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Visto que a análise em 3 e 6 horas não revelou diferenças significativas entre os grupos, o foco da discussão será o período de 12h após injeção. Nesse ponto, ANOVA indicou uma redução no grupo halo, quando comparado com VH, apenas na região GD (figura 14I). Nossos resultados estão de acordo com os trabalhos publicados por Bekinschtein et al (2007, 2009), os quais demonstraram que, 12h após a aquisição de memórias, ocorre uma fase de síntese proteica dependente da expressão de BDNF, no hipocampo de ratos. Essa fase tardia parece ser crítica para o armazenamento de memórias de longo prazo, mas não para a etapa de formação das mesmas. Esse grupo de pesquisadores revelou que a infusão intra-hipocampal de anisomicina, um inibidor de síntese proteica, 12h após o treino em uma tarefa de aprendizado associativo, não acarretou prejuízos mnemônicos no segundo dia pós- treino. Por outro lado, a análise após 7 dias revelou um déficit no aprendizado. Além disso, eles descreveram um aumento da expressão da proteína BDNF, 12h após a aquisição de memórias, o qual foi inteiramente revertido pela infusão de anisomicina. Visando confirmar a função de BDNF no processo de consolidação de memórias em roedores, eles bloquearam a expressão do gene BDNF com um oligonucleotídeo

antisense, 10h após o treino em esquiva inibitória. Esse tratamento impediu o

aumento da expressão da proteína BDNF, 12h após o treino, bem como prejudicou a persistência da memória até o sétimo dia após a aquisição, sem causar nenhum déficit no segundo dia pós-treino. Ainda, a infusão de BDNF humano recombinante foi capaz de reparar tal déficit, quando administrado 12h após o treino. Como podemos perceber, a expressão hipocampal de BDNF ocorre em intervalos restritos após a ativação de uma cascata inicial de memória de longo-prazo, com o objetivo de garantir um armazenamento eficaz para que a memória persista ao longo dos dias.

Além da conformidade quanto ao instante temporal, a expressão diferencial de BDNF no GD, demonstrada no nosso estudo (figura 14I), também está de acordo com alguns estudos que correlacionam causalmente essa proteína à função de separação de padrões, desempenhada pelo GD (BEKINSCHTEIN et al., 2010; O’REILLY; MCCLELLAND, 1994). O cérebro de mamíferos deve ser capaz de criar representações mnemônicas distintas ou menos confusas a partir de eventos similares, tornando possível a distinção entre eles. Dessa forma, o processamento

computacional responsável por transformar padrões similares em formas mais distintas entre si é conhecido como separação de padrões (LEUTGEB et al., 2007).

Estudos recentes têm sugerido que o GD é essencial para esse processo. Bekinschtein et al (2010) injetou anticorpos bloqueadores de BDNF no GD, visando demonstrar que danos na função de BDNF podem acarretar prejuízos no aprendizado em um teste de reconhecimento espontâneo de localização. Contudo, esse déficit foi observado somente quando os animais tiveram que distinguir duas localizações similares dentro de um campo aberto, e não quando tais localizações já eram mais distintas entre si. Dessa forma, a consolidação de memórias de representações espaciais similares requer tanto a atividade quanto a expressão dessa molécula. Na medida em que as localizações se tornaram mais similares, o tratamento com BDNF recombinante no GD aumentou a separação de padrões (BEKINSCHTEIN et al., 2010). Posteriormente, esse mesmo grupo de pesquisadores expôs ratos a dois objetos, delimitando tanto localizações espaciais similares quanto distintas, dentro de um campo aberto. Quando os ratos exploraram duas localizações similares, a expressão de BDNF no GD aumentou até 4 vezes. O mesmo não foi observado após a exploração de localizações distintas. Dessa forma, os níveis da proteína BDNF parecem aumentar espontaneamente, a fim de separar as representações de eventos similares (BEKINSCHTEIN et al., 2011).

Conforme mencionado anteriormente em nossos resultados, também houve uma tendência no ANOVA, que foi posteriormente confirmada pelo teste T, revelando que a expressão reduzida de BDNF no grupo halo também foi observada em CA3 (figura 14I). Alguns estudos descreveram a ocorrência de uma conectividade entre GD e CA3, sugerindo que essas duas regiões devem atuar juntas na separação de padrões (LEUTGEB et al., 2007; O’REILLY; MCCLELLAND, 1994).

Outros estudos foram delineados para descrever a correlação entre BDNF e outras moléculas envolvidas na cascata bioquímica de plasticidade. Foi descrito que a expressão de BDNF pode depender de uma interação com o receptor NMDA, o qual, por sua vez, interage com CaMKII. Dessa forma, o bloqueio de NMDA e CaMKII aboliu completamente o aumento pós-exercício dos níveis de RNAm da sinapsina I e do receptor TrkB, bem como reduziu os níveis de RNAm de CREB e BDNF (VAYNMAN et al., 2003).

Complementarmente, o bloqueio da expressão de BDNF, 12h após uma tarefa comportamental, impediu um aumento tardio dos níveis das proteínas c-Fos e Zif-268, o qual deveria ocorrer 24h após o estímulo inicial. Isso sugere que uma fase dependente de BDNF é necessária para armazenar memórias de longo prazo.

Considerados conjuntamente, esses estudos indicam que outra reativação da cascata bioquímica deve ocorrer em 12h, de modo dependente de BDNF (figura 14I), levando ao pico de expressão de CaMKII-P observado no nosso estudo, o qual é seguido por um aumento tardio dos níveis da proteína Zif-268 (intervalo de tempo não avaliado no nosso estudo).

Visto que os estudos mencionados estão em conformidade com nossos resultados, propomos que a ocorrência regular de sono REM possibilitou a consolidação sináptica nos animais do grupo VH. Por isso, tais animais tiveram um melhor desempenho em comparação com aqueles pertencentes ao grupo halo, ao serem avaliados 24h depois no TPON.

As comparações VH intertempo exibiram níveis crescentes de BDNF ao longo das 12h subsequentes ao estímulo inicial (figura 15C). Por outro lado, o tratamento com haloperidol parece interromper esse aumento em 12h, como podemos observar nos níveis reduzidos do grupo halo 12h, quando avaliados na comparação halo intertempo (figura 15F). Em consonância, nesse mesmo intervalo de tempo, encontramos diferenças entre os grupos VH e halo (figura 14I). Isso nos permite concluir que, conforme descrito nos estudos de Bekinschtein, a expressão de BDNF associada ao estímulo mnemônico ocorre tardiamente, durante um intervalo de tempo restrito.

Como resultado, considerando a cinética de expressão hipocampal de BDNF, em 3h após o estímulo inicial seu nível foi levemente reduzido em relação ao basal. Ao longo do período de 12h, os níveis da proteína foram restaurados, possivelmente de modo dependente do sono. Em 12h, uma reexpressão de BDNF, associada à consolidação de memórias, provavelmente acarretou o pico de CaMKII-P encontrado nas nossas análises.

Por fim, propomos um modelo para a sequência de eventos moleculares observadosnos animais VH, após a exposição aos objetos (figura 20). Acreditamos que nos 30min iniciais ocorreu a fase precoce da LTP, conforme descrito na introdução, na qual ocorreu a fosforilação de CaMKII, levando a níveis superiores aos basais. Nesse intervalo temporal,os animais veículo exibiram marcações de Zif-

268 e BDNF nos mesmos níveis do grupo basal, visto que essas proteínas só são expressas após um intervalo de tempo mais prolongado.

Desse modo, na fase tardia da LTP, que ocorreu provavelmente entre 30min e 3h, houve os eventos de transcrição e tradução de Zif-268, numa cascata induzida pelo estímulo mnemônico, ainda na fase de vigília. Por essa razão, os animais VH exibiram níveis proteicos acima do basal em 3h. Além disso, nesse mesmo intervalo provavelmente ocorreu a reposição parcial do estoque de CaMKII-P,o qual havia sido depletado na fase precoce. Essa reposição parece ter ocorrido de modo dependente de sono,o que justificaria o fato dos animais VH terem exibido níveis intermediários, apresentando-se da seguinte forma: superior ao grupo halo, devido à supressão farmacológica de sono REM induzida nesses animais; e inferior ao basal, possivelmente porque os episódios de sono não foram suficientes para uma reposição integral dessa kinase. Ainda em 3h, a expressão de BDNF permaneceu em um nível basal.

Entre 3 e 6h, provavelmente ocorreu a reposição de Zif-268, depletado devido ao pico em 3h, atingindo os valores basais em 6h. Quanto à CaMKII-P, nesse intervalo de tempo parece ter ocorrido a reposição integral, visto que os estoques dessa kinase atingiram os mesmos valoresbasais nesse intervalo de tempo. Com relação ao BDNF, sua marcação se apresentou similar ao grupo basal.

Em 12h, observamos um pico de expressão tardia de BDNF, acompanhado de uma reativação de CaMKII-P. A análise da figura 5, descrita anteriormente na introdução, nos permite relacionar a expressão das duas moléculas supracitadas, pois a ligação do BDNF ao seu receptor desencadeia uma cascata intracelular, a qual culmina na expressão de CaMKII-P, numa fase precoce (ainda em 12h). Nesse mesmo intervalo, os níveis de Zif-268 permaneceram similares aos basais. Posteriormente, entre 12-48h, supomos que essa cascata desencadeada pelo BDNF apresente uma fase tardia, na qual pode haver a expressão de outras PRPs, inclusive com a ocorrência de um novo pico de Zif-268.

Figura 20: Modelo para a cascata de eventos moleculares após a exposição. Está representada acima uma linha temporal descrevendo uma hipótese para os eventos que ocorreram nas 48h iniciais, após o contato dos animais VH com os objetos novos. Logo abaixo, podem ser visualizados os níveis da marcação para as proteínas CaMKII-P, Zif-268 e BDNF, os quais se apresentaram inferiores, iguais ou superiores aos basais (grupo naïve) ao longo do tempo.

6 CONCLUSÕES

Os camundongos exibiram habilidades distintas de evocação de memórias, dependendo do período claro-escuro de ocorrência do estímulo mnemônico. Quando apresentadas noperíodo diurno, as informações referentes aos objetos são retomadas, 24h depois, de modo mais eficiente do que aquelas apresentadas à noite. O tratamento com haloperidol inibiu a preferência por objetos novos apenas nos animais testados na fase clara, na qual há uma maior ocorrência de sono em roedores.

Além disso, esse fármaco também inibiu a expressão hipocampal de PRPs em diferentes pontos temporais: 3h (CaMKII-P); 6h (CaMKII-P e Zif-268); e 12h (CaMKII-P e BDNF). A ativação de CaMKII parece ocorrer rapidamente após um estímulo inicial, o que apoia o fato da mesma estar envolvida precocemente na cascata de plasticidade. Provavelmente, uma fase de reativação ocorre 12h depois, o que pode estar associado à expressão de BDNF especificamente nesse mesmo intervalo de tempo.

Estudos futuros precisarão investigar outras proteínas envolvidas nessa cascata mnemônica, tais como CREB, PKA e PLC, visando esclarecer a sequência temporal de eventos moleculares ocorridos no hipocampo, em resposta ao estímulo mnemônico proveniente do contato com objetos novos.

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