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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Benghiat, F. (2007). Contrôle de la réaction allogénique par les lymphocytes T régulateurs naturels (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.

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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES - FACULTE UE MEDECINE

Contrôle de la réaction

allogénique par les lymphocytes T régulateurs naturels

Fleur SdrnambJi Benghwf Décembre 2007

Promoteurs : Docteur Alain Le Moine Professeur Michel Gold'inan

THESE DE DOCTORAT PRESENTEE EN VUE DE L’OBTENTION DU TITRE-ACADEMIQUE DE

DOCTEUR EN SCIENCES MEDICALES

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES - FACULTE DE MEDECINE

Contrôle de la réaction

allogénique par les lymphocytes T régulateurs naturels

Fleur Samantha Benghiat Décembre 2007

Promoteurs : Docteur Alain Le Moine Professeur Michel Goldman

THESE DE DOCTORAT PRESENTEE EN VUE DE L'OBTENTION DU TITRE ACADEMIQUE DE DOCTEUR EN SCIENCES MEDICALES

Ui r’ - ^f TTîi:i!S i-ra-:.me Bibliothèque n-, iVeoecios; ^

Rouiô ht? U' •' ■' èOH (Bat.E)

3~ 1070 Bruxelles

Tél.: ■^-'-55.61.70

THESE DEFENDUE EN SEANCE PRIVEE LE 05 DECEMBRE 2007 ET EN SEANCE PUBLIQUE LE 18 DECEMBRE 2007

Composition du jury de thèse :

Président : Pierre Bergmann Secrétaire : Michel Goldman

Experts ULB ; Jean Content, Stéphane Schurmans, Hubert Louis, Alain Le Moine Experts étrangers :

Oberdan Léo (IBMM) et Stephen P. Cobbold (Dunn School of Pathology, Oxford)

THESE DE DOCTORAT PRESENTEE EN VUE DE L’OBTENTION DU TITRE ACADEMIQUE DE

DOCTEUR EN SCIENCES MEDICALES

Ce qui pose problème n'est pas ce que nous ne savons pas, c'est ce que nous tenons pour certain et qui ne l'est pas.

Mark Twain

Merci

Michel Goldman, pour m’avoir accueilli dans votre laboratoire, pour votre disponibilité, pour votre écoute et vos conseils tant sur le plan humain que scientifique.

Alain, d’avoir systématiquement trouvé une solution. Merci d’avoir supervisé ce travail pratiquement 7 jours sur 7 et 24 heures sur 24 pendant 1640 jours. Merci pour tes idées géniales, ton enthousiasme débordant, ton humour décapant, ta spontanéité, ta confiance sans limite, ton indulgence devant mes doutes et mes angoisses, ton amitié.

Maman, d’avoir toujours les mots justes. Merci pour ta douceur, ta bienveillance, ton indéfectible partialité en ma faveur.

Michel, qui prend si bien soin de Maman.

Philippe, de m’avoir inlassablement redonné le sourire et remonté le moral.

Benoît, d’avoir rendu cette thèse lisible. Merci pour ton amour, ta tendresse, ta maladresse, ton soutien, ta patience. Merci d’avoir été près de moi et d’être encore là.

Remerciements | 3

Un tout grand merci également à toutes celles et ceux :

qui ont pris leur temps pour m’expliquer ce qu’est une pipette ;

qui ont passé des heures interminables sous la hotte ou dans l’animalerie à m’aider dans mes manips titanesques de jour comme de nuit et parfois même les jours fériés ;

- qui ont lu et encore relu ce manuscrit à la recherche du mot juste ;

- avec qui j’ai eu de fructueuses discussions concernant mes résultats bizarres, les Tregs, les Thl7, la transplantation ;

avec qui j’ai refait le monde à la cafet’ du labo ;

- dont le sourire dans les couloirs a fait que c’était un plaisir de venir travailler ;

- qui m’ont emmené jusqu’au zoning industriel de Gosselies lorsque ma vieille Twingo n’en pouvait plus ;

- qui m’ont écouté me plaindre des problèmes d’animalerie ;

qui sont tombés dans les pommes alors que je disséquais leurs souris ; qui ont maintes fois sauvé l’ordinateur que je maltraitais inconsciemment ; qui ont subi mon harcèlement moral concernant le suivi des commandes ; qui ont fait des paris qu’ils ont perdu ;

- qui ont essayé de me faire faire du sport pour me détendre (bien essayé !) ; - qui m’ont prêté des BD pour me dissuader de lire des articles sérieux ; - qui m’ont ouvert les portes à chaque fois que j’oubliais mon badge ;

- qui se sont moqués de moi quand j’arrivais avec ma feuille de salade pour seul repas ; - qui ont pelé mes mandarines parce que j’ai horreur de le faire ;

- qui se sont occupés de mes souris ;

- qui m’ont coaché pour que je devienne un peu plus diplomate ; - qui m’ont presque fait hurler de rire au séminaire du mardi ;

qui ont tenté de faire pousser du lierre dans ce bureau à l’atmosphère désertique ; - avec qui j’ai fait la fête jusqu’au bout de la nuit.

R e in e r c i e m e n t s | 4

TABLE DES MATIERES__________________

Errata... 8

SUMMARY...9

RESUME... 10

ABREVIATIONS... 11

INTRODUCTION... 12

1 L’alloréactivité... 12

1.1 La réponse allogénique... 12

1.1.1 Définition de l’alloantigène... 12

1.1.1.1 Les complexes majeurs d’histocompatibilité (CMH)...13

1.1.1.2 Les antigènes mineurs... 14

1.1.2 Induction de la réponse allogénique... 14

1.1.2.1 Présentation de l’alloantigène par les APC... 14

1.1.2.2 Activation des lymphocytes alloréactifs... 15

1.1.3 Populations effectrices et rejet d’allogreffe... 16

1.1.3.1 Les lymphocytes T CD8^ alloréactifs... 16

1.1.3.2 Les lymphocytes T CD4''’ alloréactifs... 16

1.2 Le rejet d’allogreffe : aspects cliniques... 18

1.2.1 Rejet aigu... 18

1.2.2 Rejet chronique... 19

1.3 Les limites des traitements actuels du rejet d’allogreffes... 19

2 La tolérance immune... 20

2.1 La tolérance au soi... 20

2.1.1 Introduction...20

2.1.2 La tolérance centrale : de la sélection thymique à la génération de lymphocytes T régulateurs naturels...20

2.1.3 La tolérance périphérique... 22

2.1.3.1 L’anergie... 22

2.1.3.2 La délétion... 22

2.1.4 Les lymphocytes T régulateurs... 23

Table des m a tiè r c s |5

2.1.4.1 Les lymphocytes T régulateurs naturels (nTregs)... 23

A. Historique... 23

B. Phénotype... 24

B. 1. Le CD25 et le rôle de l’IL-2...24

B. 2. Foxp3... 25

B. 3. Le CTLA-4 et le CD28... 26

B. 4. LeGITR... 27

B. 5. Les autres molécules... 27

C. Mécanismes de suppression des Tregs...28

C. 1. La suppression in vitro... 28

C. La. Le rôle de l’IL-2 in vitro... 29

C. 1. b. Le rôle du CTLA-4 et de ses ligands CD80 et CD86 in vitro...29

C. 2. La suppression in vivo... 29

C. 2. a. La circulation des Tregs in vivo... 30

C. 2. b. Le rôle des cellules non-T dans la fonction des Tregs... 31

C. 2. c. Génération de novo de Tregs à partir de lymphocytes T naïfs ; notions de Tregs induits... 32

D. Mécanismes d’échappement à la suppression... 34

2.1.4.2 Spécificité antigénique... 35

2.1.4.3 Expansion des Tregs in vivo et prolifération homéostatique...36

2.2 La tolérance en transplantation... 38

2.2.1 La tolérance centrale en transplantation... 38

2.2.2 La tolérance périphérique en transplantation...38

2.2.2.1 Les notions d’infectious tolérance et de linked suppression... 38

2.2.2.2 Les mécanismes de maintien de la tolérance périphérique...40

2.2.2.3 La spécificité antigénique des Tregs responsables de la tolérance... 40

3 L’interleukine (IL)-17...42

3.1 Introduction...42

3.2 La famille de l’IL-17 et des récepteurs à l’IL-17... 42

3.3 Immunobiologie de l’IL-17... 43

3.3.1 LesThl7...43

Table des m a tiè r c s |6

3.3.1.1 Interactions entre les Th 17 et les cytokines de la famille de lTL-12...43

3.3.1.2 Différenciation des Th 17... 44

3.3.1.3 Régulation des lymphocytes Thl7 différenciés... 46

A. Les cytokines stimulatrices...46

B. Les cytokines inhibitrices... 47

C. Les Tregs... 47

3.3.2 Effets de ITL-17... 48

3.3.2.1 Effet de lTL-17 sur les cellules du système immunitaire... 48

A. Effet sur les polynucléaires neutrophiles et les monocytes/macrophages... 48

B. Effet sur les lymphocytes T...49

C. Effet sur les cellules dendritiques (DC)...49

D. Effet sur les lymphocytes B...49

3.3.2.2 Etudes in vivo...49

A. Maladies auto-immunes... 49

B. Infections...50

C. Allergie...50

D. Cancers...51

E. Transplantation...51

4 Modèles expérimentaux... 52

4.1 Les souris C57BL/6 (B6) et C57BL/6.C-H-2‘’"''^ (bml2), modèle de disparité de CMH de classe II... 52

4.2 Les souris A1(M), modèle transgénique de réactivité anti-H-Y... 52

BUT DU TRAVAIL...54

RESULTATS... 55

1 Rôle des lymphocytes T régulateurs naturels dans l’acceptation spontanée d’allogreffe en l’absence d’immunosuppresseur... 55

2 Rôle des cellules CD4^CD25"^ dans la production d’IL-17 engendrée par la reconnaissance d’un CMH de classe II allogénique... 64

DISCUSSION ET PERSPECTIVES... 86

1 Des Tregs induits aux Tregs naturels... 86

2 Interactions avec l’effet suppresseur des Tregs... 89

3 Rôle des Tregs chez l’homme... 91

4 L’utilisation des Tregs en clinique... 93

5 Perspectives : les Th 17 in vivo... 95

6 Thl7 : des souris et des hommes ?... 97

BIBLIOGRAPHIE...99

ANNEXES...111

Errata

p.l3

Remplacer : « Le fait que ces gènes soient polygéniques (plusieurs gènes codent pour les molécules de CMH) et polyalléliques (plusieurs allèles constituent chaque gène) permet l’existence d’un très grand nombre de CMH différents au sein d’une même population. »

Par : « Le fait que ces gènes soient polymorphiques permet l’existence d’un très grand nombre de CMH différents au sein d’une même population. »

p.l4

Remplacer : « Cette grande diversité assure l’existence de CMH capables de lier un éventuel peptide provenant d’un germe pathogène dans une même population et, en conséquence, garantit la survie de l’espèce mais, par ailleurs, réduit les chances de trouver un dormeur d’organe histocompatible. »

Par : « Cette grande diversité assure l’existence de CMH capables de lier un éventuel peptide provenant d’un germe pathogène, en conséquence, garantit la survie de l’individu mais, par ailleurs, réduit les chances de trouver un donneur d’organe histocompatible. »

p.96

Remplacer : « Cette approche est d’autant plus importante que la neutralisation de l’IL-6 à l’aide d’anticorps est déjà possible en clinique^^^. »

Par : « Cette approche est d’autant plus importante que la neutralisation du récepteur de l’IL-6 à l’aide d’anticorps est déjà possible en clinique^^^. »

Table des m a t i è r e s |8

SUMMARY

Major histocompatibility complex (MHC) polymorphism is a major hindrance to transplantation success. Both minor and major antigen disparities between donor and récipient increase the risk of transplant rejection. This is thwarted by the administration of an immunosuppressive therapy that unspecifically affects ail immune responses therefore increasing the risk of infections and cancers. Besides, this treatment does not seem to prevent chronic rejection.

Recent studies hâve confirmed the existence of lymphocytes called regulatory T cells (Tregs), whose rôle is to maintain the general immune homeostasis and to protect the individual from autoimmune diseases.

The classically described Tregs express constitutively the CD4 antigen, the a chain of the interleukin (IL)-2 receptor (CD25) and the transcription factor Foxp3. They represent 5 to 10% of total 004"^ T cells. Tregs are able to control alloreactive responses and were described to be responsible for the maintenance of allograft tolérance in mice. So far, the tolerogenic capacities of Tregs hâve been demonstrated either in mice treated with immunomodulatory antibodies (induced Tregs) or by adoptive co-transfer of Tregs and effector cells into lymphopénie mice.

However, the latter has the disadvantage of not being able to distinguish the effect of Treg on lymphopenia-induced homeostatic prolifération from their effect on alloreactive responses.

Herein, we show that Tregs play a crucial rôle in spontaneously accepted allografts in the absence of immunosuppressive therapy and in non-lymphopenic condition. Indeed, the déplétion of the récipient’s Tregs through the administration of an anti-CD25 antibody enhances type-Thl and type-Th2 allogeneic responses, consequently triggering allograft rejection. However, the regulatory properties of Tregs are not unlimited. Indeed, we found that Tregs are unable to control allogeneic IL-17 production by memory CD4'^ T cells and are even necessary for de novo Th 17 différentiation.

We conclude, therefore, that Tregs naturally présent in the récipient play a critical rôle in protecting the allograft. Nevertheless, despite this context of régulation, IL-17-producing alloreactive T cells, beyond the control of Tregs, could médiate an alternative pathway of allograft rejection.

S U rn m a r y | 9

RESUME

Le polymorphisme et le polygénisme des complexes majeurs d’histocompatibilité (CMH) limitent les succès de la transplantation. En effet, les disparités, tant d’antigènes mineurs que majeurs, exposent le patient transplanté au risque de rejet et imposent l’administration d’un traitement immunosuppresseur. Ce dernier affecte de façon non spécifique l’ensemble des réponses immunitaires et augmente le risque d’infections mortelles et de cancers. En outre, ce traitement ne semble pas prévenir le rejet chronique.

Des découvertes récentes ont confirmé l’existence de lymphocytes appelés régulateurs (Tregs) dont le rôle est de garantir l’homéostasie des réponses immunes afin qu’elles ne deviennent incontrôlées et pathologiques. Les Tregs classiquement décrits expriment de manière constitutive l’antigène CD4”^, la chaîne a du récepteur de l’interleukine (IL)-2 (CD25) et le facteur de transcription Foxp3. Ils représentent 5 à 10% des lymphocytes CD4^ totaux. Les Tregs sont capables de réguler des lymphocytes alloréactifs et ont été décrits comme responsables du maintien de la tolérance d’allogreffe chez la souris. Mais jusqu'alors, les modèles employés pour démontrer l'importance des Tregs en transplantation utilisaient soit un traitement immunosuppresseur transitoire, soit des transferts de cellules T dans des souris lymphopéniques.

Toutefois, ces derniers ne permettent pas de distinguer l'effet des Tregs sur la prolifération homéostatique des lymphocytes effecteurs de leur effet sur la réponse allogénique.

Dans notre travail, nous montrons que les Tregs jouent un rôle prépondérant dans l’acceptation spontanée d’allogreffes en l’absence d’immunosuppresseur et en dehors d’un contexte lymphopénique chez la souris. En effet, la déplétion des Tregs du receveur par l’administration d’anticorps anti-CD25 amplifie les réponses allogéniques de type Thl et Th2 et, par conséquent, déclenche le rejet d’allogreffe. Les propriétés régulatrices des Tregs ne sont cependant pas illimitées. En effet, dans un second travail, nous décrivons, d’une part, leur incapacité à contrôler la production d’IL-17 par des lymphocytes CD4^CD25’’°* mémoires et, d’autre, part leur implication directe dans la différenciation de cellules Thl 7 au départ de lymphocytes CD4‘^CD25"'® alloréactifs.

Nous concluons donc que si les Tregs naturellement présents chez le receveur jouent un rôle primordial dans la protection du greffon contre des réponses de type Thl ou Th2, ils pourraient néanmoins favoriser une voie alterne du rejet d’allogreffe dépendante de l’IL-17.

Résumé | 10

ABREVIATIONS

Xxx ''' : Souris knock out pour le gène Xxx ADCC : Antibody Dépendent Cell Cytotoxicity Ag : Antigen

AICD : Activation Induced Cell Death APC : Antigen Presenting Cell BM : Bone Marrow

CCL : Chemokine Ligand CCR : Chemokine Receptor

CMH : Complexe Majeur d’Histocompatibilité CML : Culture Mixte Lymphocytaire

CD : Cluster of Différentiation CIA : Collagen-Induced Arthritis CTL : Cytotoxic T Lymphocyte

CTLA-4 : Cytotoxic T-lymphocyte-assaciated protein 4

DC : Dendritic Cell

EAE : Experimental Autoimmune Encephalitis Foxp3 : Forkhead box P3

GITR : Glucocorticoïd-induced TNF receptor- related gene

GVHD : Graft versus Host Disease HLA : Human Leukocyte Antigen H-Y : Y chromosome-encoded minor histocompatibility antigens

IBD : Inflammatory Bowel Disease ICAM : Intercellular Adhesion Molécule-1

IDO : Indoleamine 2,3-Dioxygenase IFN : Interferon

Ig : Immunoglobuline IL : Interleukin JAK : Janus Kinase LPS : LipoPolySaccharide mAb : Monoclonal Antibody

MHC : Major Histocompatibility Complexe MLC/MLR : Mixed Lymphocyte Culture / Reaction

mRNA : messenger RiboNucleicAcid NFAT : Nuclear Factor of Activated T cells NF-

B : Nuclear Factor kappa B

NK : Natural Killer

PBMC : Peripheral Blood Mononuclear Cells RAG : Recombinase Activating Gene STAT : Signal Transducer and Activator of Transcription

TCR : T Cell Receptor

TGF-p : Transforming Growth Factor P Tregs : Regulatory T Lymphocytes Teffs : EffectorT Lymphocytes Th : Helper T cells

TLR : Toll-Like Receptor TNF : Tumor Necrosis Factor WT : Wild Type

Abréviations | 11

I ntroduction

INTRODUCTION

1 L'alloréactivité

L’efficacité du système immunitaire repose sur sa capacité à distinguer le « soi » du « non-soi ».

En équilibre, il maintient l’intégrité des structures propres à l’individu (soi) tout en éliminant les intrus (non-soi) tels que les pathogènes infectieux ou les cellules tumorales. Lors de la greffe d’un organe génétiquement différent (allogénique), le système immunitaire du receveur réagit vigoureusement contre le tissu étranger, ce qui mène au rejet de celui-ci. Aujourd’hui, cet obstacle est contourné par l’administration de traitements immunosuppresseurs.

Malheureusement, plusieurs inconvénients limitent leur efficacité. D’une part, ces traitements altèrent l’ensemble des réponses immunitaires, augmentant le risque relatif d’infections mortelles et de cancers. D’autre part, malgré une immunosuppression importante, ils ne semblent pas abolir la survenue du rejet chronique.

Dans ce chapitre, nous allons voir quels sont les différents types d’alloantigènes, ou antigènes de transplantation, comment leur reconnaissance par le système immunitaire du receveur induit le rejet, comment se déroule la réponse allogénique et, finalement, quelles sont les conséquences de cette réponse pour le greffon.

1.1 La réponse allogénique

1.1.1 Définition de l’alloantigène

Le terme allogreffe {allô en grec signifiant «autre») fait référence à toute cellule, tout tissu ou organe transplanté entre deux individus génétiquement distincts d’une même espèce. Le rejet d’allogreffe résulte de la reconnaissance par l’hôte de variantes polymorphiques de protéines appelées alloantigènes. Ces derniers, exprimés par la greffe, sont subdivisés en deux grandes catégories. D’une part, les antigènes du complexe majeur d’histocompatibilité - CMH ou Human Leucocyte Antigen (HLA) - de classe 1 et de classe II et, d’autre part, les antigènes mineurs.

Introduction | 12

1.1.1.1 Les complexes majeurs d’histocompatibilité (CMH)

Le rôle physiologique des CMH de classe I et de classe II est de fixer des peptides provenant de la dégradation de protéines, par exemple de pathogènes, et de les présenter aux lymphocytes T appropriés. Le lymphocyte T reconnaît par son récepteur T (TCR) le peptide antigénique présenté dans le CMH. Dans le cas d’une infection, l’interaction entre la cellule T et la cellule présentatrice d’antigène (APC) conduit à leur activation mutuelle et in fine à la destruction du pathogène.

La topographie, la nature du peptide présenté ainsi que le type de lymphocytes répondeurs dépendent du type de CMH considéré :

- Les CMH de classe I (nommés HLA-A, -B et -C chez l’homme et H-2K, H-2D et H-2L chez la souris) sont exprimés de manière constitutive à la surface de toutes les cellules. Le rôle des CMH de classe I est de présenter des peptides endogènes, c’est-à-dire présents dans le cytoplasme des cellules (comme des peptides viraux ou tumoraux), aux lymphocytes T CD8^

qui, dès lors, s’activent et se différencient en lymphocytes cytotoxiques (CTL) capables de lyser spécifiquement les cellules qui présentent l’antigène.

- Les CMH de classe II (appelés HLA-DR, -DP et -DQ chez l’homme et I-A et I-E chez la souris), à l’état de base, ne sont exprimés qu’à la surface des APC, à savoir les cellules dendritiques (DC), monocytes, macrophages et lymphocytes B. Néanmoins, l’expression membranaire des CMH de classe II peut être induite par certaines cytokines comme les interférons (IFN-y, -a, ~P) sur d’autres types cellulaires (cellules endothéliales, tubulaires rénales, kératinocytes, etc.) et chez l’homme, à la différence de la souris, l’expression du CMH de classe II est également inductible sur les lymphocytes T. Le rôle des CMH de classe II est de présenter aux lymphocytes T CD4'^ des peptides exogènes, c’est-à-dire provenant de protéines extracellulaires préalablement phagocytées et apprêtées.

Chez l’homme, différents gènes codent pour différents CMH. On reconnaît trois gènes codant pour les molécules de classe I (HLA-A, -B, -C) et au moins trois autres gènes pour les molécules de classe II (HLA-DP, -DQ, -DR). De plus, chez une même personne, les gènes des CMH sont exprimés de manière codominante. En d’autres termes, un individu exprime une variante (ou allèle) de chacun de ses parents. Le fait que ces gènes soient polygéniques (plusieurs gènes codent pour les molécules de CMH) et polyalléliques (plusieurs allèles constituent chaque gène) permet l’existence d’un très grand nombre de CMH différents au sein d’une même population.

Introduction | 13

Cellule du iqreffon Réœpteur T

CMH de classe Il allogénique CMH de classe I

allogénique

APC du receveur APC du donneur

□ Donneur

■ Receveur

Figure 1 : Présentation indirecte et directe des alloantigènes.

Voie indirecte: les protéines allogéniques sont phagocytées par les APC de l’hôte, ensuite apprêtées et présentées aux lymphocytes CD4^ sous forme de peptides dans un CMH de classe II du receveur.

Voie directe: présentation du CMH de classe I ou II du donneur sous forme intacte aux lymphocytes CD 8 "^ et CD4^ de l’hôte, respectivement.

Cellule présentatrice d’antigène (APC), Complexe majeur d’histocompatibilité (CMH)

Tout individu possède une combinaison de CMH qui lui est propre et qui permet à son système immunitaire de discriminer le « soi » du « non-soi ». Cette grande diversité assure l’existence de CMH capables de lier un éventuel peptide provenant d’un germe pathogène dans une même population et, en conséquence, garantit la survie de l’espèce mais, par ailleurs, réduit les chances de trouver un donneur d’organe histocompatible.

Lorsque le receveur reçoit une greffe comportant des disparités d’antigènes majeurs, un grand nombre de lymphocytes alloréactifs sont alors activés. Cette haute fréquence du répertoire alloréactif est liée, d’une part, à l’important polymorphisme auquel sont sujets ces alloantigènes et, d’autre part, à l’existence d’une voie de reconnaissance de l’alloantigène qui est unique à la transplantation : la voie directe de reconnaissance (cf Présentation de l’alloantigène, ci-dessous).

1.1.1.2 Les antigènes mineurs

Les antigènes mineurs de transplantation représentent toutes les molécules sujettes à un polymorphisme au sein d’une population et qui ne sont ni un CMH de classe I, ni un CMH de classe II. La réactivité aux antigènes mineurs est moins puissante que celle liée à la présence d’antigènes majeurs étant donné le répertoire de précurseurs lymphocytaires T moins important.

Chez la souris, les antigènes mâles H-Y codés par le chromosome Y sont reconnus par les femelles comme étant des antigènes mineurs de transplantation. Mais la réponse contre ces antigènes varie selon la souche de souris étudiée. Ainsi, les femelles C57BL/6 (H-2*’) rejettent rapidement une greffe de peau mâle alors que les femelles bml2 (H-2*”"'^) ou CBA/Ca (H-2'') sont incapables de la rejeter à moins qu’elles n’aient été préalablement immunisées (cf Modèles expérimentaux, p.52)'’^.

1.1.2 Induction de la réponse allogénique

1.1.2.1 Présentation de l’alloantigène par les APC

Dans le ganglion, les CMH de classe I et de classe II allogéniques peuvent être présentés de deux manières aux lymphocytes T (figure 1) :

(1) Par la voie indirecte de présentation des alloantigènes.

Dans ce cas, les molécules de CMH allogéniques ont été préalablement phagocytées par une APC de l’hôte et ensuite apprêtées (comme tous les antigènes extracellulaires) pour être finalement présentées sous forme de peptides dans le sillon d’un CMH de classe II de l’hôte.

Introduction | 14

APC

CD40 Signal 3

Signal

CD40L CD28

Figure 2: Activation du lymphoQ^e T par l’APC

Cette voie de reconnaissance des alloantigènes ne concerne en général que les lymphocytes CD4^.

(2) Par la voie directe de présentation des alloantigènes.

Le TCR du lymphocyte alloréactif reconnaît le CMH allogénique intact exprimé sur T APC du donneur. Le CMH allogénique sera directement reconnu par un lymphocyte CD4^ s’il s’agit d’un CMH de classe II ou par un lymphocyte CD8^ s’il s’agit d’un CMH de classe I.

1.1.2.2 Activation des lymphocytes alloréactifs

Après la transplantation, les APC du donneur résidant dans le greffon et les APC du receveur ayant apprêté des peptides allogéniques migrent vers les tissus lymphoïdes avoisinants pour présenter l’alloantigène aux lymphocytes directement et indirectement respectivement. Pour être activés, les lymphocytes nécessitent, outre l’engagement de leur TCR par la reconnaissance de l’alloantigène (signal 1), des signaux de costimulation (signal 2), lesquels abaissent leur seuil d’activation (figure 2). L’absence de ce second signal ne permet qu’une activation suboptimale du lymphocyte qui sera dès lors anergisé, délété ou enfin transformé en lymphocyte régulateur (cf L’anergie, p.22). Lors du second signal, différentes molécules à la surface de l’APC interagissent avec leur ligand à la surface du lymphocyte, telles que des molécules d’adhésion (ICAM-1-LFA-1) et des molécules de costimulation (notamment B7-CD28, CD40-CD40L).

L’APC sécrète alors des cytokines pro-inflammatoires qui activent le lymphocyte et polarisent la réponse lymphocytaire (cf Populations effectrices et rejet d’allogreffe, ci-dessous). L’activation du lymphocyte par le signal 1 et le signal 2 induit plusieurs cascades de signalisation intracellulaire qui aboutissent in fine à la surexpression de molécules d’activation telles que le CD25 (chaîne de haute affinité du récepteur à l’IL-2) et à la sécrétion d’lL-2. Cette dernière agit ensuite de manière autocrine (signal 3) et induit l’expansion clonale des lymphocytes activés. Par la suite, les lymphocytes activés se différencient en cellules effectrices, quittent le ganglion et migrent vers la greffe, où ils rencontrent à nouveau l’alloantigène et mettent en place leurs fonctions effectrices à l’origine du rejet d’allogreffe.

n t r O d U c t i O n | 15

ADCC

Effet inhibiteur

—^ Effet activateur

Figure 3: Différenciation d’un lymphocyte T naïf en lymphocyte Th1 ou Th2.

Antibody-dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC). Lymphocyte B (B). Activation du

complément (C’). Lymphocyte T cytotoxique (CTL). Cellule dendritique (DC). Réaction

d’hypersensibilité retardée (HSR). Radicaux libres (RL)

1.13 Populations effectrices et rejet d’allogreffe

1.1.3.1 Les lymphocytes T CD8^ alloréactifs

Les lymphocytes T CD8”^ jouent un rôle majeur dans les modèles de rejet d’allogreffe où donneur et receveur se distinguent par leurs CMH de classe I (disparité de CMH de classe I). En effet, une fois activés, les lymphocytes CD8^ acquièrent des propriétés cytotoxiques qui leur permettent de lyser les cellules allogéniques du greffon. Après la reconnaissance par la voie directe du CMH de classe I sur les cellules allogéniques, les lymphocytes CD8^ sécrètent la perforine. Cette dernière s’insère dans la membrane cellulaire de la cellule allogénique et y forme une sorte de tunnel au travers duquel le granzyme pourra pénétrer dans la cellule pour y activer des molécules proapoptotiques. Le rôle in vivo de cette voie a été mis en évidence au moyen de receveurs Perforin'' dans lesquels le rejet d’une allogreffe comportant une disparité isolée du CMH de classe I est significativement retardé^. Cependant, le rejet d’allogreffe peut avoir lieu dans des souris Cd8'^', suggérant qu’il existe d’autres mécanismes effecteurs impliquant notamment les lymphocytes CDA* alloréactifs"*.

1.1.3.2 Les lymphocytes T CD4^ alloréactifs

Les lymphocytes T CD4'^ jouent un rôle primordial dans le rejet d’allogreffe, comme le démontrent les souris Cd4'^' qui sont incapables de rejeter un greffon allogénique"*. En effet, lors d’une réaction allogénique, les lymphocytes CD4'^ activés peuvent se différencier en trois sous-types distincts de cellules effectrices classées en fonction de leur production cytokinique et des faeteurs de transcription qu’elles possèdent. La différenciation des lymphocytes CD4‘^ naïfs en l’un de ces sous-types est prineipalement dépendante de l’environnement cytokinique dans lequel ils se trouvent^ (figure 3).

Les lymphocytes de type Th 1

L’IL-12 est une cytokine essentielle au développement des Thl. Elle est principalement produite par les DC matures et les macrophages activés suite à l’engagement du CD40 à leur surface®. Elle agit sur son récepteur à la surface du lymphocyte T, dans lequel elle induit une cascade de signalisation dépendante du facteur de transcription STAT4 qui aboutit à la production d’IFN-y, cytokine signature des Thl. L’IFN-y agit ensuite de manière autocrine et consolide la différenciation des lymphocytes Thl. Chez ces derniers, il induit une cascade de signalisation par

ntroduction |l6

A B

DMECT PORBCT

RECOGMmON _________REDOGWnnOM

^ »» - -f - - rJmfWng

-<

:AUo-MHC class I

=< ;Allo-MHC class II

^ ;Recipient-N(HC class II with allo-peptide

^ : Granule with perforin (II) and granzyme ( )

Le Moine, A. 2004 Transplantation^^

Figure 4: Les mécanismes effecteurs du rejet

l’intermédiaire de STATl qui active le facteur de transcription-clé des Thl, T-bet (pour Thl-specific T box transcription factorf. T-bet, en plus de renforcer la production d’IFN-y, active la synthèse de la chaîne |32 du récepteur à l’IL-12. Au niveau de la DC, l’IFN-y potentialise la production d’IL-12.

Cette polarisation Thl de la réponse immune est exclusive en ce sens qu’elle inhibe la polarisation Th2. Ainsi, TIFN-y, via l’activation de T-bet, réprime l’expression du facteur de transcription clé des Th2, GATA-3*. L’IFN-y est produit non seulement par les lymphocytes Thl, mais aussi par les lymphocytes T CDS"^. Il a d’ailleurs été montré que l’activation des lymphocytes T CD8"^ par la voie directe de présentation de l’alloantigène (reconnaissance du CMH de classe I sur une APC du donneur) et, conséquemment, leur production précoce d’IFN-y prévient la génération de lymphocytes Th2 et polarise la réponse allogénique vers une réponse de type Thl’’'®. L’IFN-y produit par les lymphocytes Thl incite en retour les lymphocytes CD8^ à se différencier en lymphocytes cytotoxiques (CTL). Dans le contexte d’un rejet d’allogreffe de type Thl (disparité de CMH de classe I et de classe II, figure 4A), les lymphocytes T CD4^ et CD8'^

agissent :

1) directement, en lysant eux-mêmes les cellules du greffon grâce à leurs propriétés cytotoxiques. Contrairement aux lymphocytes T CD8"'', l’activité cytotoxique des lymphocytes Thl passe essentiellement par l’induction de Fas-ligand (Fas-L) à la surface des Thl activés qui reconnaît la molécule Fas exprimée constitutivement par de nombreuses cellules. L’engagement de Fas induit une cascade de signalisation menant in fine à l’apoptose de la cellule allogénique ;

2) indirectement, en faisant appel à d’autres types cellulaires". Il favorise également la synthèse par les lymphocytes B d’immunoglobulines (Ig) liant le complément (IgG2a). Ces Ig se fixent à la surface des cellules allogéniques et induisent leur mort par l’activation de la cascade du complément ou par l’activation de cellules NK qui, en se liant à la partie constante de l’ig, détruisent les cellules {antibody-dependent cell mediated cytotoxicity ou ADCC). Finalement, les lymphocytes Thl et CD8"^, via leur production d’IFN-y et de TNF-a, stimulent les macrophages à produire des radicaux libres, du monoxyde d’azote et du TNF-a qui concourent aux réactions d’hypersensibilité retardée. Ces dernières sont caractérisées par un œdème tissulaire eonsécutif à une perméabilité capillaire accrue accompagnée d’une

Introduction | 17

infiltration massive du greffon par des lymphocytes T, des macrophages, des neutrophiles et des cellules NK qui participent au rejet d’allogreffe.

Les lymphocytes de type Th2

Le facteur primordial pour la différenciation des lymphocytes €04"^ naïfs en Th2 est l’IL-4. Cette dernière est produite par les mastocytes, les basophiles et les cellules Th2. Il semble que les lymphocytes €04"^ naïfs soient eux-mêmes la source initiale d’IL-4 lors de la différenciation en Th2'^. La cascade de signalisation engendrée par l’engagement du récepteur de l’IL-4 à la surface du lymphocyte T active, via le facteur de transcription STAT6, la synthèse d’IL-4 et le facteur de transcription GATA-3. Ce dernier promeut la transcription de gènes Th2, tels que ceux codant pour l’IL-5 et l’IL-13. La polarisation Th2 est elle aussi exclusive. Ainsi, l’IL-4 prévient la différenciation Thl, d’une part, en réprimant l’expression de STAT4, d’autre part, en inhibant la production d’IL-12 par les DC'^’’'*. Les rejets d’allogreffe de type Th2 ont été décrits dans des modèles de disparité isolée du CMH de classe II (figure 4B) dans lesquels les lymphocytes T CD8^ ne reconnaissent pas l’alloantigène ou dans des modèles de disparité de CMH de classe I et de classe II où les lymphocytes CD8^ sont neutralisés à l’aide d’anticorps^’'”’'^. Dans ces modèles, le rejet d’allogreffe est mixte (Thl et Th2) et caractérisé par un infiltrat massif à éosinophiles". En effet, les lymphocytes Th2, via leur production d’IL-4, d’IL-5 et d’IL-13, recmtent et activent les éosinophiles, effecteurs du rejet d’allogreffe.

- Les lymphocytes de type Th 17

Le rôle des lymphocytes Th 17 sera abordé de manière détaillée dans un chapitre ultérieur (cf.L’IL-17,p.42).

1,2 Le rejet d^allogreffe : aspects cliniques

Le rejet d’allogreffe est classé selon le type de lésions histologiques observé et le moment de survenue plus ou moins précoce après la transplantation.

1.2.1 Rejet aigu

Le rejet aigu survient durant le premier trimestre suivant la transplantation. Il se manifeste par une perte brutale de la fonction du greffon avec des images histologiques d’œdème accompagné d’un infiltrat cellulaire interstitiel diffus composé de lymphocytes T, de macrophages et de

Introduction |l8

granulocytes. L’incidence du rejet aigu a drastiquement diminué grâce au développement de différentes stratégies immunosuppressives. Le traitement classique du rejet aigu de greffe rénale consiste en l’administration de corticostéroïdes. L’administration de sérums anti-lymphocytaires polyclonaux est réservée aux rejets résistants aux corticostéroïdes, ce dernier immunosuppresseur étant très puissant. La survenue d’épisodes de rejet aigu est un facteur prédictif de l’apparition d’un rejet chronique et s’avère dès lors de mauvais pronostic pour la survie du greffon à long terme.

1.2.2 Rejet chronique

Le rejet chronique de greffe se caractérise par un déclin progressif et irréversible de la fonction du greffon. Malgré les traitements immunosuppresseurs actuellement disponibles, il constitue un obstacle majeur à la survie de l’allogreffe. Ce rejet s’accompagne de lésions histologiques de fibrose interstitielle inflammatoire et, pour les greffes rénales et cardiaques, d’endartérite fibroproliférative (prolifération des cellules musculaires lisses des vaisseaux). La pathogénie du rejet chronique est moins bien comprise que celle du rejet aigu. La fibrose observée pourrait être liée à la production de cytokines qui stimulent les fibroblastes (TGF-P), à la cicatrisation d’épisodes multiples de rejet aigu ou encore à l’occlusion progressive des artères qui mène à l’infarcissement des tissus, l’altération des fonctions de la greffe et finalement à sa perte.

1.3 Les limites des traitements actuels du rejet d’allogreffes

Le rejet aigu d’allogreffe est aujourd’hui contourné par l’administration de traitements immunosuppresseurs. Ceux actuellement disponibles ont trois effets : l’effet thérapeutique (suppression du rejet), les effets indésirables liés une immunosuppression globale (infections opportunistes, cancers) et les effets toxiques non-immunitaires sur divers organes (par exemples néphrotoxicité des inhibiteurs de la calcineurine). Malheureusement, les traitements actuels ne prévieiment pas l’apparition du rejet chronique. Néanmoins, certains patients gardent leur allogreffe fonctionnelle avec des doses infimes, voire sans immunosuppresseur. Ces observations démontrent qu’il est possible de tolérer des alloantigènes malgré la multitude de voies menant au rejet. Dans les chapitres suivants, nous récapitulerons les mécanismes impliqués dans la tolérance au « soi » et nous les appliquerons à l’induction de tolérance aux allogreffes.

Introduction |l9

Puissant B. 2004 La revue de médecine inteme^^

Figure 5: Devenir des thymocytes en fonction de i’affinité de ieur TCR pour le complexe CMH-peptide.

Les thymocytes 2, 3 et 4 sont sélectionnés positivement dans le cortex car leurs TCR

reconnaissent les complexes CMH-peptide des APC. Ils subiront (thymocyte 4) ou pas

(thymocyte 2) une sélection négative dans la médullaire. Le devenir des thymocytes 3 est

encore à l’étude.

2 La tolérance immune

2.1 La tolérance au soi

2.1.1 Introduction

S’il défend l’organisme des intrusions, le système immunitaire préserve par contre l’intégrité des structures propres à l’individu (autrement dit, au « soi »). La tolérance immunologique résulte de plusieurs mécanismes actifs qui empêchent les réponses contre les antigènes du « soi ». Ces mécanismes se répartissent en deux catégories suivant qu’ils aient lieu dans le thymus (tolérance centrale) ou en périphérie (tolérance périphérique).

2.1.2 La tolérance centrale : de la sélection thymique à la génération de lymphocytes T régulateurs naturels

Le thymus accomplit deux tâches essentielles dans le maintien de la tolérance au « soi » ; l’élimination, par sélection négative, de lymphocytes T autoréactifs et la production de lymphocytes régulateurs (Tregs) qui contrôlent en périphérie les lymphocytes T autoréactifs qui auraient échappé à la sélection négative.

Lorsqu’ils arrivent dans le thymus, les précurseurs des lymphocytes T (thymocytes) réarrangent tout d’abord les gènes de leur récepteur T (TCR) afin d’exprimer ce dernier à leur surface. Ils subissent ensuite deux sélections successives, l’une positive, l’autre négative, au terme desquelles leur maturation sera achevée (figure 5)'^'‘*.

Les possibilités de combinaison de réarrangements des TCR sont telles qu’elles donnent lieu à un répertoire très diversifié de thymocytes exprimant chacun un TCR particulier. Mais nombre de ces réarrangements donnent lieu à des TCR inutilisables, incapables de lier les complexes majeurs d’histocompatibilité (CMH) de l’individu. La sélection positive permet donc aux seuls thymocytes qui expriment un TCR reconnaissant les molécules du CMH du « soi » de survivre et de poursuivre leur maturation, les autres mourant par négligence. Les lymphocytes T survivants sont donc restreints aux CMH du « soi » : ils sont capables de reconnaître des peptides à condition que ceux-ci soient présentés dans un CMH du « soi ». En présence d’un CMH allogénique, les lymphocytes perdent tous leurs repères et considèrent le complexe CMH-peptide

Introduction | 20

comme étranger et de forte affinité. La sélection positive se déroule dans le cortex thymique où les thymocytes double positif CD4'^CD8’^ interagissent avec des cellules épithéliales.

L’engagement du TCR permet la maturation des thymocytes en cellules simple positive CD8^ ou CD4"^ selon qu’ils aient interagi avec un CMH de classe I ou II respectivement. Ensuite, des récepteurs aux chémokines tels que le CCR7 apparaissent à la surface des thymocytes, attirant ces derniers vers la médullaire où se déroulera la sélection négative’®’^®. Dans la médullaire, les antigènes du « soi » exprimés par les cellules épithéliales représentent virtuellement tous les organes, reflétant ainsi le « soi » périphérique. L’expression de ce large panel d’antigènes du

«soi» est notamment sous le contrôle du promoteur AIRE {autoimmune regulatorf'. Les thymocytes reconnaissent donc le complexe CMH-antigène du « soi » et, en fonction de l’affinité du TCR pour ce complexe, trois cas de figure peuvent s’envisager. Un thymocyte exprimant un TCR de faible affinité pour les antigènes du « soi » échappera à la sélection négative alors qu’une interaction de forte affinité entre le TCR et le complexe CMH-peptide induira la délétion clonale du thymocyte via l’induction de gènes d’apoptose. Enfin, d’autres thymocytes exprimant également un TCR de haute affinité pour les antigènes du « soi » se différencieront en lymphocytes T régulateurs (Tregs) de phénotype CD4^CD25^Foxp3^

Dès lors, comment distinguer un thymocyte de haute affinité qui subira la délétion clonale d’un autre qui se différenciera en Treg? Cette question n’est pas totalement élucidée, mais l’environnement dans lequel se développent les thymocytes semble un facteur essentieP^. Ainsi, des cytokines telles que l’IL-2 ou des molécules de costimulation telles que le CD28 joueraient un rôle primordial mais dispensable. En effet, les souris 112'^', Il2ra'^' {Cd25''') et Cd28'^' peuvent générer des thymocytes Foxp3"^, mais en nombre drastiquement réduit^"*’^^. Dans le cas du CD28, cette diminution est due à l’absence des signaux de costimulation requis, d’une part, par les thymocytes Foxp3"^® pour produire de l’IL-2, d’autre part, par les thymocytes pour se développer en Tregs indépendamment de l’IL-2. En effet, l’ajout d’IL-2 à des précurseurs de moelle Cd28'^' ne permet pas la restauration d’un nombre normal de lymphocytes T Foxp3'^

Ces mécanismes de tolérance au « soi » sont tributaires des facteurs de transcription Foxp3 (forkhead box P3) et AIRE. Les mutations du gène Foxp3 compromettent le développement des Tregs et sont responsables du syndrome auto-immun IPEX {immunodysregulation, polyendocrinopathy and entheropathy, X-linked syndrome) chez l’homme ou Scurjy chez la souris (cf. Foxp3, p.25)^’. Pour leur part, les mutations touchant le gène Aire altèrent les

Introduction | 21

Lymphocytes T activés

Anergie

IL-10

CTLA-4 / PD-1

signais Inactivation fonctionnelle

Absence de costimulation

Activated

Abbas, A.K. 2007 Basic immunology for clinicians

Figure 6: Mécanismes impliqués dans la tolérance périphérique.

mécanismes de sélection négative et induisent un autre syndrome auto-immun, l’APS-1 {autoimmune polyendocrine syndromeŸ\ Ces pathologies démontrent l’importance des mécanismes centraux de maintien de tolérance au « soi ».

Ces mécanismes centraux ne sont toutefois pas infaillibles. En effet, une petite proportion des lymphocytes autoréactifs échappe à la sélection négative et se retrouve en périphérie, où d’autres mécanismes préviennent l’apparition de maladies auto-immunes.

2.1.3 La tolérance périphérique

2.1.3.1 L’anergie

L’anergie est un état d’inactivation fonctionnelle du lymphocyte T qui empêche celui-ci de s’activer, de proliférer et de se différencier en cellules effectrices. Elle implique différents types de mécanismes tels que (figure 6) :

L’engagement du TCR en l’absence de signaux de costimulation^*.

L’engagement de récepteurs inhibiteurs, tels que le CTLA-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte-associated Antigen-4) ou le PD-1 {Programmed cell death-lŸ^’^°.

L’importance de ce mécanisme est illustré par le développement de syndromes auto-immuns chez les souris déficientes pour ces deux gènes^'"^^.

La reconnaissance de l’antigène en présence d’IL-lO”.

L’anergie est généralement un état réversible. En effet, l’addition d’IL-2 exogène à des cellules anergiques suffit souvent à lever l’anergie et à augmenter leur réponse antigènique^'*. La réversibilité de l’anergie dépend de la fonction d’une kinase appelée mTOR (mammalian target of rapamycin), l’induction et le maintien de l’anergie étant la plus efficace lorsque mTOR est inhibée, par exemple en présence de rapamycine^^’^^.

2.1.3.2 La délétion

En périphérie, les cellules T matures qui reconnaissent des antigènes du « soi » meurent par un mécanisme appelé AICD {activation induced cell death). L’engagement de récepteurs de mort cellulaire programmée, tels que Pas (CD95), en présence d’IL-2 induit, dans le lymphocyte, la production de protéines proapoptotiques. Chez l’homme, des mutations au niveau du gène Pas sont responsables d’un syndrome auto-immun lymphoprolifératif^^’^*.

n t r o d u c t i O n | 22

Figure 7: Phénotype des lymphocytes régulateurs naturels

Adénosine (A). Adénosine triphosphate (ATP). Cellule présentatrice d’antigène (APC).

Complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). Récepteur T (TCR). Tryptophane (TRP)

2.1.4 Les lymphocytes T régulateurs

Les Tregs sont activement impliqués dans le contrôle de diverses réponses immunitaires. Leur absence est responsable du développement de réponses non contrôlées face à des agents infectieux^^, de maladies auto-immunes^’, de rejet d’allogreffe'*” mais aussi de rejet de tumeurs*'.

Les Tregs naturels, générés dans le thymus, possèdent d’emblée des propriétés régulatrices et expriment de manière constitutive le facteur de transcription Foxp3 et la chaîne a du récepteur à l’interleukine (IL)-2, le CD25 (cf La tolérance centrale, p.20). Les Tregs induits sont, quant à eux, générés en périphérie à partir des lymphocytes CD4''’ naïfs. D’autres cellules régulatrices, que nous n’aborderons pas dans le cadre du présent travail, ont également été décrites dans les compartiments CD8”^, CD4"“®CD8"'® (doubles négatives), lymphocytes yô, NK et NKT.

2.1.4.1 Les lymphocytes T régulateurs naturels (nTregs) A. Historique

La notion de cellules suppressives ou régulatrices existe depuis plus de trente ans*^. En 1970, Gershon et al montrent pour la première fois que des lymphocytes T sont capables d’inhiber des réponses immunitaires*^. Par la suite, de nombreuses études ont été menées dans le but de caractériser et d’étudier le mode d’action de ces cellules suppressives, mais en vain.

L’enthousiasme des immunologistes pour les cellules suppressives a rapidement décliné, à tel point que devant tout phénomène immunologique inhibiteur, ils évitaient systématiquement le terme « cellules suppressives ». L’existence même de ces cellules était mise en doute, entre autres à cause de l’absence de marqueur permettant de les identifier”’*’. Parallèlement à ces études sur les cellules suppressives, d’autres chercheurs étudiaient les phénomènes d’auto-immunité ; pourquoi ceux-ci apparaissaient et comment étaient-ils inhibés. En 1969, Nishizuka et ses collaborateurs montrent qu’une thymectomie en période néonatale (entre 2 et 4 jours de vie) est responsable de la destruction des ovaires chez la souris. Ils concluent erronément qu’il doit y avoir un déficit d’une hormone importante pour les ovaires et sécrétée par le thymus**. En réalité, ces lésions ovariennes sont de nature auto-immune et elles sont accompagnées d’atteintes au niveau de multiples organes (thyroïdite, gastrite, etc.) comme le démontreront des études ultérieures**. Les résultats suggéraient donc qu’il devait y avoir deux types de lymphocytes T

€04* : d’une part, ceux responsables des stigmates d’auto-immunité et qui se développent avant 2 jours de vie, d’autre part, ceux qui devaient inhiber les précédents et qui se différencient dans le

Introduction | 23

IL-2Ra

♦

Nucléus DNA

Waldmann, TA. 2006 Nature Review Immunolog^^

Figure 8: Signalisation intracellulaire du récepteur à riL-2.

Le récepteur de haute affinité pour l’IL-2 (IL-2R) est composé de trois sous-unités; la

chaîne a (IL-2Ra ou CD25), la chaîne p (IL-2Rp ou CD122) et la chaîne commune aux

récepteurs des cytokines ( 7 c ou CD132). La liaison de l’IL-2 à la chaîne a provoque

l’association de cette dernière aux deux autres-sous unités pour former un hétérodimère

stable. Il s’ensuit une activation de kinases associées aux chaînes P et 7 c (JAK1 et JAK3

respectivement) qui mènent in fine à la translocation de STAT5 dans le noyau.

thymus après 2 jours de vie. De nombreux essais ont ensuite été réalisés pour séparer ces deux types de cellules en fonction de l’expression de molécules de surface. Ainsi, le CD5‘*^, le CD45RB“*^ et finalement, de manière plus efficace, le CD25''®, ont permis de faire la distinction entre les deux types cellulaires. Depuis, le phénotype des nTregs a été extensivement étudié (figure 7). Mais les marqueurs de surface actuellement connus, tels que le CD25, le CTLA-4 ou le GITR, sont également présents à la surface de lymphocytes T effecteurs nouvellement activés, ce qui rend l’isolement spécifique des Tregs difficile. Le facteur de transcription Foxp3 est un marqueur spécifique de ces cellules mais sa localisation intracellulaire ne permet pas leur isolement. Beaucoup d’efforts sont donc toujours consacrés à identifier de nouveaux marqueurs de surface capables de distinguer et d’isoler les Tregs des non-Tregs.

B, Phénotype

B. 1. LeCDZSetlerôIe de I’IL-2

La molécule CD25 est exprimée par 5-10% des lymphocytes T CD4^ d’une souris naïve, non manipulée. Cette molécule, à défaut d’être spécifique des nTregs, permet de faire la distinction opérationnelle entre nTregs et cellules non régulatrices. Par exemple, dans le modèle de thymectomie néonatale décrit ci-dessus, le transfert de cellules CD4'^CD25'^ prévient l’apparition du syndrome auto-immun chez ces souris''^. De même, l’utilisation in vivo d’anticorps anti-CD25, notamment dans nos expériences, permet la déplétion (clone PC61)^° ou l’inactivation fonctionnelle des nTregs (clone 7D4/'. En effet, le CD25 n’est pas seulement un marqueur des Tregs, il est aussi la chaîne a du récepteur de haute affinité pour l’IL-2, cytokine indispensable à l’homéostasie des nTregs. Le récepteur à l’IL-2 existe soit (figure 8)^^ :

- sous forme dimérique (association des sous-unités P (CD 122) et yc (CD 132)) présent à la surface des lymphocytes T naïfs ;

- sous forme trimérique (association des sous-unités a (CD25), P et yc) présent à la surface des lymphoeytes T activés et des nTregs où il constitue un récepteur de haute affinité pour l’IL-2.

La liaison de l’IL-2 sur son récepteur induit une cascade de signalisation qui, via le facteur de transcription STAT5, mène à la transcription de multiples gènes.

L’IL-2 est une cytokine dont les actions sont aussi diverses que complexes. In vitro, l’IL-2 est un puissant facteur de croissance et d’expansion des lymphocytes T effecteurs (ef. Activation des lymphocytes alloréactifs, p.l5). En outre, elle augmente la production par ces cellules d’autres

Introduction | 24

cytokines telles que l’IFN-y ou l’IL-4. In vitro, l’IL-2 semble donc promouvoir les réponses effectrices. Par contraste, in vivo, l’IL-2 joue un rôle prédominant dans le maintien de la tolérance au « soi ». En effet, la neutralisation de l’IL-2 circulante par l’administration d’anticorps anti-IL-2 réduit sélectivement le nombre de nTregs et déclenche un syndrome auto-immun chez des souris non-prédisposées^^. De même, les souris Il2ra^' (Cd25'^') et Il2rb'^' {Cdl22'^') possèdent très peu de Tregs et meurent d’un syndrome lymphoprolifératif et auto-immun agressif^'*'^^. Dans ces souris, l’IL-2 n’est pas requise pour induire l’expression de Foxp3 dans les thymocytes. En effet, ces souris possèdent, bien qu’en nombre réduit, des cellules FoxpS"^

démontrant donc que l’IL-2 et son récepteur ne sont pas responsables à eux seuls du développement des Tregs. Par contre, seule l’IL-2 augmente la quantité de Foxp3 par cellule et permet la survie et l’expansion des Tregs dans le thymus et en périphérie^''. Ce mécanisme semble être dépendant de l’activation de STAT5 qui se lie directement sur le promoteur du gène Foxp3^^. Il est important de noter que l’lL-2 utilisée par les nTregs provient majoritairement des lymphocytes T non-régulateurs, les Tregs ne produisant pas eux-mêmes d’IL-2^^.

B. 2. Foxp3

Récemment découvert, le facteur de transcription Foxp3, en plus d’être exprimé de manière spécifique par les Tregs, s’avère un facteur essentiel pour leur développement et leur fonction. En 2001, Brunkow et al montrent que la mutation du gène Foxp3 est responsable du syndrome inflammatoire auto-immun chez la souris Scurfy^°. Chez l’homme, des mutations du gène FOXP3 sont responsables d’un syndrome apparenté, appelé syndrome IPEX, caractérisé par une polyendocrinopathie (Thyroïdite, diabète de type I...), une atteinte inflammatoire du tube digestif ainsi qu’une allergie sévère, principalement chez des nouveau-nés de sexe masculin (syndrome lié au chromosome Mais il fallut encore attendre deux ans pour que le lien entre Foxp3 et Tregs soit démontré^^'^^. D’abord, chez la souris, le Foxp3 mRNA n’est exprimé que par les CD4'^CD25''’ et il n’est pas induit dans les cellules CD4''’CD25''^® activées. De plus, l’introduction du gène Foxp3 dans un lymphocyte naïf CD4'^CD25"'® lui confère un phénotype de Treg (suppression de la production d’IL-2, surexpression de CD25, CTLA-4 et GITR) et des propriétés régulatrices in vitro et in vivo qu’il ne possédait pas auparavant. Conjointement, ces données montrent que Foxp3 est un facteur de transcription clé pour le développement et la fonction des Tregs. A ce Jour, Foxp3 est le marqueur le plus fiable pour identifier les Tregs, mais sa

Introduction |25

localisation intranucléaire ne nous permet pas de l’utiliser pour leur isolement. Toutefois, chez l’homme, des études ont montré que les lymphocytes T naïfs activés expriment Foxp3 mais de manière transitoire et en moindre quantité que les Tregs**’*’. On ne sait pas encore exactement comment Foxp3 contrôle l’activité suppressive des Tregs. On sait qu’il active et supprime des centaines de gènes directement ou indirectement en formant des complexes avec d’autres facteurs de transcription tels que NFAT {Nuclear factor of activated T cellsŸ^’^^. Par ailleurs, la régulation de l’expression de Foxp3 n’est pas encore totalement comprise. Parmi les régulateurs positifs de l’expression de Foxp3, le TGF-P est un facteur important. En effet, un lymphocyte T naïf Foxp3"®® stimulé in vitro en présence de TGF-P exogène acquerra l’expression de Foxp3 et une activité régulatrice et ce, par une voie dépendante de l’IL-2™’^'. Au contraire, l’ajout d’IL-6 ou d’IL-21 en plus du TGF-P inhibera l’expression de Foxp3 et stimulera la différenciation de cellules productrices d’IL-17, les Thl7 (cf. L’IL-17, p.42)’^’’^. Donc, outre le rôle crucial de l’IL-2 dans l’homéostasie des Tregs, d’autres cytokines sont impliquées dans la régulation positive et négative des Tregs.

B. 3.

C.TLA-4 et le CD28

Le CTLA-4 et le CD28, membres de la famille des récepteurs B7, sont tous deux exprimés constitutivement à la surface des Tregs.

Le CTLA-4 Joue un rôle important dans la fonction suppressive des Tregs en activant son ligand (B7.1 ou B7.2, aussi appelés CD80 et CD86 respectivement), d’une part, à la surface du lymphocyte effecteur (suppression directe), d’autre part, à la surface de la DC (suppression indirecte) (cf. Mécanismes de suppression des Tregs, p.28).

Le CD28, outre son rôle dans le développement thymique des nTregs (cf La tolérance centrale, p.20), joue un rôle dans l’homéostasie des nTregs en périphérie. En effet, dans les souris Cd2S'', la réduction du nombre de thymocytes Foxp3^ s’observe également en périphérie. De même, le nombre de Tregs en périphérie diminue lors de l’injection d’anticorps anti-B7.1 et anti-B7.2. Le CD28 jouant également un rôle dans l’activation de cellules non-régulatrices (signal 2, figure 2) et dans l’induction de production d’IL-2 par ces cellules, il est difficile de déterminer si l’effet du CD28 sur les nTregs résulte d’une action directe, en promouvant la prolifération et la survie des Tregs en périphérie ou d’une action indirecte, en régulant la production d’IL-2 par les cellules non-régulatrices’'*'^^. Cette action indirecte du CD28 a été mise en évidence par Tang et al. qui

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CD25 positive

Top 5% Top 2%

Liu VJ. 2006 JEM

Figure 9: FOXP3 est exprimé par un grand nombre de lymphocytes CD4^ humains indépendamment du marqueur CD25.

Des PBMC humaines ont été marquées avec une combinaison d’anticorps anti-CD4, anti-

CD25 et anti-FOXP3. Les nombres dans les histogrammes représentent le pourcentage de

cellules FOXP3^

montrent que des Tregs WT transférés dans des hôtes Cd28'^' n’y survivent pas non plus’^. Par ailleurs, la fonction des Tregs de souris Cd28'^' n’est pas altérée^^.

B. 4. le GITR

Les nTregs expriment également de manière constitutive de grandes quantités de GITR (glucocorticoid-inducible tumor necrosis factor receptor) alors que les autres lymphocytes l’expriment faiblement et l’induisent après activation. Les souris Gitr'' ne présentent pas de stigmates d’auto-immunité. Par contre, dans des souris de souche sauvage, l’activation du GITR par un anticorps agoniste provoque l’apparition de lésions de gastrite auto-immune’*.

L’activation du GITR, plutôt que d’agir directement en inactivant les Tregs, amplifie la fonction des lymphocytes effecteurs (Teffs) et leur confère une résistance à la suppression des Tregs (cf Mécanismes d’échappement à la suppression, p.34)’®’*°. Par ailleurs, l’engagement du GITR à la surface des Tregs en présence d’IL-2 les fait proliférer et augmente leur activité régulatrice*'.

Donc, le GITR semble avoir la même fonction chez les Tregs et les non-Tregs, à savoir la costimulation de leurs fonctions respectives. Cette observation vaut également chez l’homme*’.

B. 5. Les autres molécules

Chez l’homme, quasiment toutes les cellules CD4^ exprimant de haut taux de CD25 (CD25'”®'’) sont FoxpS”^. Par ailleurs, contrairement à ce que l’on observe chez la souris, nombreux sont les CD4^ qui, indépendamment de leur degré d’expression du CD25, expriment également Foxp3^

(figure 9). De nouveaux marqueurs sont donc nécessaires pour sélectionner les cellules Foxp3^

au sein des populations exprimant des taux intermédiaires de CD25 (CD25'"‘). Un marqueur prometteur pourrait être le récepteur de l’IL-7 (CD 127). Sur les cellules effectrices nouvellement activées, le CD127 est régulé négativement (CD127'°) de manière transitoire alors qu’il l’est de manière prolongée sur les cellules régulatrice Foxp3^. Le CD 127 associé au CD25 permettrait la distinction entre des cellules T mémoires CD25'"‘CD127'’‘®'’ et des cellules régulatrices Foxp3'^

qui sont CD25''"CD127'“ et permettrait donc la sélection relativement spécifique d’un plus grand nombre de cellules Foxp3"^ **.

La coexpression des molécules CD39 et CD73, deux enzymes essentielles à la génération d’adénosine, serait également spécifique des Tregs. Ces molécules possèdent par ailleurs un rôle fonctionnel. En effet, l’adénosine produite par les Tregs agirait ensuite sur son récepteur A2A

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présent à la surface des cellules T activées et supprimerait leur activité. De plus, les Tregs provenant de souris dont le gène Cd39 est muté présentent une altération de leur fonction suppressive*'*.

C. Mécanismes de suppression des Tregs

C. 1. La suppression in vitro

En 1998, un système in vitro, largement utilisé depuis lors, a été établi pour analyser les différents modes d’action possibles des Tregs*^’*®. Dans ce système, des cellules effectrices (CD4'^CD25"®®, par exemple) sont stimulées de manière polyclonale (anti-CD3 mAb, par exemple) ou antigène spécifique (stimulation allogénique, par exemple) afin de déterminer l’effet de l’ajout de nombres croissants de cellules CD4'^CD25^ sur différents paramètres, tels que la prolifération ou la production de cytokines.

Aujourd’hui, grâce à ce simple système, on sait que les Tregs ne sont pas des cellules anergiques, que la suppression de la prolifération in vitro implique un contact direct entre Tregs et cellules effectrices et enfin, que cette suppression de prolifération résulte en partie d’une inhibition de la production d’IL-2. Outre la prolifération, les Tregs suppriment également la production de cytokines de type Thl (IFN-y). Récemment, certains travaux - notamment le nôtre - montrent qu’ils inhibent aussi les cytokines de type Th2 (IL-4, IL-5, IL-13)*^'*^, lesquelles ont longtemps été considérées comme elles-mêmes régulatrices (régulatrices des réponses Thl en réalité)’®’®’.

Les Tregs suppriment la production de cytokines à différents niveaux. D’une part, ils inhibent la différenciation des lymphocytes T naïfs en cellules effectrices. D’autre part, les Tregs agissent également sur une population effectrice déjà différenciée et, dans ce cas, ils empêchent la sécrétion de cytokines en interférant avec la qualité du signal TCR reçu par les Teffs. Par ailleurs, la suppression des Teffs par les Tregs semble être un phénomène réversible. En effet, des lymphocytes précédemment supprimés par les Tregs prolifèrent normalement et produisent de riL-2 lorsqu’ils sont restimulés en l’ahsence de Tregs. Il en va de même pour la production d’IFN-fl

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