III. Synthèses chapitre 2 : couplage peptidique
2. Couplage peptidique « classique »
Dans un flacon de 10mL, on dissout l’agent de couplage, la base et l’acide aminé protégé dans 6mL dichlorométhane anhydre. Cette solution est agitée une heure à TA. Parallèlement, on désorbe le 1-NH2 (100mg, 0.3mmol -NH2). La solution préalablement préparée est additionnée sur le MOF activé et la suspension formée est agitée vigoureusement pendant 7 jours à 40°C. La suspension obtenue est centrifugée et le solide lavé au dichlorométhane (3x10mL) puis séché sous vide pendant 24h à TA pour donner le produit désiré sous forme de poudre jaune. Le solide à été caractérisé par DRXP, isotherme d’adsorption N2 et RMN liquide du produit digéré.
Tableau 22 : Quantités de matière pour le couplage peptidique en condition classique Composé
désiré
PyBroP DMAP Muka I EtNiPr2 Boc-Proline
-OH Boc-Proline- glycine-OH 1-NH- Pro-Boc 0.60mmol 300mg 1.2mmol 156mg / / 0.60mmol 130mg / 1-NH- Gly-Pro-Boc / / 0.60mmol 164mg 0.6mmol 112μL / 0.60mmol 164mg
x Résonnance magnétique nucléaire 1H:
1-NH-Pro-Boc, Rendement PSM = 10 %: 1H NMR (250 MHz, [D6] DMSO-HF-H2O); 9.14 (1H, d, J = 19.8 Hz); 8.21 (6H, d, J = 7.5 Hz, DMAP); 8.53 (1H); 8.06 (1H, m); 7.7 (8H, d); 7.7-7.6 (1H, m); 7.37 (10H, d, J = 8.1 Hz); 7.0 (8H, d, J= Hz); 6.96 (10H, d, J = 7.5 Hz, DMAP); 4.0(0.5H, m, H*); 3.17 (4H, s, DMAP); 1.38 (9H, d, boc) ppm.
1-NH-Gly-Pro-Boc, Rendement PSM = 50 %: 1H NMR (250 MHz, [D6] DMSO-HF-H2O); 9.14 (1H, d, J = 19.8 Hz); 8.21 (6H, d, J = 7.5 Hz, DMAP); 8.07 (1H, d, J = 8.2 Hz); 7.68-7.90 (14H, m); 7.17-7.43 (14H, m); 7.08 (10H, d, J = 8.1 Hz); 6.96 (7H, d, J = 7.5 Hz, DMAP + 1H); 4.12-4.31 (4H, m), ; 3.41 (2H, m),; 3.17 (12H, s, DMAP), ; 1.75-2.07 (4H, m) ppm.
x N2 Physisorption
P/P0
Figure 113 : Isothermes d’adsorption (ronds pleins)/désorption (ronds vides) de N2 des 1-NH-Pro-Boc (rouge) et 1-NH-Gly-Pro-1-NH-Pro-Boc (bleu).
x Diffraction des rayons X sur poudre (DRXP)
2θ (en °)
Figure 114 : Diffractogrammes DRXP de 1-NH2 (simulé), 1-NH-Pro-Boc (rouge), 1-NH-Gly-Pro-Boc (bleu) en 2θ(°). AS,BET (m2/g) Vp (cm3/g) 1-NH-Pro-boc 408 0,53 1-NH-Gly-Pro-boc 720 0,54
C. Couplage peptidique sous irradiation micro-ondes
Pour faire de telles réactions, il est nécessaire d’être équipé d’appareillage spécifique à ce type de réaction. Dans cette étude, les expériences réalisées sous micro-ondes ont toutes été effectuées dans une verrerie adaptée (figure II-11 : (b)) et dans le générateur de micro-ondes CEM Discover SP (figure II-11 : (a)).
Figure 115: CEM Discover SP et réacteur utilisé dans cette étude.
Dans un flacon micro-ondes de 10mL, on ajoute l’agent de couplage, la base, l’acide aminé protégé et le 1-NH2 (0.225mmol -NH2) dans 6mL dichlorométhane anhydre. Le tout est placé aux ultrasons pendant 10 secondes puis sous irradiation micro-ondes (20min ; 80°C ; 300W). La suspension obtenue est centrifugée et le solide lavé au DCM (3x10mL) puis séché sous vide pendant 24h à TA pour donner le produit désiré sous forme de poudre jaune. Le solide à été caractérisé par DRXP, isotherme d’adsorption N2 et RMN liquide du produit digéré.
Tableau 23 : Quantités de matière pour le couplage peptidique sous micro-ondes Composé
désiré
PyBroP DMAP Muka I EtNiPr2 Boc-Proline
-OH Boc-Proline- glycine-OH 1-NH- Pro-Boc 0,15 mmol 75mg 0.3mmol 39mg / / 0.15mmol 32.5mg / 1-NH- Gly-Pro-Boc / / 0,50 mmol 124mg 1,2mmol 112 μL / 0.50mmol 123mg x Résonnance magnétique nucléaire 1H:
1-NH-Pro-Boc, Rendement PSM = 15 %: 1H NMR (250 MHz, [D6] DMSO-HF-H2O); 9.14 (1H, d, J = 19.8 Hz); 8.21 (6H, d, J = 7.5 Hz, DMAP); 8.53 (1H); 8.06 (1H, m); 7.7 (8H, d); 7.7-7.6 (1H, m); 7.37 (10H, d, J = 8.1 Hz); 7.0 (8H, d, J= Hz); 6.96 (10H, d, J = 7.5 Hz, DMAP); 4.0(0.5H, m, H*); 3.17 (4H, s, DMAP); 1.38 (9H, d, Boc) ppm.
1-NH-Gly-Pro-Boc, Rendement PSM = 60 %: 1H NMR (250 MHz, [D6] DMSO-HF-H2O); 9.14 (1H, d, J = 19.8 Hz); 8.21 (6H, d, J = 7.5 Hz, DMAP); 8.07 (1H, d, J = 8.2 Hz); 7.68-7.90 (14H, m); 7.17-7.43 (14H, m); 7.08 (10H, d, J = 8.1 Hz); 6.96 (7H, d, J = 7.5 Hz, DMAP + 1H); 4.12-4.31 (4H, m), ; 3.41 (2H, m),; 3.17 (12H, s, DMAP), ; 1.75-2.07 (4H, m) ppm. x N2 Physisorption P/P0
Figure 116 : Isothermes d’adsorption (ronds pleins)/désorption (ronds vides) de N2 des 1-NH-Pro-Boc (rouge) et 1-NH-Gly-Pro-1-NH-Pro-Boc (bleu).
x Diffraction des rayons X sur poudre (DRXP)
2θ (en °)
Figure 117 : Diffractogrammes DRXP de 1-NH2 (simulé), 1-NH-Pro-Boc (bleu), 1-NH-Gly-Pro-Boc (rouge). AS,BET (m2/g) Vp (cm3/g) 1-NH-Pro-boc 400 0,52 1-NH-Gly-Pro-boc 800 0,87
D. Déprotection Classique
Dans un flacon de 10mL, une suspension de 1-NH-Pro-Boc ou de 1-NH-Gly-Pro-Boc (100mg) et de TFA (0.8mmol ; 60μL) dans 6mL de dichlorométhane est agitée 3h à TA. La suspension obtenue est centrifugée et le solide lavé au dichlorométhane (3x10mL) puis séchée sous vide pendant 24h à TA. Cette étape est reproduite plusieurs fois jusqu’à obtenir une déprotection de 100%.
x Résonnance magnétique nucléaire 1H
1-NH-Pro : 1H NMR (250 MHz, [D6] DMSO-HF-H2O) ; 9.14 (1H, d, J = 19.8 Hz); 8.21 (6H, d, J = 7.5 Hz, DMAP); 8.07 (1H, d, J = 8.2 Hz); 7.68-7.90 (14H, m); 7.17-7.43 (14H, m); 7.08 (10H, d, J = 8.1 Hz); 6.96 (7H, d, J = 7.5 Hz, DMAP + 1H); 4.12-4.31 (4H, m); 3.41 (2H, m); 3.17 (12H, s, DMAP); 1.75-2.07 (4H, m) ppm.
1-NH-Gly-Pro: 1H NMR (250 MHz, [D6]DMSO-HF-H2O); 9.14 (1H, d, J = 19.8 Hz); 8.21 (6H, d, J = 7.5 Hz, DMAP); 8.07 (1H, d, J = 8.2 Hz); 7.68-7.90 (14H, m); 7.17-7.43 (14H, m); 7.08 (10H, d, J = 8.1 Hz); 6.96 (7H, d, J = 7.5 Hz, DMAP + 1H); 4.12-4.31 (4H, m); 3.41 (2H, m); 3.17 (12H, s, DMAP); 1.75-2.07 (4H, m) ppm
x N2 Physisorption
P/P0
Figure 118 : Isothermes d’adsorption (ronds pleins)/désorption (ronds vides) de N2 de 1-NH-Gly-Pro-Boc. AS,BET (m2/g) Vp (cm3/g) 1-NH-Pro-boc 115 0,46 1-NH-Gly-Pro-boc 30 0,27
x Diffraction des rayons X sur poudre (DRXP)
2θ (en °)
Figure 119 : Diffractogrammes DRXP de 1-NH-Pro (bleu), 1-NH-Gly-Pro (rouge).
E. Déprotection sous irradiation micro-ondes
Dans un flacon micro-ondes de 10mL, on ajoute 1-NH-Pro-Boc ou de 1-NH-Gly-Pro-Boc
(100mg) dans 6mL dichlorométhane anhydre. Le tout est placé sous irradiation micro-ondes (10min ; 150°C ; 300W). La suspension obtenue est centrifugée et le solide lavé au dichlorométhane (3x10mL) puis séché sous vide pendant 24h à TA pour donner le produit désiré sous forme de poudre jaune. Le solide à été caractérisé par DRXP, isotherme d’adsorption N2 et RMN liquide du produit digéré.
x Etude spectroscopique RMN 1H liquide
1-NH-Pro, Rendement PSM = 15 %, 1H NMR (250 MHz, [D6] DMSO-HF-H2O); 9.14 (1H, d, J = 19.8 Hz); 8.21 (6H, d, J = 7.5 Hz, DMAP); 8.53 (1H); 8.06 (1H, m); 7.7 (8H, d); 7.7-7.6 (1H, m); 7.37 (10H, d, J = 8.1 Hz); 7.0 (8H, d, J= Hz); 6.96 (10H, d, J = 7.5 Hz, DMAP); 4.0(0.5H, m, H*); 3.17 (4H, s, DMAP); 1.38 (9H, d, boc) ppm.
1-NH-Gly-Pro, Rendement PSM = 60 %, 1H NMR (250 MHz, [D6] DMSO-HF-H2O); 9.14 (1H, d, J = 19.8 Hz); 8.21 (6H, d, J = 7.5 Hz, DMAP); 8.07 (1H, d, J = 8.2 Hz); 7.68-7.90 (14H, m); 7.17-7.43 (14H, m); 7.08 (10H, d, J = 8.1 Hz); 6.96 (7H, d, J = 7.5 Hz, DMAP + 1H); 4.12-4.31 (4H, m), ; 3.41 (2H, m),; 3.17 (12H, s, DMAP), ; 1.75-2.07 (4H, m) ppm.
Figure 120 : Spectre RMN 1H de 1-NH-Pro (15%) digéré dans une solution HF-H2O/dmso d6. Les pics des bdc-NH2 et ceux des ligands fonctionnalisés sont indiqués par des carrés et des cercles
respectivement.
Figure 121 : Spectre RMN 1H de 1-NH-Gly-Pro (60%) digéré dans une solution HF-H2O/dmso d6. Les pics des bdc-NH2 et ceux des ligands fonctionnalisés sont indiqués par des cercles et des carrés
x Diffraction des rayons X sur poudre (DRXP)
2θ (en °)
Figure 122 : Diffractogrammes DRXP de 1-NH-Pro (bleu) et de 1-NH-Gly-Pro (rouge).
x N2 Physisorption
Figure 123 : Isothermes d’adsorption (ronds pleins)/désorption (ronds vides) de N2 des 1-NH-Pro(bleu) et 1-NH-Gly-Pro (rouge).
AS,BET (m2/g) Vp (cm3/g) 1-NH-Pro-boc 330 0,59 1-NH-Gly-Pro-boc 800 0,72
x Dichroïsme circulaire vibrationnel
Ces analyses ont été effectuées par Daniel Maspoch et Inhar Imaz de l’institut catalan de nanosciences et nanotechnologie de Barcelone.
Les différentes pastilles ont été préparées en mélangeant 100 mg de KBr sec avec le MOF (de 1 mg à 5 mg). Les poudres ont été broyées avec un mortier en agate pendant 5 minutes. Ensuite, le mélange a été pressé à 10 tonnes pendant 10 minutes, se qui est la norme. Les pastilles résultantes (13 mm) étaient opaques et les différents spectres de dichroïsme circulaire de vibration ont été recueillis. Les mesures ont été effectuées dans un tenseur 27 Bruker FT-IR couplé à un accessoire de PMA50, en utilisant une longueur d'onde de 1800 cm-1 à 600 cm-1 filtrées par un MIR. Les mesures ont été effectuées trois fois pour minimiser les artéfactes. Les différentes mesures ne montrent aucune activité optique pertinente pour les MOFs 1-NH-Gly-Pro et 1-NH2. Le niveau de référence utilisé est celui de la L-DOPA commerciale dans les mêmes conditions.
Figure 124 : Spectre de référence de la L-DOPA (haut), du 1-NH2 (gauche) et du 1-NH-Gly-Pro (L) (droite). 1800 1600 1400 1200 -0,0002 0,0000 0,0002 ' A Nombres d'ondes (cm-1) 1800 1600 1400 1200 -0,0002 0,0000 0,0002 ' A Nombre d'ondes (cm-1) 1800 1600 1400 1200 -0,0002 0,0000 0,0002 ' A Wavenumber (cm-1)
F. Extension aux di tri et tétra-peptides
Dans un flacon micro-ondes de 10mL, le 1-NH2 (0.225mmol -NH2 ; 50mg) est activé sous vide pendant 1 heure. Parallèlement dans un flacon de 10mL, on agite le Muka I (0,225mmol ; 62mg), la DIEA (0,6mmol ; 56μL) et l’acide aminé protégé (0,225mmol ; cf tableau) dans 6mL dichlorométhane anhydre pendant 1 heure. On ajoute la solution sur le MOF activé puis on passe le tout aux ultrasons pendant 10 secondes puis sous irradiation micro-ondes (20min ; 80°C ; 300watts ; Power max: OFF). La suspension obtenue est centrifugée et le solide lavé au DCM (5x10mL) puis séché sous vide pendant 24h à TA pour donner le produit désiré sous forme de poudre jaune. Le solide à été caractérisé par DRXP et RMN liquide du produit digéré.
Tableau 24 : Quantités de matière pour les di tri et tétra peptides
Types de dipeptides Masse (en mg)
Boc-Gly-Gly-OH 52 Boc-Ala-Gly-Sar-OH 72 Boc-Gly-Gly-Gly-OH 65 Boc-Tyr-Ala-Gly-OH 92 Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-OH 98 Boc-Ala-Gly-Gly-Gly-OH 81
x Etude spectroscopique RMN 1H liquide
Figure 125 : Spectre RMN 1H de 1-NH-Gly-Gly (55%) digéré dans une solution NaOD-D2O. Les pics des bdc-NH2 et ceux des ligands fonctionnalisés sont indiqués par des cercles et des carrés
Figure 126 : Spectre RMN 1H de 1-NH-Gly-Gly-Gly (15%) digéré dans une solution NaOD-D2O. Les pics des bdc-NH2 et ceux des ligands fonctionnalisés sont indiqués par des cercles et des carrés
respectivement.
Figure 127 : Spectre RMN 1H de 1-NH-Sar-Gly-Ala (20%) digéré dans une solution NaOD-D2O. Les pics des bdc-NH2 et ceux des ligands fonctionnalisés sont indiqués par des cercles et des carrés
Figure 128 : Spectre RMN 1H de 1-NH-Gly-Gly-Gly-Ala (20%) digéré dans une solution NaOD-D2O. Les pics des bdc-NH2 et ceux des ligands fonctionnalisés sont indiqués par des cercles et des
carrés respectivement. x N2 Physisorption
P/P0
Figure 129 : Isothermes d’adsorption (ronds pleins)/désorption (ronds vides) de 1-NH-Gly-Gly (rouge), Gly-Gly-Gly (bleu), Sar-Gly-Ala (vert), Gly-Gly-Gly-Ala (jaune),
Tableau 25 : Surfaces spécifiques et volumes poreux des différents MOFs fonctionnalisés avec un taux de déprotection de 100%.
MOFs Taux PSM
(%) Surface spécifique (m2/g) Volume poreux (cm3/g)
1-NH-Gly-Gly 55 130 0,1524 1-NH-Sar-Gly-Ala 20 330 0,2640 1-NH-Gly-Gly-Gly 15 260 0,2363 1-NH-Gly-Phe-Gly-Gly <5 280 0,1089 1-NH-Gly-Gly-Gly-Ala 20 200 0,1925 1-NH-Pro-Pro 8 350 0,3057 1-NH-Pro-Pro-Pro 8 350 0,2569
x Diffraction des rayons X sur poudre (DRXP)
2θ (en °)
Figure 130 : Du bas vers le haut, diffractogrammes DRXP de 1-NH 2, NH-Pro, NH-Gly-Pro, 1-NH-Gly-Gly, 1-NH-Gly-Gly-Gly, 1-NH-Sar-Gly-Ala, 1-NH-Gly-Gly-Gly-Ala,
1-NH-Gly-Phe-Gly-Gly.
x Analyses HPLC des (D) et (L)-1-NH-Gly-Pro
1-NH-Gly-Pro a été préparé en utilisant soit (D) Boc-Pro-Gly-OH (Sigma-Aldrich) ou (L)
Boc-Pro-Gly-OH (Bachern AG) suivant la procédure décrite ci-dessus pour donner, respectivement, (D)-1-NH-Gly-Pro et (L)-1-NH-Gly-Pro avec le même rendement de greffage (environ 60%).Avant l'analyse, un échantillon de 10 mg de chaque solide est dissous dans 5 ml d'une solution de MeOH:H2O:TFA = 50:49:1. Une partie de cette solution est ensuite analysée par HPLC en utilisant une colonne CHIRALPAK IA (H2O:MeOH = 65:35 avec 0,05% en volume de TFA, 0,2mL.min-1, 254 nm).
Figure 131 : Chromatogramme HPLC pour l’aldolisation catalysée par 1-NH-Gly-Pro (acétone/eau, 26% yield, 25% e.e.).
Figure 132 : Chromatogramme HPLC pour l’aldolisation catalysée par 1-NH-Gly-Pro (acétone/eau à 45°C, 95% yield, 17% e.e.).
Entrée MOF Temps de
Rétention (min) Ligands Aire Ee (%) 1 (D)-Al-MIL-101 -Gly-Pro 25,06 77,15 (D)-H2BDC-NH-Gly-Pro H2BDC-NH2 5158895 3109664 nd. 2 (L)-Al-MIL-101 -Gly-Pro 25,06 27,00 77,15 (D)-H2BDC-NH-Gly-Pro (L)-H2BDC-NH-Gly-Pro H2BDC-NH2 73533 4552542 2987055 97%
3. Performances catalytique: Réaction d’aldolisation