Couplage peptidique

Le couplage peptique sur MOF, qui n’a qu’un seul précédent issu de notre laboratoire,¹⁰¹ nécessite la présence d’un agent de couplages dont le rôle est d’«activer» la fonction acide carboxylique de l’acide aminé pour favoriser son couplage avec les groupements –NH2, présents dans la cavité du MOF pour former l’amide correspondant. L'acide aminé ou le peptide est greffé en deux étapes dans la cavité du MOF par un couplage peptidique entre les groupements amino des murs du MOF et la fonction acide carboxylique activée de l'acide aminé N-protégé, suivi de l'élimination du groupement protecteur pour libérer le NH terminal. L’utilisation d’un agent de couplage est indispensable car les groupements amino des parois du MOF sont en effet moins nucléophiles que leurs homologues homogènes. Cela est dû à l’effet électron-attracteur des carboxylates coordonnés aux métaux au niveau des nœuds du

MOF. De plus, il est nécessaire d’utiliser des agents de couplage qui sont solubles dans les solvants organiques, contrairement à l’agent de couplage DCC (dicyclohexylcarbodiimide) utilisé couramment en synthèse organique et dont le sous-produit est un solide blanc insoluble (DCC) et donc non séparable du MOF visé.^{103,104,105,106}

Le groupement N-protecteur retenu pour ces travaux est le Boc, à la différence des précédent travaux du laboratoire, qui utilisaient le groupement Fmoc.¹⁰¹ L’intérêt de ce groupement Boc est qu’il peut être retiré sans ajout de réactifs chimiques supplémentaires, qui pourraient rester bloqués à l'intérieur des pores. Le groupement Boc est thermolabile, un chauffage à une température légèrement supérieure à 110 °C permet donc de le retirer, sous forme de dioxyde de carbone gazeux et d'isobutène.¹⁰⁷

La réaction de couplage a été effectuée selon deux approches différentes.

x La première approche, que nous qualifierons de «classique», s’inscrit dans la continuité des travaux réalisés dans notre équipe par J Canivet.¹⁰¹

x La seconde approche utilise une irradiation micro-ondes, approche sans précédent en littérature dans ce type de fonctionnalisation de MOF et qui est l’un des enjeux de cette thèse.

A. Couplage peptidique « classique »

Il a été possible de greffer dans les pores de l’Al-MIL-101-NH2, un acide aminé (Boc-Proline) et un dipeptide (Boc-Proline-Glycine). Les synthèses présentées ci-après ont été effectuées sur 100mg de 1-NH2 (ce qui représente 0,5mmol de -NH2), 1,2 équivalents d’agent de couplages et 2 équivalents de base. Les rapports de quantité de matière, les solvants utilisés et les temps de réaction sont indiqués dans les Tableau 2 et Tableau 3. Les matériaux ont été caractérisés par DRX sur poudre et adsorption d’azote. La détermination du taux de greffage se fait par RMN ¹H après une digestion du matériau par une solution HF/Dmso d⁶. En effet, cette technique permet d’évaluer l’efficacité de la réaction de couplage ayant eu lieu, grâce à la comparaison des intégrations des pics caractéristiques des ligands du MOF de départ avec les intégrations des pics caractéristiques des ligands greffés. La marge d’erreur pour ce type de mesure est de l’ordre de +/- 2%.

a. Greffage de la Proline-Boc en condition classique

Le schéma réactionnel suivi pour le greffage de la Boc-Proline-OH sur l’amino-MOF 1-NH2 en l’absence de micro-ondes est reporté en Figure 46.

Figure 46 : Synthèse de 1-NH-Pro-Boc en conditions classiques.

Les entrées 1, 2 et 3 du Tableau 2 permettent de mettre en évidence les meilleurs couples agents de couplage/bases pour cette réaction. Le meilleur couple pour cette réaction est la combinaison PyBroP/DMAP, car elle permet d’obtenir le meilleur taux de greffage (10%). De plus, les analyses RMN ¹H montrent qu’avec ce couple il reste beaucoup moins d’agents de couplage piégés dans les cavités du MOF après les lavages. Les entrées 3 et 4 du Tableau 2 mettent en évidence que le maximum du taux de greffage (10%) est atteint dès 24h. En effet, dans les mêmes conditions réactionnelles, le taux de PSM est le même à t=24h et à t=168h, il est donc inutile de poursuivre la réaction plus de 24h pour ce greffage. Les entrées 4 et 5 du Tableau 2 montrent que le taux de greffage maximum est atteint avec une stœchiométrie de 0,6 équivalent d’acide aminé protégé par rapport aux groupements amino du MOF. On remarque que la réaction effectuée avec deux fois plus d’acides aminés conduit au même résultat. Il n’est donc pas utile d’ajouter plus de réactifs puisque, d’une part, ces réactifs ont un coût, et d’autre part, il faudra retirer l’excédent n’ayant pas réagi après la réaction par des lavages avec des solvants organiques. Les entrées 6 et 7 du Tableau 2 indiquent que l’utilisation du dichlorométhane (DCM) est bénéfique pour ce couplage peptidique, car dans les mêmes conditions de réaction, le couplage effectué dans le dichlorométhane conduit à un taux de PSM supérieur à celui effectué dans le diméthylformamide (DMF). Le chauffage à 80°C lors de ce couplage entraine une diminution du taux de PSM de l’ordre de 30%, comme le démontre la comparaison de l’entrée 7 aux entrées 3 et 5 du Tableau 2 . Un chauffage classique n’est donc pas bénéfique pour cette réaction.

L’ensemble des expériences menées, avec agents de couplage et conditions de réactions, ont démontré que, pour le greffage de la Boc-Proline, les résultats optimaux sont atteints en 24h

avec 0,6 équivalent d’acide aminé par rapport aux groupements amino du MOF, avec l’agent de couplage PyBroP associé à la DMAP.

Tableau 2 : Criblages des conditions de réaction testées lors de la synthèse de

1-NH-Pro-Boc en l’absence de micro-ondes (voir Figure 46 pour le schéma réactionnel) ^[a]

Entrée Agent

Couplage^{[b] Base [c]} AA/NH^Eq 2

Solvant T (°C) (h) ^{T Taux PSM} (%) 1 Muka I DIEA 0.6 DCM 40 24 5 2 Muka Ts DIEA 0.6 DCM 40 24 10 3 PyBroP DMAP 0.6 DCM 40 24 10 4 PyBroP DMAP 0.6 DCM 40 168 10 5 PyBroP DMAP 1.2 DCM 40 168 10 6 PyBroP DMAP 1 DCM 80 72 7 7 PyBroP DMAP 1 DMF 80 72 5

[a]rapport molaire entre la proline et les groupement –NH2 du MOF (100mg, 0,5mmol –NH2), réaction effectuée avec 1,2éq d’agent de couplage et 2éq de base ; ^[b] voir Figure 35 pour la structure des agents de couplage ; ^[c] voir Figure 36 pour la structure des bases.

b. Greffage de la Glycine-Proline-Boc en condition classique

Le schéma réactionnel suivi pour le greffage de la Boc-Proline-Glycine-OH sur l’amino-MOF

1-NH2 en l’absence de micro-ondes est reporté en Figure 47.

Figure 47 : Synthèse de 1-NH-Gly-Pro-Boc en conditions classiques.

Les meilleurs taux de greffage de proline étant de 10 %, cette étude s’est rapidement dirigée vers le dipeptide Boc-Pro-Gly-OH. En effet, en utilisant ce dipeptide, la pyrrolidine sera éloignée de la paroi de la cavité du MOF, ce qui pourrait entrainer une diminution des contraintes stériques et pourrait éventuellement augmenter le taux de PSM. Le meilleur couple pour cette réaction est la combinaison Muka I/DIEA car il permet d’obtenir le meilleur taux de greffage avec 55% de ligands fonctionnalisés (voir les entrées 1, 2 et 3 du Tableau 3).

En effet, dans les mêmes conditions réactionnelles, le taux de PSM à t=24h est de 55% alors qu’à t=168h il est de 50%, il est donc inutile de poursuivre la réaction plus de 24h pour ce greffage. L’utilisation du dichlorométhane est bénéfique pour ce couplage peptidique car, pour les mêmes conditions de réaction, le couplage effectué dans le dichlorométhane conduit à un taux de PSM deux fois supérieur à celui effectué dans le diméthylformamide (voir les entrées 4 et 5 du Tableau 3). La comparaison de l’entrée 4 aux entrées 1 et 6 du Tableau 3 met en évidence le fait que le chauffage conventionnel à 80°C lors de ce couplage entraine une diminution du taux de PSM de l’ordre de 20%.

Tableau 3: Criblages des conditions de réaction testées lors de la synthèse de

1-NH-Gly-Pro-Boc en l’absence de micro-ondes (voir Figure 47 pour le schéma réactionnel) ^[a]

Entrée Agent Couplage^[a] Base [b] Eq AA/NH2^[c] Solvant T (°C) T (h) Taux PSM (%) 1 Muka I DIEA 0.6 DCM 40 24 55 2 Muka Ts DIEA 0.6 DCM 40 24 50 3 PyBroP DMAP 0.6 DCM 40 24 20 4 Mika I DIEA 1 DCM 80 72 45 5 Mika I DIEA 1 DCM 80 72 20 6 Mika I DIEA 0.6 DCM 40 168 50 7 Mika I DIEA 1.2 DCM 40 168 50

[a]voir Figure 35 pour la structure des agents de couplage ; ^[b]voir Figure 36 pour la structure des bases. ^[c]rapport molaire entre la proline et les groupement –NH2 du MOF (100mg, 0,5mmol –NH2), réaction effectuée avec 1,2éq d’agent de couplage et 2éq de base.

L’ensemble des expériences menées a démontré que, pour le couplage de la Boc-Pro-Gly-OH, les conditions optimales sont un temps de réaction de 24h avec 0,6éq d’acide aminé par rapport aux groupements amino du MOF, avec l’agent de couplage Muka I associé à la DIEA. En condition classique, les greffages de la Boc-Proline et de la Boc-Pro-Gly-OH se font avec des taux de PSM de 10% et 55% respectivement. Le fait d’ajouter un espaceur entre la pyrrolidine et le mur du MOF augmente considérablement le taux de PSM, puisqu’il est multiplié par cinq. Cela semble suggérer que les contraintes stériques de la pyrrolidine influent sur le taux de PSM, lorsque celle-ci est très proche du point d’ancrage, notamment la fonction –NH2 des ligands du MOF.

B. Couplage peptidique sous irradiation micro-ondes

Comme rappelé dans l’introduction, l’apport de l’irradiation micro-ondes peut favoriser le rendement ou la sélectivité de certaines réactions de chimie organique. Dans le domaine des MOFs, l’irradiation micro-ondes a déjà démontré son utilité.¹⁰⁸ Les travaux présentés ici décrivent l’utilisation des micro-ondes dans la PSM d’un MOF, en particulier dans la PSM visant à introduire un peptide chiral dans la cavité par greffage covalent sur la charpente du MOF. L’unique exemple de PSM dans des matériaux hybrides poreux sous irradiation micro-ondes a été reporté par Cohen et ses collègues pour la cyanation du ligand 2-bromotéréphthalate dans l’UiO-66.¹⁰⁸ Dans ce cas, l’utilisation des micro-ondes permet de doubler le rendement de cette transformation.

a. Influence du solvant sur la réactivité

Un aspect important à prendre en compte lorsque l’on utilise les micro-ondes est le choix du solvant. En effet, il faut tenir compte de la solubilité (comme pour le chauffage classique) et la stabilité des réactifs dans celui-ci ; mais il faut également prendre en compte le comportement intrinsèque du solvant lors de son irradiation. Les solvants organiques couramment utilisés dans le domaine des micro-ondes sont classés selon leur efficacité de chauffage, Tan δ, dont la formule est indiquée en Équation 1. Ce qu’il faut retenir de cette valeur pour cette étude est que plus cette valeur est petite, plus le solvant est « inerte » ou « transparent » aux micro-ondes. Il est donc a priori, préférable de choisir des solvants possédant une Tan δ faible, pour qu’un maximum de l’irradiation, et donc de l’énergie produite par les micro-ondes, soit transmis directement aux réactifs. Cette valeur se calcule avec la formule suivante :

Tan δ = ε’’ / ε’

Équation 1 : Equation permettant de calculer Tan δ.

Où ε’ représente la perte diélectrique, c’est à dire l'efficacité avec laquelle le rayonnement électromagnétique est converti en chaleur ; et ε’’ la constante diélectrique, qui représente la polarisabilité de molécules dans le champ électrique.

Dans le Tableau 4 sont classés les solvants organiques couramment utilisés dans le domaine des micro-ondes. Les six solvants en gras sont ceux qui ont été testés pour la mise en place du procédé de couplage peptidique présenté ci-après. Ces solvants ont été choisis car leurs Tan δ sont représentatives d’une large gamme potentiellement utilisable.

Tableau 4 : Tan δ des solvants organiques les plus utilisés

Elevé (Tan δ >0.5) Moyen (0.1 < Tan δ < 0.5) Bas (Tan δ < 0.1)

Solvant Tan δ Solvant Tan δ Solvant Tan δ

Ethylène glycol 1.350 2-Butanol 0.447 Chloroforme 0.091 Ethanol 0.941 Dichlorobenzène 0.280 Acétonitrile 0.062 DMSO 0.825 NMP 0.275 Acétate d’éthyle 0.059

2-Propanol 0.799 Acide acétique 0.174 Acétone 0.054

Acide formique 0.722 DMF 0.161 THF 0.047

Méthanol 0.659 Dichloroéthane 0.127 DCM 0.042

Nitrobenzène 0.589 Eau 0.123 Toluène 0.040

1-Butanol 0.571 Chlorobenzène 0.101 Hexane 0.020

Parmi ces six solvants retenus, nous avons choisi le dichlorométhane comme référence, car c’est un des solvants les plus utilisés pour ce type de réactions.

b. Stabilité du composé 1-NH2 sous irradiation micro-ondes

La stabilité de l’Al-MIL-101-NH2 (1-NH2) sous irradiation micro-ondes a été testée. Dans le Tableau 5 sont présentées les surfaces spécifiques BET et volumes poreux du 1-NH2 avant et après test d’irradiation. Les diffractogrammes des DRXP du 1-NH2 avant et après test sont rassemblées en Partie expérimentale (Figure 111). L’Al-MIL-101-NH2 reste cristallin et poreux après une irradiation pendant une heure dans du dichlorométhane deutéré. L’analyse RMN du surnageant montre qu’aucun relargage de ligand aminotéréphtalate n’est observé. La cristallinité et la porosité du 1-NH2 sont également conservées après une irradiation micro-ondes pendant une heure dans du diméthylformamide deutéré. L’analyse RMN du surnageant dans ce cas montre un relargage du ligand aminotéréphtalate de l’ordre de 1%.

Tableau 5 : Porosité du MOF 1-HN2 après les tests d’irradiation sous micro-ondes ^[a]

Entrée Solvants As, BET (m².g^-1) Volume Poreux (cm³.g^-1)

1 DCM 2950 1.3

2 DMF 2900 1.3

c. Greffage de la Proline-Boc sous micro-ondes

Le schéma réactionnel suivi pour le greffage de la Boc-Proline-OH sur l’amino-MOF 1-NH2 sous micro-ondes est reporté en Figure 48.

Figure 48 : Synthèse de 1-NH-Pro-Boc sous irradiation micro-ondes.

La première démarche a été de trouver les meilleures conditions micro-ondes (puissance et temps) pour le greffage de la proline. Compte tenu des résultats observés pour le couplage en condition classique, le couple PyBroP/DMAP a été retenu comme couple agent de couplage/base ainsi que le dichlorométhane comme solvant et 0,6 équivalent d’acide aminé par rapport aux groupements amino du MOF. Les tests présentés ci-après ont été effectués sur 50mg de 1-NH2, représentant 0.225mmol de -NH2, 1,2 équivalent d’agents de couplage et 2 équivalents de base. Les rapports de quantité de matière, les solvants utilisés et les temps de réaction sont indiqués dans les Tableau 6 et 7. Les expériences présentées ont été réalisées avec un refroidissement constant du réacteur par un flux d’air comprimé. Le fait d’activer le refroidissement par air comprimé permet d’irradier plus longtemps le mélange réactionnel à durée de réaction égale.

Tableau 6: Effet de la température et de la puissance de l’irradiation sur le taux de PSM

pour la proline protégée Boc-Proline-OH sur le MOF 1-NH2 (voir Figure 48 pour le

schéma réactionnel) ^[a]

Entrée P (Watts) t (min) Taux PSM (%)

1 100 20 7 2 200 20 10 3 300 20 15 4 300 10 5 5 300 60 5 6 300 ^[b] 20 4

[a] réaction effectuée avec MOF 1-NH2 (50mg, 0,225mmol –NH2), avec 1,2éq d’agent de couplage et 2éq de base, à 80°C ; ^[b] absence de refroidissement par air comprimé.

La comparaison entre les entrées 1, 2 et 3 du Tableau 6 met en évidence le fait que, pour un même temps de réaction, la puissance des micro-ondes et le taux de PSM augmente de façon « proportionnelle ». Ainsi, on passe de 7% de PSM pour 100 Watts ; à 15% pour 300 Watts. La puissance maximale de l’appareil étant de 300 Watt, il n’a pas été possible techniquement de tester une irradiation de puissance supérieure. La puissance retenue pour ce greffage est donc 300 Watt. La comparaison entre les entrées 3, 4 et 5 du Tableau 6 met en évidence le fait que le temps de réaction le plus adapté à ce couplage est 20 minutes pour obtenir un taux de PSM de 15%. L’augmentation du temps de réaction à 60 minutes et sa diminution à 10 minutes entrainent tous deux une baisse substantielle du taux de PMS. Les entrées 6 et 3 du Tableau 6 prouvent l’intérêt du refroidissement par air comprimé car, en son absence, le taux de PSM chute de 75%. Les meilleures conditions micro-ondes pour notre étude sont donc une irradiation à 300 Watts pendant 20 minutes avec refroidissement par air comprimé.

Une fois les conditions micro-ondes mises au point, d’autres couples (agent de couplage/base) ont été testés. Les résultats présentés dans le Tableau 7 ont été obtenus lors de réactions réalisées dans le dichlorométhane avec 0,6 équivalent d’acide aminé par rapport aux groupements amino du MOF, sous une irradiation à 300 Watts pendant 20 minutes avec refroidissement par air comprimé. La comparaison des 3 entrées du Tableau 6 montre que le couple PyBroP/DMAP est le plus adapté pour ce couplage puisqu’il permet d’obtenir le meilleur taux de PSM : à savoir 15%.

Tableau 7 : Effet du couple agent de couplage/base sur le taux de PSM pour la proline

protégée Boc-Proline-OH sur le MOF 1-NH2 (voir Figure 48 pour le schéma réactionnel)

[a]

Entrée Agent Couplage [b] Base [c] Taux PSM (%)

1 PyBroP DMAP 15

2 Muka I DIEA 13

3 Muka Ts DIEA 2

[a] réaction effectuée avec MOF 1-NH2 (50mg, 0,225mmol –NH2), avec 1,2éq d’agent de couplage et 2éq de base, à 80°C ; ^[b]voir Figure 35 pour la structure des agents de couplages ; ^[c] voir Figure 36 pour la structure des bases.

Ce couplage a ensuite été testé dans le diméthylformamide, qui est le solvant de synthèse de l’Al-MIL-101-NH2 et un solvant couramment utilisé en synthèse organique pour les couplages peptidiques. Les résultats présentés dans le Tableau 8 ont été obtenus lors de réactions

réalisées avec 1 équivalent d’acide aminé par rapport aux groupements amino du MOF, sous une irradiation à 300 Watts pendant 20 minutes sans refroidissement par air comprimé.

Tableau 8 : Effet du solvant sur le taux de PSM pour la proline protégée Boc-Proline-OH

sur le MOF 1-NH2 (voir Figure 48 pour le schéma réactionnel) ^[a]

Entrée Solvant Taux PSM (%)

1 DCM 8

2 DMF 4

[a] réaction effectuée avec MOF 1-NH2 (50mg, 0,225mmol –NH2), avec 1,2éq d’agent de couplage et 2éq de base, à 80°C.

Comme montré dans le Tableau 8, l’utilisation du diméthylformamide entraine une diminution de 50% du taux de PSM sur ce greffage par rapport à l’utilisation du dichlorométhane. Plus de détails sur ces résultats seront apportés dans la partie suivante sur l’effet du solvant pour le couplage peptidique de la Boc-Proline-Glycine-OH sous irradiation micro-ondes, pour lequel une étude plus systématique a été réalisée. En résumé, l’ensemble des expériences menées qui ont testées les différents agents de couplage, les solvants et les conditions de réactions a démontré que, pour le couplage de la Boc-Proline sous irradiation micro-ondes, les conditions optimales sont atteintes en 20 minutes, sous 300 Watts de puissance, avec 0,6 équivalent d’acide aminé par rapport aux groupements amino du MOF, avec l’agent de couplage PyBroP associé à la DMAP dans le dichlorométhane.

d. Greffage de la Glycine-Proline-Boc sous micro-ondes

Le schéma réactionnel suivi pour le greffage de la Boc-Proline-Glycine-OH sur l’amino-MOF

1-NH2 sous micro-ondes est reporté en Figure 49.

Figure 49 : Synthèse de 1-NH-Gly-Pro-Boc sous irradiation micro-ondes.

Les tests présentés ci-après ont été effectué sur 50mg de 1-NH2 (ce qui représente 0.225

mmol de -NH2) et 2 équivalents de base. Les rapports de quantité de matière, les solvants utilisés et les temps de réaction sont indiqués dans les Tableau 9, Tableau 10 et Tableau 11.

La première démarche a été de trouver les meilleures conditions micro-ondes et stœchiométriques pour le greffage de la Glycine-Proline. Compte tenu des résultats observés pour le couplage en condition classique, le couple Muka I/DIEA a été conservé comme couple agent de couplage/base, ainsi que le dichlorométhane comme solvant. Les entrées 1, 7 et 8 du Tableau 9 montrent qu’ici encore la stœchiométrie optimale est 0,6 équivalents d’acide aminé par rapport aux groupements amino du MOF. Il est vrai que l’entrée 8 montre qu’il est possible d’aller jusqu'à 65% de PSM, cependant on remarque qu’il faut doubler la quantité de Boc-Glycine-Proline pour n’augmenter que de 5% le taux de PSM. Compte tenu du prix de la Boc-Glycine-Proline (500€/g chez Sigma-Aldrich) et du fait que cela engendre plus de lavages post-réactionnels, la stœchiométrie retenue pour ce couplage reste de 0,6 équivalent d’acide aminé par rapport aux groupements amino du MOF. Les entrées 1, 2, 3 et 4 du Tableau 9 montrent qu’ici les conditions micro-ondes optimales sont une irradiation à 300 Watts pendant 20 minutes sans refroidissement par air comprimé.

Tableau 9 : Effet de la puissance des irradiation micro-ondes et de la stoechiometrie sur le

taux de PSM pour la proline protégée Boc-Proline-Glycine-OH sur le MOF 1-NH2 (voir

Figure 49 pour le schéma réactionnel)

Entrée Eq AA/NH2 ^[a] P (Watt) Taux PSM (%)

1 0.6 100 ^[b] 55 2 0.6 100 15 3 0.6 300 ^[b] 55 4 0.6 300 15 5 1 300 ^[b] 60 6 1 300 ^[b] 60 7 1.2 100 ^[b] 65 8 1 100 ^[b] 55

[a]rapport molaire entre la glycine-proline et les groupement –NH2 du MOF (50mg, 0,225mmol –NH2), réaction effectuée avec 1,2éq d’agent de couplage et 2éq de base ;

[b]absence de refroidissement par air comprimé.

Une fois les conditions micro-ondes mises au point, d’autres couples (agent de couplage/base)