditions hypoglycémiques. Pour former des agrégats cellu-laires, nous avons utilisé des microplaques d’agarose composées de 256 micropuits (diamètre des puits : ≈ 400 μm) dans lesquelles nous avons incubé des cellules isolées (300 000 cel-lules/190 μl ou 100 000 celcel-lules/190 μl). Rapidement les cellules sédimentent en se répartissant de façon homogène dans les puits (Figure 1A, jour 0). Après quelques heures, les cellules com-mencent à se réagréger et après 2 jours on observe le plus souvent un seul agrégat par puits
SECONDE ETUDE
composé de cellules faiblement adhérentes entre elles (Figure 1A, jour 2). Après 4 jours, l’ad-hésion entre les cellules se renforce, laissant apparaitre au centre du puits un agrégat compact d’un diamètre de 100-150 Pm, ressemblant à un îlot de taille moyenne (Figure 1A, jour 4). Pour estimer la viabilité des cellules dans ces agrégats, un marquage FDA/PI a été réalisé sur des agrégats formés après 4 jours. Comme illustré dans la Figure 1B, peu de cellules sont marquées en rouge (cellules mortes), la très grande majorité étant verte, donc viable. Les cellules mortes sont essentiellement à la périphérie de l’agrégat et semblent se détacher de celui-ci. En résumé, l’utilisation des microplaques d’agarose permet une réagrégation rapide des cellules et préserve la viabilité de celles-ci.
Formation d’agrégats à partir de cellules d’îlots purifiées
Les cellules d’îlots de rat ont été triées par cytométrie de flux. Cette technique de tri repose sur les différences de taille et d’autofluorescence des différents types cellulaires de l’îlot.
Elle permet de trier efficacement les cellules bêta des cellules non-bêta mais ne peut pas séparer les cellules alpha des cellules delta et PP. Nous avons donc obtenu deux populations, l’une composée à 99% de cellules bêta et de 1% de cellules alpha (cette population sera appelée bêta), et la seconde composée majoritairement de cellules alpha (63%), mais également de cellules PP (16%), de cellules delta (17%) et de cellules bêta (4%) (cette seconde population sera appe-lée alpha) (Figure 2A). À partir de ces deux populations cellulaires et en utilisant le technique des microplaques décrite ci-dessus, nous avons composé trois types d’agrégats cellulaires dif-férents : des agrégats composés d’un mélange de cellules alpha-bêta (ratio 1:3), des agrégats composés uniquement de cellules alpha ou uniquement de cellules bêta. L’observation au mi-croscope confocal confirme la composition attendue de ces différents types d’agrégats cellu-laires (Figure 2B).
Perte de la régulation de la sécrétion du glucagon par le glucose dans les agrégats cellu-laire alpha
Dans un premier temps, nous avons cherché à étudier la sécrétion du glucagon des agré-gats alpha lors d’une augmentation de la concentration de glucose en passant de 5.6 à 11.2 puis à 16.7 mM. Les îlots de rat, utilisés comme témoin, diminuent leur sécrétion de glucagon de 2.37 ± 0.20 à 0.78 ± 0.36 % en passant de 5.6 à 16.7 mM de glucose (Figure 3). Par contre, les
RÉGULATION DE LA SÉCRÉTION DU GLUCAGON PAR LES CELLULES BÊTA EN CONTEXTE HYPOGLYCÉMIQUE
agrégats cellulaires alpha soumis aux mêmes variations de glucose ne modifient pas leur sécré-tion de glucagon (Figure 3). Dans un deuxième temps, la sécrésécré-tion du glucagon a été étudiée en réponse à une baisse de glucose en passant de 11.2 à 5.6 et à 1 mM. La comparaison a été effectuée entre les agrégats alpha et les îlots, comme pour la sécrétion en réponse à une hyper-glycémie décrite ci-dessus. Nous avons ainsi observé que la sécrétion du glucagon des îlots augmente de 3-4 fois en passant de 5.6 à 1 mM glucose (Figure 6A) ; par contre, la sécrétion du glucagon des cellules alpha, étudiée dans les mêmes conditions, ne change pas (Figure 6D).
En résumé, les agrégats alpha, contrairement aux îlots, ne répondent ni à une élévation, ni à une baisse de la concentration de glucose.
Rôle de l’insuline dans la sécrétion du glucagon en réponse à une augmentation du glucose L’insuline est certainement un des principaux facteurs provenant des cellules bêta et pouvant être impliqué dans la régulation de la sécrétion du glucagon. Afin de déterminer si la perte de la baisse de sécrétion du glucagon par les agrégats alpha en réponse au glucose (Figure 3) est due à une absence de sécrétion d’insuline, des expériences ont été répétées dans les mêmes conditions mais en présence de doses croissantes d’insuline exogène ajoutée dans les milieux de stimulation (Figure 3, à droite). Bien qu’on observe une légère diminution de la sécrétion du glucagon en passant de 5.6 à 16.7 mM glucose, cette baisse (non significative) est incomparable à celle observée avec les îlots. Ces expériences suggèrent que des mécanismes, autres que la sécrétion d’insuline, sont impliqués dans la baisse de la sécrétion du glucagon.
Rôle de l’insuline dans l’augmentation de la sécrétion du glucagon en réponse à une dimi-nution du glucose
L’augmentation de la sécrétion du glucagon après une baisse du glucose pourrait être médiée par une baisse de la sécrétion d’insuline (effet switch-off) (Banarer, McGregor, and Cryer 2002; Zhou et al. 2004). Afin de vérifier cette hypothèse in vitro, nous avons utilisé des îlots isolés de rat et nous les avons soumis à un test de sécrétion en variant la concentration de glucose de 11.2 à 5.6 et à 1 mM. Dans ces conditions, la sécrétion de glucagon ne varie pas de façon significative entre 11.2 et 5.6 mM, mais augmente entre 5.6 et 1 mM (Figure 4). Pour essayer d’inhiber l’effet switch-off (baisse de l’insuline), cette expérience est répétée en ajoutant
SECONDE ETUDE
dans le milieu de stimulation des concentrations croissantes d’insuline pour tamponner les va-riations d’insuline dans le milieu. En présence de 0.1 μM d’insuline (concentration 1000x plus élevée que l’insulinémie maximale chez l’homme), nous observons qu’une baisse du glucose de 5.6 à 1 mM est toujours capable d’augmenter la sécrétion du glucagon. Ce n’est qu’en pré-sence de concentrations d’insuline encore plus élevées (1 et 10 PM) que nous observons une perte de la sécrétion du glucagon (Figure 4).
Un autre moyen d’inhiber les effets de l’insuline est d’agir sur les récepteurs à l’insuline qui peuvent être impliqués dans cette régulation (Kawamori et al. 2009). Nous avons réalisé le même test que précédemment mais avec des concentrations croissantes d’un antagoniste spéci-fique aux récepteurs de l’insuline, le S961. À toutes les concentrations de S961 utilisées (0.1, 0.5 et 1 μM), la sécrétion de glucagon augmente en passant de 5.6 à 1 mM de glucose comme dans la condition témoin (Figure 5). On constate également que les doses les plus élevées de S961 ont tendance à augmenter la sécrétion globale du glucagon en réponse aux différentes concentrations de glucose (Figure 5), ce qui peut être expliqué par un effet inhibiteur de l’insu-line sur la sécrétion du glucagon. En résumé, l’ensemble de ces résultats in vitro ne permettent pas de conclure que l’insuline au sein de l’îlot soit impliquée dans l’augmentation de la sécré-tion du glucagon lors d’une hypoglycémie.
Importance des cellules bêta pour la sécrétion du glucagon
Afin de confirmer que la présence des cellules bêta est importante pour la sécrétion du glucagon en hypoglycémie, des cellules alpha purifiées ont été mélangées avec des cellules bêta purifiées (ratio 1:3) pour former des agrégats alpha-bêta, et leur sécrétion a été étudiée en ré-ponse à une baisse de glucose de 11.2 à 5.6 et à 1 mM. Nous avons ainsi pu observer que la sécrétion de glucagon augmente de façon identique à celle des îlots en passant de 5.6 à 1 mM de glucose (Figure 6B). Afin de vérifier si les contacts directs entre les cellules alpha et les cellules bêta sont impliqués dans la régulation de la sécrétion du glucagon, des agrégats alpha ont été séparés des agrégats bêta, en utilisant des « transwells » (absence de contact direct).
Dans ces conditions, aucune sécrétion de glucagon en réponse à une baisse de glucose n’est observée (Figure 6C). Ces expériences suggèrent que les cellules bêta peuvent réguler la sécré-tion du glucagon en réponse à une hypoglycémie, mais seulement si les cellules bêta ont des contacts directs avec les cellules alpha.
RÉGULATION DE LA SÉCRÉTION DU GLUCAGON PAR LES CELLULES BÊTA EN CONTEXTE HYPOGLYCÉMIQUE
Rôle des cellules bêta dans la sécrétion du glucagon in vivo en réponse à l’hypoglycémie : modèle des souris traitées à la streptozotocine
Nous avons voulu déterminer l’importance des cellules bêta dans la régulation de la sécrétion du glucagon en contexte hypoglycémique in vivo. Pour cela, nous avons traité des souris SCID* par injection i.p. de STZ (200 mg/kg). Ce traitement est connu pour permettre la destruction de 80-90% des cellules bêta. Les analyses histologiques et les marquages par im-munofluorescence que nous avons effectués confirment que beaucoup de cellules bêta sont dé-truites dans les îlots (Figure 7A). Les îlots sont essentiellement composés de cellules alpha, peu de cellules bêta (Figure 7A) et de rares cellules delta et PP (non montré). Après l’injection de STZ, les souris diabétiques sont passées d’une glycémie de 6.6 ± 0.2 à 20.3 ± 0.7 mM en 7 jours (Figure 7B). Après 6 h de mise à jeun, une dose d’insuline (0.75 U/kg) a été injectée à des souris témoins (non traitées à la STZ) et aux souris traitées à la STZ. Ces injections ont permis de faire descendre rapidement les glycémies de ces souris à des seuils relativement bas (2.4 ± 0.3 mM pour les souris témoins et 1.4 ± 0.5 mM pour les souris traitées à la STZ) (Figure 7D). Les glycémies sont remontées au bout de 70 min pour les souris diabétiques et 30 min pour les souris témoins (Figure 7D). Avant l’injection d’insuline, le taux de glucagon (glucagonémie), mesuré à partir de sang prélevé au niveau de la queue, est légèrement plus élevé chez les souris traitées à la STZ (10.32 ± 2.23 pM) que chez les souris témoins (4.02 ± 1.3 pM) (Figure 7C).
Après l’injection d’insuline, nous pouvons observer que la glucagonémie est relativement com-parable entre les souris témoins et les souris traitées à la STZ. La glucagonémie maximale est de 55.5 ± 5.0 pM pour les souris témoins et de 64.5 ± 12.3 pM pour les souris traitées à la STZ (Figure 7C). Chez les souris témoins, la baisse du C-peptide (co-sécrété avec l’insuline par les cellules bêta) est corrélé, comme attendu, à la baisse de la glycémie et passe de 1.3 ± 0.12 à 0.15 ± 0.07 ng/ml entre 0 et 30 min. Chez les souris traitées à la STZ, le niveau de C-peptide est initialement bas et continue de diminuer graduellement au cours du temps (0.256 ± 0.086 à 0.048 ± 0.016 ng/ml entre 0 et 30 min) (Figure 7E). Ces résultats montrent qu’une destruction importante (80 %), mais pas totale de cellules bêta est suffisante pour induire un diabète mais insuffisante pour affecter la sécrétion du glucagon en réponse à une hypoglycémie.
* Nous avons utilisé des souris immunodéficientes SCID afin de pouvoir utiliser ces souris dans des expériences futures de transplantation avec des cellules d’îlots humains.
SECONDE ETUDE
Rôle des cellules bêta dans la sécrétion du glucagon in vivo en réponse à l’hypoglycémie : modèle des souris traitées à la toxine diphtérique
La destruction des cellules bêta étant partielle avec le traitement à la STZ, nous avons décidé d’utiliser un modèle de souris conçu pour obtenir une ablation quasi totale de leurs cel-lules bêta. Il s’agit de souris NSG-RIP-DTR*, souris immunodéficientes NSG, génétiquement modifiées pour exprimer le récepteur à la toxine diphtérique humaine (DTR) sous le contrôle du promoteur de l’insuline de rat (RIP). Pour obtenir l’ablation totale des cellules bêta, les souris ont reçu trois injections successives de toxine diphtérique. Les analyses histologiques et les marquages par immunofluorescence que nous avons effectués confirment que la quasi-totalité des cellules bêta sont détruites dans les îlots (Figure 8A). Les îlots sont composés de cellules alpha et de rares cellules bêta (Figure 8A). Après la première injection de DT, les souris de-viennent rapidement diabétiques en passant d’une glycémie de 8.4 ± 0.3 à 29.7 ± 0.4 mM en 6 jours (Figure 8B). Au 7ème jour, une dose d’insuline de 0.75 U/kg a été injectée aux souris témoins et une dose de 6 U/kg a été injectée aux souris traitées à la DT leur permettant d’at-teindre des seuils glycémiques relativement bas (2.5 ± 0.93 mM pour les souris témoins et 3.93
± 0.5 mM pour les souris traitées à la DT) (Figure 8D). Avant l’injection d’insuline, la gluca-gonémie est légèrement plus élevée chez les souris traitées à la DT (6.3 ± 0.65 pM) que chez les souris témoins (3.2 ± 1.28 pM). Contrairement aux expériences avec les souris traitées à la STZ, nous pouvons observer une importante différence de glucagonémie entre les souris té-moins et les souris traitées à la DT. En effet, on observe une élévation maximale de la glucago-némie à 93.7 ± 38.5 pM chez les souris témoins, alors que la glucagoglucago-némie reste basse avec un maximum de 7.6 ± 2.01 pM pour les souris traitées à la DT (Figure 8C). Chez les souris témoins, la baisse du C-peptide est corrélée à la baisse de la glycémie et passe d’un maximum de 1.7 ± 0.26 ng/ml à un minimum de 0.1 ± 0.04 ng/ml alors que chez les souris traitées à la DT, le niveau de C-peptide est quasi indétectable (à T = 0 min, 0.05 ± 0.021 ng/ml) tout le long de l’expérience (Figure 8E). Ces résultats montrent qu’une destruction quasi totale des cellules bêta inhibe la sécrétion du glucagon en réponse à une hypoglycémie.
*Nous avons utilisé des souris immunodéficientes NSG-RIP-DTR afin de pouvoir utiliser ces souris dans des expériences futures de transplantation avec des cellules d’îlots humains.
RÉGULATION DE LA SÉCRÉTION DU GLUCAGON PAR LES CELLULES BÊTA EN CONTEXTE HYPOGLYCÉMIQUE
Figure 1 : Formation des agrégats cellulaires in vitro et détermination de la viabilité cellulaire.
(A) Images en contraste de phase et représentatives de l’évolution de la formation des agrégats cellu-laires à partir de cellulesd’îlots de rat. Les images ont été prises aux jours 0, 2 et 4 à deux grossissements différents. (B) Images en contraste de phase (en haut) et en fluorescence (en bas) des agrégats cellulaires au jour 4, après un marquage avec du FDA/PI ; FDA : vert = cellules viables, et PI : rouge = cellules mortes.
SECONDE ETUDE
Figure 2 : Composition cellulaire des agrégats.
(A) Les cellules de rat dissociées ont été triées par cytométrie de flux permettant l’obtention de deux populations cellulaires. Après le tri, un échantillon de cellules de chaque population (cellules alpha et cellules bêta) a été analysé par immunofluorescence pour estimer sa composition cellulaire. Les co-lonnes montrent les fréquences relatives de chaque type cellulaire dans ces deux populations, pour une expérience représentative (n=4). La population cellulaire bêta est composée à 99% de cellules bêta et de 1% de cellules alpha et la population cellulaire dite alpha est majoritairement composée de cellules alpha (63%) mais aussi de cellules delta (17%), PP (16%) et bêta (4%). (B) Analyse par microscope confocal et reconstruction partielle en 3D des différents types d’agrégats cellulaires. Les cellules ont été marquées par immunofluorescence pour l’insuline (vert), le glucagon (rouge) et le PP (bleu).
RÉGULATION DE LA SÉCRÉTION DU GLUCAGON PAR LES CELLULES BÊTA EN CONTEXTE HYPOGLYCÉMIQUE
Figure 3 : Rôle des cellules bêta et de l’insuline dans la baisse de la sécrétion du glucagon induite par le glucose.
Les îlots de rat et les agrégats alpha ont été incubés successivement à 5.6, 11.2 et 16.7 mM de glucose en absence ou en présence des concentrations d’insuline indiquées. Le glucagon sécrété a été mesuré par ELISA et est exprimé en % du contenu. Les résultats sont représentés sous la forme de la moyenne
± SEM, n = 4 pour chaque groupe avec *p <0,05, **p <0,01 et ***p <0,001. Analysé avec un test de Student. N.S. : non significatif.
SECONDE ETUDE
Figure 4 : Rôle de l’insuline sur la sécrétion du glucagon en condition hypoglycémique.
Les îlots de rat ont été incubés successivement à 11.2, 5.6 et 1 mM de glucose, en absence ou en présence des concentrations d’insuline indiquées. Le glucagon sécrété a été mesuré par ELISA et est exprimé en
% du contenu. Les résultats sont représentés sous la forme de la moyenne ± SEM, n = 3 avec *p <0,05,
**p <0,01, ***p <0,001 et p**** <0,0001. Analysé avec un test ANOVA. N.S. : non significatif.
RÉGULATION DE LA SÉCRÉTION DU GLUCAGON PAR LES CELLULES BÊTA EN CONTEXTE HYPOGLYCÉMIQUE
Figure 5 : Rôle de l’antagoniste des récepteurs à l’insuline S961 sur la sécrétion du glucagon en condition hypoglycémique.
Les îlots de rat ont été incubés successivement à 11.2, 5.6 et 1 mM de glucose, en absence ou en présence des concentrations de S961 indiquées. Le glucagon sécrété a été mesuré par ELISA et est exprimé en % du contenu. Les résultats sont représentés sous la forme de la moyenne ± SEM, n = 3 avec *p <0,05,
**p <0,01 et ***p <0,001. Analysé avec un test ANOVA et un test de Student.
SECONDE ETUDE
Figure 6 : Rôle des contacts intercellulaires entre les cellules alpha et bêta dans la sécrétion du glucagon en condition hypoglycémique.
Les îlots (A), les agrégats alpha-bêta (B), les agrégats alpha + agrégats bêta (C) et les agrégats alpha (D) ont été incubés à 11.2, 5.6 et 1 mM de glucose. Le glucagon sécrété a été mesuré par ELISA et est exprimé en % du contenu. Les résultats sont représentés sous la forme de la moyenne ± SEM, n = 8 pour les îlots et n = 4 pour les autres groupes, avec *p <0,05, **p <0,01 et ***p <0,001 et ****p < 0,0001.
Analysé avec un test de Student.
RÉGULATION DE LA SÉCRÉTION DU GLUCAGON PAR LES CELLULES BÊTA EN CONTEXTE HYPOGLYCÉMIQUE
SECONDE ETUDE
Figure 7 : Comparaison de la sécrétion du glucagon en réponse à l’hypoglycémie chez des souris témoins et des souris traitées à la streptozotocine.
(A) Micrographies montrant deux îlots pancréatiques témoins (en haut) et deux îlots de souris traitées à la STZ (en bas) après immunofluorescence pour l’insuline (vert) et le glucagon (rouge). (B) Les glycé-mies ont été mesurées avant (0 jour) et 3, 4, 5, 6 et 7 jours après l’injection de la STZ (flèche, courbe rouge) ; aux mêmes moments, les glycémies ont été mesurées chez les souris témoins non traitées à la STZ (courbe noire). (D) À différents temps après l’injection d’insuline (flèche), la glycémie est mesurée chez les souris traitées à la STZ (courbe rouge) et chez les souris témoins (courbe noire). (C et E) : À différents temps après l’injection d’insuline, la glucagonémie (C) et le C-peptide dans le sang (E) sont mesurés chez les souris traitées à la STZ (courbes rouges) et chez les souris témoins (courbes noires).
Les résultats sont représentés sous la forme de la moyenne ± SEM, avec n = 5 pour les souris témoins et n = 10 pour les souris traitées à la STZ.
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Figure 8 : Comparaison de la sécrétion du glucagon en réponse à l’hypoglycémie chez des souris témoins et des souris NSG-RIP-DTR traitées à la toxine diphtérique.
(A) Micrographies montrant des îlots pancréatiques témoins (en haut) et des îlots de souris traitées à DT (en bas) après immunofluorescence pour l’insuline (vert) et le glucagon (rouge). (B) Les glycémies ont été mesurées avant (0 jour) et à 3, 4, 6 jours après l’injection de la DT (flèche, courbe rouge) ; aux mêmes moments, les glycémies ont été mesurées chez les souris témoins non traitées à la DT (courbe noire). (D) À différents temps après l’injection d’insuline (flèche), la glycémie est mesurée chez les souris traitées à la DT (courbe rouge) et chez les souris témoins (courbe noire). (C et E) Des échantillons de sang ont été prélevés avant l’injection (0 min) et après l’injection d’insuline à différents intervalles glycémiques (I.G : [5-4.5] ; [4.5-3.5] ; [3.5-3] ; [3-2.5] mM de glucose) ainsi qu’à la fin de l’expérience (150 min) pour doser la glucagonémie (C) et le C-peptide dans le sang (E). Les résultats sont représentés sous la forme de la moyenne ± SEM, avec n = 4 pour les souris témoins et n = 8 pour les souris traitées à la STZ.
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