Choix des oligochitosans

Dans le cadre de notre travail, les oligochitosans doivent idéalement être hydrosolubles et peu visqueux (faible DP) sur une gamme de pH allant de 2 à 7,5 ; cela permet de former les matériaux mésostructurés et de dissocier les micelles au sein des matériaux, aussi bien en milieu légèrement basique (pH > pKaOC) qu’en milieu acide (pH <

pKaAA).

L’oligochitosan commercial (Sigma-Aldrich) qui était jusque là utilisé par notre équipe dans le cadre des thèses précédentes a été commercialisé jusqu’en 2012 et le dernier lot disponible a été terminé durant la thèse précédent la mienne. Je n’ai donc pas pu étudier cet oligochitosan dans mon travail de thèse. D’autres oligochitosans commerciaux ont été candidats pour la préparation de matériaux mésoporeux à partir de micelles PIC, notamment un oligochitosan provenant de chez Sigma-Aldrich commercialisé après 2012, mais également des oligochitosans de Zhengzhou Sigma Chemical Co. en Chine et HEPPE medical chitosan GmbH en Allemagne, ainsi qu’un oligochitosan non commercial obtenu par traitement microonde¹¹⁶ dans l’équipe IAM de l’Institut Charles Gerhardt. Ces oligochitosans présentaient des caractéristiques physico-chimiques différentes (solubilité) qui n’étaient pas forcément toutes adaptées à notre travail, ce qui n’a pas permis la formation de matériaux mésostructurés. Au cours de ma thèse, nous avons finalement fait l’acquisition de nouveaux oligochitosans qui ont permis d’obtenir des matériaux mésostructurés ordonnés, et qui étaient produits et commercialisés par Creative PEG Works en 2016. Etant donné le peu d’indications données par le fournisseur, une caractérisation complète de ces OC a été entreprise et cette partie lui est consacrée. La connaissance du % DDA, du DP et de sa composition chimique (contre-ion, hydratation) est essentielle pour fixer les conditions de synthèse nécessaires à l’obtention de matériaux hybrides siliciques. En effet, le nombre de mole d’azote par masse d’échantillon OC pesé doit être connu précisément car nous verrons par la suite que le rapport molaire entre le nombre d’azote et le nombre de fonctions acide carboxylique et carboxylate du DHBC sera fixé. La connaissance du pKa sera également une indication précieuse dans le cadre de l’étude physico-chimique des micelles PIC.

70 2.1.3. Caractérisation des oligochitosans Creative PEG Works

Deux oligochitosans ont été utilisés comme auxiliaires de micellisation :

- OC 2,5k, n° lot WMH03064 : masse moléculaire moyenne annoncée de 2500 g.mol^-1 - OC 5k, n° lot WMH03061 : masse moléculaire moyenne annoncée de 5000 g.mol^-1 Les oligochitosans sont sous forme de poudre orangée dans leur forme acide. Les caractéristiques de ces produits commerciaux (masse, % DDA, quantité de contre-ions et d’eau et pKa) ont été déterminées par différentes techniques complémentaires : la RMN des noyaux ¹H, ¹⁵N et ¹³C, la SEC-MALS, l’analyse élémentaire, l’analyse thermogravimétrique, la titration acido-basique et conductimétrique ainsi que l’osmométrie. Cette série d’analyses montre que l’OC 2,5k est associé à des ions lactate et chlorure tandis que l’OC 5k est associé à des ions acétate (l’acide acétique est souvent utilisé avec le chitosan pour le solubiliser). Les formules développées de l’OC 2,5k et de l’OC 5k sont présentées sur la Figure 34 ; nous cherchons à déterminer les indices x, y, z, w et t pour l’OC 2,5k et x, y, z et t pour l’OC 5k, caractéristiques d’une unité structurale moyenne.

Figure 34 : Représentation des OC 2,5k ([GlcN]x [GlcNAc]y (Lact)z Clw (H2O)t,) et OC 5k ([GlcN]x

[GlcNAc]y (Acét.)z (H2O)t,) fournis par Creative PEG Works, où les indices x, y, z, w et t sont à déterminer précisément

Les compositions des OC 2,5k et 5k avec leurs contre-ions sont présentées dans le Tableau 3. Les compositions en éléments N, C et H sont données en pourcentage massique.

Les indices molaires x, y, z, w et t sont caractéristiques d’une unité structurale moyenne. Les masses molaires et meqN.g^-1 se rapportent aux OC avec leur contre-ions.

(H₂O)_t Cl_W (H₂O)_t

OC 2,5k

OC 5k

71

Tableau 3 : Compositions et pKa des OC 2,5k et 5k avec leurs contre-ions déterminés par diverses techniques de caractérisation

Détermination de la masse molaire des OC

Les masses molaires et l’indice de polydispersité des OC 2,5k et OC 5k sans leurs contre-ions ont été déterminés par analyse SEC-MALS. Les résultats sont présentés dans le Tableau 4.

Tableau 4: Masses molaires et indice de polydispersité des OC 2,5k et 5k sans leurs contre-ions

Mn (g/mol) Mp (g/mol) Ip

OC 2,5k 1710 1910 1,12

OC 5k 2760 4640 1,68

L’OC 2,5k présente un Ip faible (1,12) alors que l’OC 5k présente un Ip élevé (1,68). Pour les deux OC, la masse molaire moyenne trouvée est inférieure à celle annoncée par le fournisseur.

72 Détermination du degré de désacétylation (% DDA) des OC

Le degré de désacétylation est déterminé à partir de techniques non destructives telles que la RMN de divers noyaux (¹⁵N, ¹³C, ¹H).

Figure 35 : Spectre RMN du ¹³C MAS simple impulsion de l’OC 2,5k

Figure 36 : Spectre RMN du ¹³C MAS simple impulsion de l’OC 5k C9,

acide lactique C7, acétamide

C1 C4 C5

C3

C6 C2

C8, acétamide

C11

C9,

acide acétique C7, acétamide

C1 C4 C5

C3

C6 C2

C8, acétamide

C10 acide acétique C1

73 Les Figure 35 et Figure 36 présentent les spectres RMN ¹³C en rotation à l’angle magique (simple impulsion) des OC 2,5k et OC 5k respectivement. L’attribution des pics est notée sur les spectres. Pour OC 2,5k (Figure 35), le C10 du lactate (CH) est difficilement identifiable au sein du massif attribué aux carbones 1-2-3-4-5 (entre 40 et 120 ppm). De plus, le fort recouvrement des signaux C9 (acide lactique) et C7 (acétamide de l’OC) d’une part, et C11 (acide lactique) et C8 (acétamide de l’OC) d’autre part, empêche la détermination précise de la contribution des ions lactates dans le spectre RMN ¹³C MAS. Pour OC 5k également (Figure 36), le fort recouvrement des signaux C9 (acide acétique) et C7 (acétamide de l’OC) d’une part, et C10 (acide acétique) et C8 (acétamide de l’OC) d’autre part, complique la détermination précise de la contribution des ions acétates dans le spectre RMN ¹³C MAS. La présence des contre-ions lactate et acétate rende la détermination du degré de désacétylation délicate par RMN ¹³C d’où le choix d’utiliser les RMN ¹⁵N solide¹¹⁷ et ¹H liquide.

Figure 37 : Spectre RMN de l' ¹⁵N CPMAS solide de l’OC 2,5k

Figure 38 : Spectre RMN de l' ¹⁵N CPMAS solide de l’OC 5k 3 %

97 % N – Amide

GlcNAc

N – Amine GlcN

18 %

82 % N – Amide

GlcNAc

N – Amine GlcN

74

Figure 39 : Spectre RMN du ¹H liquide dans D2O de l’OC 2,5k, avec l’attribution des protons par le numéro du C qui les porte.

75 Les spectres RMN de l' ¹⁵N CPMAS des OC 2,5k et 5k (Figure 37 et Figure 38) acquis avec polarisation croisée ¹H-¹⁵N montrent la présence d’un signal à 100 ppm et d’une groupe de signaux centré à 10 ppm attribués respectivement au groupement amine de l’unité désacétylée (GlcN) et à l’azote du groupement amide de l’unité acétylée (GlcNAc). Comme précisé dans l’annexe A : Techniques de caractérisations, un temps de contact optimal de 0,5 ms a été déterminé pour les deux signaux ¹⁵N, l’intégration des pics peut alors être considérée quantitative. Le degré de désacétylation peut être calculé simplement par l’intégration des deux pics selon la relation suivante, basée sur la définition même du % DD :

M"??b =" Z

efg[hG-Z_efg[hG-9"Z_efg[hi-× 1`` Équation 11

La RMN de l' ¹⁵N permet de calculer un % DDA de 97 ± 5 % (% molaire) pour l’OC 2,5k et 82 ± 5 % pour l’OC 5k.

Le degré d’acétylation des OC 2,5k et 5k a également été évalué par RMN du ¹H dans l’eau deutérée D2O (Figure 39 et Figure 40). Les attributions des pics sont effectuées à partir de la littérature,¹¹⁸ elles sont rapportées dans le tableau relatif à chaque spectre avec les intégrations des pics. A partir des intégrations du signal attribué au méthyl de l’unité acétylée GlcNAc (2,0 ppm) et celui du H-2 de l’unité désacétylée GlcN (3,1ppm), un degré de désacétylation de 97

± 5 % pour OC 2,5k et 88 ± 5 % pour OC 5k sont calculés à partir de l’Équation 12.

M?? = j kl1 ("

Z;m_nfo5+e8+

p3 Zm_Dqrstu"9"Z^;mvfo5+e8+3

w xy× 1``

Équation 12

Les degrés de désacétylation déterminés pour l’OC 2,5k par RMN du ¹H liquide et de l'¹⁵N solide sont identiques (% DDA = 97 ± 5 %). Les degrés de désacétylation déterminés pour l’OC 5k par RMN du ¹H en solution (% DDA = 88 ± 5 %) et de l'¹⁵N solide (%DD = 82 ± 5

%) sont concordants.

76 Détermination du nombre de contre-ions des OC

La quantité de contre-ions organiques, lactate pour l’OC 2,5k et acétate pour l’OC 5k, est déterminée par RMN du ¹H dans D₂O et analyse élémentaire de l’azote et du carbone. La présence de contre-ions inorganiques chlorure dans l’OC 2,5k a été quantifiée par dosage avec une sonde spécifique au chlore.

Le spectre RMN du ¹H de la Figure 39 permet de déterminer directement la quantité d’ions lactate par rapport à l’OC 2,5k, en calculant par exemple le rapport d’intensité entre les protons méthyl provenant du lactate et les protons H-2 de l’unité D-glucosamine : (I_CH3-ac

lactique/lactate/3)/(I_H2-GlcN)=0,47 . Cela signifie que le produit contient 0,47 moles de lactate par unité GlcN, soit z=0,46 moles de lactate par mole de (GlcN + GlcNAc). De la même manière, le spectre RMN ¹H de la Figure 40 permet de déterminer la quantité d’acétate par rapport à l’OC 5k, en calculant le rapport d’intensité entre les protons méthyl provenant de l’acétate et les protons H-2 de l’unité D-glucosamine : (I_CH3-ac acétique/acétate/3)/(I_H2-GlcN)=0,79. Cela signifie que le produit contient 0,79 moles d’acétate par unité GlcN, soit z=0,70 moles d’acétate par mole de (GlcN + GlcNAc).

Par ailleurs, le nombre de moles de lactate par mole de (GlcN + GlcNAc) pour l’OC 2,5k a également été déterminé par analyse élémentaire. D’après le rapport des pourcentages massiques en C (%m C = 36,9 %) et en N (%m N = 5,6 %) (Tableau 3) obtenus par analyse élémentaire et en considérant les compositions molaires en unités GlcN et GlcNAc déterminées par RMN ¹H (respectivement 88 % et 12 % molaire), z vaut 0,56.

Un dosage acido-basique de l’OC 2,5k a également permis de déterminer que z= 0,55 (Figure 41, a, détaillé plus loin). Les valeurs de la quantité de lactates par N (z) pour l’OC 2,5k déterminées avec différentes techniques sont concordantes. De la même manière pour l’OC 5k, z= 0,79 par la méthode d’AE (Tableau 3) et z=0,69 par dosage acido-basique (Figure 41, b), ce qui est concordant avec la détermination faite à partir des données de la RMN ¹H.

Un dosage des ions chlorures avec une sonde spécifique a permis de déterminer que l’OC 2,5k contient 6,6% massique d’ions chlorures (w=0,48).

Détermination de la quantité d’eau dans les produits commerciaux

La quantité d’eau présente dans l’échantillon a été déterminée à partir des ATG (perte de masse entre 0 et 130°C) et à partir des pourcentages massiques absolus (%m C, %m N et

77

%m H) obtenus par analyses élémentaires. Ainsi, t est évaluée à 0,85 (AE) et 0,83 (ATG) pour l’OC 2,5k et 0,77 (AE) et 0,74 (ATG) pour l’OC 5k.

En conclusion, une unité structurale moyenne de l’OC 2,5k est donc constituée de x=0,97 moles de GlcN et y=0,03 moles de GlcNAc, z=0,55 moles de lactate, w=0,48 moles d’ions chlorure et t=0,85 moles d’eau. Cette unité monomère peut donc s’écrire :

H-(C6O4NH11)0,97(C8O5NH13)0,03-OH, (C3O3H6)0,55, (Cl)0,48,(H2O)0,85. Elle possède une masse molaire de 254 g.mol^-1 et un DP de 11.

Une unité structurale moyenne de l’OC 5k est quant à elle constituée de x=0,88 moles de GlcN et y=0,12 moles de GlcNAc, z=0,69 moles d’acétate, et t=0,77 moles d’eau. Cette unité monomère peut donc s’écrire :

H-(C6O4NH11)0,88(C8O5NH13)0,12-OH, (C2O2H4)0,69, H2O)0,77. Elle possède une masse molaire de 226 g.mol^-1 et un DP de 17.

Titrage acido-basique des OC

La Figure 41 montre l’évolution du pH et de la conductivité des solutions de OC 2,5k (a) et OC 5k (b) acidifiées par HNO3 à 1M et titrées par NaOH à 0,035M (pH et conductivité

= f(VNaOH)).

Pour les deux titrages, on observe deux sauts de pH distincts par pH-métrie alors que trois changements de pente sont observés par conductimétrie. Cela indique que trois espèces sont titrées : les ions nitrate, les ions lactate (pKa=3,9) dans le cas de l’OC 2,5k, les ions acétate (pKa=4,9) dans le cas de l’OC 5k et enfin les fonctions ammonium des OC. Les deux premiers sauts de pH ne sont pas distincts car les espèces ont des pKa proches.

Pour l’OC 2,5k, on a déterminé z= 0,55, 3,8 meqN.g^-1 et un pKa moyen de 6,7.

Pour l’OC 5k, on a déterminé z= 0,69, 4,3 meqN.g^-1 et un pKa moyen de 6,3.

Ces résultats ont été rapportés dans le Tableau 3.

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Figure 41 : Courbes de titrages acido-basiques par pH-métrie et conductimétrie des OC 2,5k (a) et 5k (b) par NaOH préalablement acidifiés par HNO3 1 mol.L^-1