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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Maurer, P. (2004). Etude de profil d'expression et caractérisation moléculaire du facteur de transcription Fev, un répresseur transcriptionnel de la Famille Ets. (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Sciences biomédicales, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/211191/4/2b5efcc7-3b61-4d80-991e-730ff36d0862.txt
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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté de Médecine
Laboratoire de Virologie Moléculaire
..h?- ~ Erasme
’.neque de Médecine - CP 607 '•Jte de Lennick, 808 (Bât.E)
B- 1070 Bruxelles
^él.; 02/555.61.70
Etude du profil d’expression et caractérisation moléculaire du facteur de transcription Fev, un
répresseur transcriptionnel de la Famille Ëts
CIBLE
Promoteur de thèse : Professeur Yvan de Launoit
Philippe MAURER
Thèse de doctorat présentée en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences Biomédicales
Mars 2004
(ii O
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté de Médecine
Laboratoire de Virologie Moléculaire
Etude du profil d’expression et caractérisation moléculaire du facteur de transcription Fev, un
répresseur transcriptionnel de la Famille Ets
Promoteur de thèse : Professeur Yvan de Launoit
Philippe MAURER
Thèse de doctorat présentée en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences Biomédicales
Mars 2004
yiu terme de ce travail je souhaite remercier Ce ToncCs üCationaC de Ca
^cherche Scientifique, et en particuder Copération TéCévie, d’avoir financé ma formation durant quatre années.
Mes remerciements s’adressent également à CjAction de Ca ^cherche Concertée
de Ca Communauté française qui m ’a permis d’initier ma thèse de doctorat.
^merciements
Jiu terme de cette thèse, je voudrais remercier chaleureusement Yvan de Launoit. Cher Yvan, à Cissue de mon mémoire, tu m'as tendu Ca main, ouvert des portes sur Cavenir. (Depuis, cinq années se sont écoulées, une &)çtraordinaire aventure ! Malgré des moments parfois difficiles, j’ai apprécié nos nomhreuses discussions, nos confrontations, nos échanges scientifiques. <De tout coeur, je te remercie de m'avoir accordé ta confiance et de m’avoir encadré si gentiment tout au long de mon cheminement. Cher iCvan, trouve à travers ce manuscrit, Ceijçpression de ma profonde reconnaissance.
(Et pour tant d’autres choses encore, cher 'Yvan, mide mercis...
Je voudrais également remercier Yolanda Mazza. Chère 'Yolanda, nous n’avons pas, comme à une époque, uniquement partagé notre bureau. INbus avons également partagé des moments de nos vies. (Parfois heurewç, parfois moins heurewç. Je t’ai souvent entendu prononcer le prénom de Célestin, et je t’en remercie vivement. Jiu-delà de ces moments privilégiés, ta très grande gentillesse et ton immense dïsponihilité ont permis d’aplanir Beaucoup de différends au sein du laboratoire. Tu as toujours été présente pour m’aider dans l’une ou Cautre démarche, demande de financement ou commande chez le fournisseur. Ta Bonne humeur et ton tempérament du Sud, très communicatifs, ont aussi égayé nos activités oçtra laBo. (De tout coeur, je te remercie de ton amitié sincère et des nombreuses Bouffées (fojygène que tu m’as insufflées,
« sacré petit Bout de femme » l
Mes remerciements s’adressent ensuite à :
(Rflchel Déplus. Chère (Rgchel à une époque, nous étions les dew^ seuls provinciaw^ du laboratoire (de notre (Brabant Hlallbn profond, près de la frontière française comme disent tous ces BnvçfQbis !} cela nous a peut-être rapprochés davantage ? Ta gentillesse et ton immense simplicité m’ont tout de suite séduit et étonné. Tu as été présente ces derniers mois et t’es inquiétée du sort de ma petite famille. Je t’en remercie sincèrement ainsi que pour tous les sacrés Bons moments, délires musicawç, Bowling, Barbecues et soirées diverses, que nous avons passés ensemble.
Céline (Didelot-Mirjolet. Chère Céline, après m’avoir fait redécouvrir les "Kjchgrs® (et oui, elles existent encore) et la quiche lorraine, découvrir le punch lorrain, nous avons passé dagréables moments au laboratoire, en Lorraine ou encore en nos maisons. Ton indéniable amitié, ton soutien et ton écoute m’ont profondément touché. Jlous ne partageons certainement pas les mêmes convictions, mais en ce qui concerne nos états d’âme et lès potins du labo..., nous étions sur la même longueur d’onde ! (« Tu vas me faire une de ces réputations... »). Chère Célne, un énorme merci, et surtout, bonne route. J’ai promis à Célestin qu’un
«petit Mirjolet » allait arriver (de (Dijon ...)
Marie-Louise Draps. Chère Marylou, je souhaite te remercier chaleureusement pour ton énorme dévouement ainsi que pour la précieuse aide logistique et le confort quotidien que tu m’as apportés au sein du laboratoire.
(Emmanuelle l^iré. Chère Emmanuelle, ton calme apparent et ta très grande sagesse cacfUnt une
jeune femme eoçtraordmaire. J’ai apprécié nos nombretoiSMSfurtifs envoyés le soir et le weeh^end, tes coups
de gueule qui ne durent pas plus de dewç minutes et ton immense faculté dadaptation à nos délires
primaires. J’ai été très heurewç de pouvoir réaliser un bout de chemin à tes côtés.
‘Fûxvienne Sandras. Cftère TCavienne, je suis réellement désoCé de t’avoir autant ckarriée (notamment sur tes origines atHoises} mais ce n'était pas Sien méchant. T
mfais égaCment partie des quelques personnes qui sans cesse nous ont témoigné leur sympathie et je t’en remercie de tout cœur. Je te remercie également pour Ces nombreuses spécialités (enfin, celles de tes parents) que tu nous as fait connaître dès que la moindre occasion se présentait.
INïcoCe (Douât et <Perrine C^idet. Chère INïcoCe et chère (Perrine, vous m’avez fait partager (souvent autour d’un café) vos eoçpériences personnelles de laboratoire et de vie parfois avec beaucoup de recul et de discernement. Vn grand merci de m'avoirfait un peu « grandir »....
iNathalie Codens. Chère iNàthalie, je souhaite apporter une petite rectification à ce que fai pu lire dans ta thèse. Si tu avais trouvé en moi un lien idéal pour les ragots entre Lide et (Brw^edes, Cinverse est aussi vrai Qui d’autre mieu^que toi à Lide pourrait remplir aussi bien cette mission avec Cachamement et la mauvaise foi qui te caractérisent? Je te remercie des nombrewç^ coups de fil ou courriels que nous avons échangés enfin de journée et qui font parfois beaucoup de bien !
Sébastien IMauén. Cher Sébastien, je souhaite te remercier pour les bons moments que mus avons vécus ensemble au labo, souvent le weeh^end, et pour les mmbreuses heures que tu m’as consacrées pour la réalisation de mes posters, figures darticles ou encore mises en page de projets. ‘Tu sais bien, moi et l’informatique, ça fait dewç, ou plutôt cela faisait dewç. Qai noteras tout de même que Cécolagefut rfficace puisque pour ma thèse je me suis tout de même pas trop maldébrouidé seul Mide mercis pour ta gentillesse,
ton dévouement et ton immense disponibilité. (Bon vent pour h suite I
Jï Loïc (Blanchon et à David (Bernard. Depuis quelques mois vous êtes venus renforcer la gent masculine du laboratoire. (Même si mus n’avons pas eu Coccasion de travaider ensemble, mus mus sommes côtoyés à la sade café, dans les couloirs ou awç « cendriers » (selon) (Pour les agréables moments partagés, pour ms discussions de mecs ou pour ms sympathiques pauses de midi, merci Vn merci plus particulier à David: tu m’as fait partager ton eapérience, tu as pris le temps de regarder mes résultats et m’as suggéré de muvedes manipulations, un émrme merci
Je remercie également Jean-Luc (Baert et (Didier (Monté du laboratoire de Lide. Vous m’avez aidé ponctuellement par la réalisation de lune ou Cautre manipuùition complémentaire, dans Cinterprétation de mes résultats (un œil e^érieur est souvent le bienvenu) ou encore par la proposition de muvedes manipulations (attention awç contrôles) Votre recul et les interactions que j’ai eues avec vous m’ont mtamment permis défaire évoluer ce sujet, je vous en remercie. Je voudrais également profiter de Coccasion pour remercier les autres étudiants qui ont travaillé de près ou de loin au sujet lev et qui ont, de quelque manière que ce soit, pu contribuer à Cavancement du projet. Je pense mtamment à Laurent Coutte, (Nathalie Codens et (France VSas.
(Mes plus vifs remerciements s’adressent à présent au Docteur David Waltregny du Laboratoire de
(Rfcherche sur les (Métastases de CVLg ainsi qu’au (Professeur IsabeOé Salmon du Laboratoire djlmtomie
Fathologique de iJlôpitalFrasme, ms «fournisseurs officiels» d échantillons biologiques. Je remercie plus
partiadièrement Jinne-Lyse et Fdvienne qui ont servi d’interface entre la Faculté et CHôpital Votre
accueilchalêurewç et votre très grarule disponibilité m’ont permis d’obtenir mes prélèvements dans de brefs
délais et de réaliser de mmbreuses eoçpériemes. (Merci d’avoir supporté mes empressements et d’avoir compris
mes demandes.
Je voudrais remercier chakureusement Ce (Professeur Serge Sckiffmann et JiCSan cfe Xfrcdove (fpjçaerde. Votre rencontre m’a permis cCaSorder Ce voCet neurotransmission de ce travaiC Merci de votre initiation, de votre accueiCet de votre précieuse coCCaBoration.
A‘RpdL
P>e tout cœur, je souBaite remercier mon grand frère Thierry et sa charmante épouse SyCvie. Vous m’avez ojfert Casile Ce temps de Ca rédiction de ce manuscrit, loin du Brouhaha du CaBoratoire et des pleurs de Ca maison. Je garderai un souvenir ému de cette période si particulière qu’est une fin de thèse, un isolement forcé passé au sein de votre chaCeureujçfoyer.
A mon fils, CéCestiru Mon petit Bonhomme, ta venue prématurée a Bouleversé nos oqstences.
P)epuis plusieurs mois, tu nous donnes une magnifique leçon de vie : celle de se Battre et cCaHer de lavant Les moments difficiles que nous avons passés à tes côtés m’ont fait prendre du recul sur la vie en général et la science en particulier. Mon petit lustucru, merci pour tout ce que tu m’apportes.
‘Enfin, je voudrais remercier mon épouse, Marie-Chw. Marie, tu m’as épaulé tout au long de mon parcours. ‘Ton sourire quotidien m’a aidé à surmonter certaines journées plus difficiles. Pour ne pas me freiner, tu as accepté mes sautes d’humeur, mes retours tardifs à la maison, nos weekends sacrifiés et nos vacances écourtées. Marie, ce manuscrit je te le dédie. Il est également C occasion pour moi de te remercier pour tout ce que tu m’apportes, d’être à mes côtés et de te réitérer mon immense tendresse.
Très sincèrement,
Philippe
TaSCe des Matières
Introduction...1
A. Régulation de la transcription... ...1
A. 1. Les acteurs de la régulation transcriptionnelle...1
A.2. La chromatine...1
A.2.1. Modifications des nucléosomes... 3
A.2.1.a) Modifications covalentes des histones... 3
L’acétylation des histones... 3
La désacétylation des histones...4
La phosphorylation des histones... 7
La méthylation des histones... 8
L’ubiquitinylation des histones... 8
A.2.1 .b) Modifications non covalentes des histones...10
A. 2.2. Modification de l'ADN : la méthylation...11
A.3. La machinerie basale de transcription... 12
A.4. Les facteurs régulateurs...12
A.4.1. Principaux domaines fonctionnels...13
A.4.1 .a) Les domaines de liaison à l’ADN... 13
A.4.1 .b) Les domaines régulateurs de la transcription... 14
A. 4.2. Modulation de l'activité des facteurs de transcription ...14
A.4.2.a) Les partenaires protéiques...15
A.4.2.b) Les modifications post-traductionnelles...15
A.4.2.C) Les régulations de la fixation à l’ADN... 17
A. 5. Les cofacteurs transcriptionnels ... 18
A. 5.1. Les coactivateurs ...18
A. 5.2. Les corépresseurs ...19
B. Les facteurs de transcription de la Famille Ets...22
B.l. Le domaine de liaison à r ADN ... 23
B.2. Les séquences cibles de ce domaine...25
B.3. Les facteurs Ets et la régulation transcriptionnelle...26
B. 3.1. Les domaines fonctionnels des facteurs Ets...26
B. 3.2. Les partenaires protéiques des facteurs Ets... 27
B. 4. Les rôles biologiques des facteurs Ets... 30
C. La neurotransmission dans le cerveau... 32
C.l. Généralité...32
C.2. Mécanisme ...32
C.3. Le système de neurotransmission de la sérotonine... 33
C. 4. Biosynthèse de la sérotonine (SNC)... 34
D. Fev un facteur de transcription de la Famille Ets...38
D.l. Les tumeurs de Ewing... 38
D. 2. Le gène fev ...40
D.2.1. Isolement... 40
D. 2.2. Organisation et structure de fev...40
E. Les homologues de Fev chez la souris et le rat: les protéines mPet-1 et Pet-1... 42
E.l. Découverte de Pet-1 ... 42
E.2. Structure et organisation génomique de Pet-1... 43
E.3. Expression de Pet-1 chez le rat...43
E.4. Expression de mPet-1 chez la souris...45
E.5. Fonctioimalité de Pet-1... 46
E.6. Les souris mpet-1 -/- ... 46
E.7. Etude comportementale des souris mpet-1 -/- ...48
E.8. mPet-1 est-il le maillon d’une chaîne ?...49
E.9. Modèle mécanistique...51
But du travail... 53
‘ïaSCe des ^Matières
Résultats 54
A. Expression de Fev... 54
A. 1. Expression de l’ARNin de Fev dans des lignées cellulaires humaines ... 54
A.2. Expression de l’ARNm de Fev dans le tissu prostatique humain... 58
A.3. Expression de l’ARNm de Fev dans le cerveau humain ... 59
A. 4, Mise en évidence de la protéine Fev ...61
B. Caractérisation fonctionnelle de Fev... 62
B. 1. La localisation nucléaire de la protéine Fev ...62
B.2. Fixation de la protéine Fev sur des éléments de réponse aux facteurs Ets... 62
B.3, Fev réprime spécifiquement la transcription ... 63
B.4. Identification des domaines de Fev responsables de la répression transcriptionnelle.. .67
B.4.1. Dans des systèmes Ets dépendants ... 67
B. 4.2. Dans des systèmes Ets indépendants ... 68
B.5. Effet de la surexpression de Fev sur le phénotype cellulaire... 70
Discussion et Perspectives ... 73
1) Etude du profil d’expression de l’ARNm de Fev... 73
1.1. ) Dans le cerveau humain... 73
1.2. ) Dans des lignées cellulaires humaines... 74
1.3. ) Dans la prostate humaine... 75
1.4. ) Mise en évidence de la protéine Fev...79
2) Mécanisme moléculaire médié par Fev... 81
3) Gènes cibles de Fev... 83
3.1. ) Pet-l/Fev, un élément clé dans la régulation de la voie de la sérotonine ... 83
3.2. ) Fev et Pet-1 : répresseurs et/ou activateurs ? 86 3.3. ) Identification des gènes cibles de Fev... 88
Bibliographie ... 89
JLSréviations et conventions
5-HT : 5-hydroxytryptamine (sérotonine) 5-HTlA R : récepteur de type IA à la 5-HT 5-HTlB R :_récepteur de type IB à la 5-HT 5’-UTR : 5’ non traduit / 5’ untranslated a : anti-
aa : acide aminé A : adhérente A : adénine
AADC : L-amino acide deçarboxylase ADC : ^énoçarcinome
ADN : acide désoxyribonucléique ADNc : ADN complémentaire ARN : acide ribonucléique ARNm : ARN messager Asp : aspartate
ATG : codon méthionine initiateur ATP : adénosine triphosphate AUG : codon méthionine initiateur BM : bench mark
c : çaenorhabitis elegans C : çarboxy
CBP : CREE bindingÿrotein CgA : çhromagrinine A
CREB : çAMP response élément binding Cy3 : çyanine 3
Cy5 : çyanine 5 d : drosophile
DBD ; DNA binding domain (domaine ETS) Dnmt : DNA methyl transferase
E : embryonnaire EBS : Ets binding site
ECL : enhanced çhemoluminescence G418 : néomycine (antibiotique)
GC : guanine/cytidine ; guanosine/cytosine GTE : general transcription factor
GST : glutathion S-transférase h : humain
H : histone H : hélice
HAT(s) : histone(s) acétyle(s) transférase(s) HBP ; hyperplasie bénigne de la prostate HD AC : histone désaçétylase
His : histidine
HMT (s) ; histone(s) méthyle(s) transférase(s) HRP : horse radish peroxydase"
id.s.: identité de séquence
IL : interleukine
IRES : internai ribosome entry side Kb : kilobases
kDa : kiloDalton KO : knock out m : murin
Maoa : mono^ine oxydase a Maob : monoamine oxydase b
MAPK : mitogen gctivatedÿrotein kinase MBD : methyî CpG binding domain MMP : métalloprotéase de la matrice N : amino
NE(s) : neuroendocrine(s) Néo : néomycine
NES : nuclear export sequence
N-CoR : nuclear receptor corepressor NSE ; neurone ^ecifique enolase nm : nanomètre
O : oursin PO : post birth P : poulet
pb : paire de bases
PCR : polymerase çhain reaction
PIC : pre-initiation complexe / complexe de pré-initiation PKA : protéine kinase A
PM : poids moléculaire
PSA : prostatic ^ecific antigen RT-PCR : rétro-transcription-PCR RMN : résonance magnétique nucléaire s : souris
S : suspension
SERT/5-HTT : transporteur de la sérotonine SN : système nerveux
SNC : système nerveux central
SMRT : silencing mediator for retinoid and thyroid receptors SRE : element réponse sérum / élément de réponse au sérum SRF : element factor sérum / facteur de réponse au sérum SSRIs : sérotonine spécifie reuptake inhibitors
T : thymine ou thymidine
TAF(s): facteur(s) associé(s) à la TBP Tet : tétracycline
TBP : TATA bindingprotein TK ; thymidine kinase
TPH2 ; tryptophane hydroxylase de type 2 TRP : ttyptophane
TSA : trichostatine A
VMAT2 : transporteur vésiculaire à mono^ine de type 2
X
: xénope
IntrocCuction
A. Régulation de la transcription
A.l. Les acteurs de la régulation transcriptionnelle
La transcription sélective d’un gène particulier ou d’un groupe de gènes à un moment précis du développement ou dans un type cellulaire donné est régulée de manière fine de sorte que seule l’information génétique nécessaire à la cellule soit transcrite. La première barrière transcriptionnelle dépend directement de l’organisation du génome dans la cellule. En effet, l’ADN adopte au sein du noyau une structure condensée appelée chromatine. Ce compactage est généralement associé à une inhibition de la transcription des gènes puisqu’il masque les séquences régulatrices de l’expression des gènes.
La région régulatrice de la transcription est subdivisée en un promoteur minimal juste en amont du site d’initiation de la transcription, comportant des éléments communs à la majorité des gènes (promoteur core), une région proximale et une région distale. Cette dernière peut se situer en amont ou en aval du promoteur minimal. Le sens d’orientation de cette région n’est généralement pas important pour son activité stimulatrice (enhancer) ou inhibitrice (silencer) de la transcription. Les séquences régulatrices sont reconnues par deux familles de protéines. Les facteurs dits « généraux » ou GTF {general transcription factor), qui, associés à l’ARN polymérase de type II, constituent la machinerie basale de la transcription. Ces facteurs se lient sur le promoteur core. Des facteurs dits « régulateurs » constituent la deuxième famille de facteurs de transcription. En reconnaissant des séquences incluses dans les deux autres régions du promoteur, ils permettent une modulation fine et précise de l’expression spatio-temporelle des gènes (Pour revue voir, Lee and Young, 2000);
(Callens, 2003).
A.2. La chromatine
Au sein de la chromatine, l’ADN est associé à des protéines histones (H) qui
ordoiment et empaquettent l’ADN en de petites unités structurales compactes appelées
nucléosomes. Le nucléosome est un complexe consistant à 1,75 tour de la super hélice
\
^
146 paires de bases d’ADN
par octamère d’histones
50 paires de bases d’ADN
Figure 1 ; Représentation schématique de l’ADN organisé en nucléosomes.
Chaque nucléosome est constitué de 146 paires de bases d’ADN enroulées autour de huit
moléeules d’histones: deux molécules d’histone H2A en rouge, deux molécules d’histone H2B en
bleu, deux molécules d’histone H3 en vert et deux molécules d’histone H4 en jaune. Les
nucléosomes sont séparés entre eux par environ 50 paires de bases d’ADN sur lesquelles est fixée
une molécule d’histone H1 (en violet).
d’ADN enroulée autour d’un core d’octamère d’histones comprenant deux sous-unités de chaque histone H2A, H2B, H3 et H4 (Figure 1). L’espacement des nucléosomes le long de l’ADN définit une unité répétitive d’environ 200 paires de bases, dont 146 (Luger et al., 1997) sont étroitement emoulées autour d’un noyau d’histones, le reste servant de liens entre les nucléosomes. L’histone H1 n’appartient pas au cylindre du nucléosome mais elle est fixée à l’ADN séparant deux cylindres. Les queues amino-terminales (chargées positivement) des histones H3 et H4 « sortent » du nucléosome et interagissent (liens électrostatiques) avec les groupements phosphates de l’ADN chargés négativement (Figure 2) (Fischle et al., 2001).
Les sites de reconnaissance des facteurs généraux et régulateurs de la transcription peuvent être masqués au sein de cette structure nucléosomale compactée; constituant un mécanisme de régulation négative de l’expression des gènes. Dans ces conditions, pour initier la transcription d’un gène, 1a chromatine doit être remodelée en une structure moins compacte afin de permettre aux facteurs de transcription de prendre place sur l’ADN et ainsi moduler l’expression des gènes. Cette réorganisation [packaging) de l’ADN en nucléosomes représente donc un obstacle physique majeur dans l’accessibilité à l’ADN (Petrie et al., 2003).
Plusieurs enzymes modifiant les nucléosomes ont été décrites pour jouer un rôle dans la structure de la chromatine (Lee and Young, 2000; Narlikar et al., 2002).
1) Des enzymes qui agissent sur les histones en modifiant leur charge et ainsi leur affinité pour l’ADN. Il s’agit de modifications covalentes des histones.
2) Des enzymes qui, par un processus dépendant de l’ATP, vont modifier la conformation du nucléosome provoquant un déplacement de celui-ci le long de l’ADN. Ce phénomène mécanique est aussi appelé « modification non covalente des histones ».
3) Des enzymes qui méthylent l’ADN au sein du nucléosome jouent également un rôle dans la structure de la chromatine.
Afin de faciliter la compréhension de l’exposé, nous présenterons séparément ces différentes modifications. Ceci dit, il est important de mentionner que de plus en plus d’auteurs s’accordent à dire que celles-ci sont intimement liées entre elles et, qu’m vivo, elles agissent de concert ou en cascade rendant l’étude de leur régulation beaucoup plus complexe.
Quand cela sera possible, nous tenterons de faire apparaître les liens qui les unissent. De plus,
nous illustrerons l’implication de ces modifications dans les voies de régulation de la
Figure 2 : Chromatine et nucléosomes
Organisation de l’ADN dans l’espace. Le nucléosome, unité fondamentale de cette organisation, est composé de
l’enroulement de la super hélice d’ADN autour des protéines histones (H). Les extensions des histones sortent du
plan contenant les nucléotides (représentés en bleu foncé et bleu clair). D’après (Wolffe et al, 1999).
transcription orchestrées par différents facteurs de la famille Ets. Cette famille de facteurs de transcription sur laquelle porte ce travail sera présentée dans le chapitre B.
A.2.1. Modifications des nucléosomes
Les modifications des nucléosomes regroupent à la fois les modifications covalentes des extrémités N-terminales des histones et des modifications non covalentes nécessitant l’hydrolyse de l’ATP (Fischle et al., 2001).
A.2.1.a) Modifications covalentes des histones
Un événement clé dans la régulation des gènes eucaryotes est les modifications post- traductionnelles des histones qui convertit certaines régions des chromosomes en régions transcriptionnellement actives ou en chromatine inactive (Zhou et al., 2001). Ces modifications peuvent s’opérer localement, c’est-à-dire à proximité du site d’initiation de la transcription (Fischle et al., 2001), ou globalement (Kao et al., 2002).
Les extrémités amino-terminales des histones contiennent des acides aminés (aa) spécifiques qui sont le substrat cible d’une variété d’enzymes impliquées dans l’acétylation, la méthylation, la phosphorylation, l’ubiquitinylation et la poly-ADP ribosylation (Kao et al., 2002; Petrie et al., 2003; Lacoste et al., 2003). De telles modifications, altèrent la charge électrique nette de la protéine. Chacune de ces modifications peut être associée à une activation ou à une inhibition de la transcription des gènes.
L’acétylation des histones
L’acétylation des histones est le transfert réversible d’un groupement acétyle (de
l’acétyle CoA = donneur) (Gao et al., 2002) sur des résidus lysines des queues N-terminales
des histones. La neutralisation des charges positives des groupements NH3 + (en position s)
des résidus lysines par l’acétylation diminue l’affinité des histones pour l’ADN (Wade et al.,
1997; Petrie et al., 2003). Cette neutralisation ayant pour conséquence une perturbation des
contacts histones-ADN à l’intérieur du nucléosome et un relâchement de la structure de la
chromatine. Cette nouvelle conformation de l’ADN, permet un accès plus aisé aux facteurs de transcription spécifiques (Gregory et al., 2001).
Les protéines ayant une activité histone acétyle transférase (HATs) sont des protéines à localisation nucléaire. Chez les Mammifères, 12 HATs ont été caractérisées (Roth et al., 2001), dont les protéines CBP/p300, TAFn230/250, pCAF, et SRCl (Mizzen et al., 1996;
Ogryzko et al., 1996; Spencer et al., 1997; Yang et al., 1997; Hu et al., 2000). Toutes ces protéines sont décrites comme des coactivateurs transcriptionnels. Ces résultats sont en faveur d’un lien fonctionnel fort entre un relâchement de la chromatine par acétylation des histones et l’initiation transcriptionnelle des gènes. De nombreux auteurs parlent d’ailleurs d’un lien entre: acétylation des résidus lysines, dérépression, chromatine ouverte et chromatine « transcriptionnellement active » (Loidl, 1994; Turner and O'Neill, 1995; Kao et a/., 2002).
Les HATs agissent rarement seules car elles se trouvent souvent intégrées au sein de complexes multiprotéiques où elles constituent une ou plusieurs sous-unités du complexe.
Dès lors, les HATs agissent comme des coactivateurs transcriptionnels (Guenther et al., 2001). Néanmoins, certains coactivateurs au sens strict ont également souvent des propriétés
« HATs » intrinsèques (Huang et al., 2000). Les HATs sont recrutées dans de tels complexes pour activer les gènes cibles à travers des protéines de liaison à T ADN (séquence spécifique) utilisées comme pont ou adaptateur.
Si Tacétylation de la chromatine via le recrutement des HATs a pour but d’initier la transcription d’un gène, le mécanisme inverse ayant pour but de ramener la chromatine dans une conformation compacte, peu accessible et donc vers un état de « répression » existe. En effet, parallèlement aux HATs, les protéines possédîuit une activité désacétylase (Kouzarides, 1999), les histones désaçétylases (HDACs), désacétylent les résidus lysines des queues amino-terminales des histones. On dit alors que la désacétylation des histones produit une région transcriptionnellement silencieuse (Kao et al., 2002). Comme pour les HATs, les HDACs se trouvent souvent au sein de complexes multiprotéiques où, contrairement aux HATs, leur activité est corrélée à une répression transcriptionnelle (Ashraf and Ip, 1998).
Introduction
4
La désacétylation des histones
Onze « HDACs principales » différentes présentant toutes une identité de séquence à travers leur(s) domaine(s) catalytique(s) « désacétylase » ont été caractérisées chez les Mammifères (Petrie et al., 2003). Le nombre de HDACs est en réalité beaucoup plus élevé car la majorité de ces « HDACs principales » existent sous plusieurs isoformes résultant d’un épissage alternatif
Ces enzymes peuvent être divisées en trois classes (Kao et al., 2002; Thiagalingam et al., 2003) et cela sur base de leur taille, de leur domaine catalytique, de leur localisation subcellulaire et enfin de leur mode d’action.
Les HDACs de Classe I: Ces protéines de 40-55 kDa, à localisation nucléaire (Thiagalingam et al., 2003), ont un profil d’expression plutôt ubiquiste (sauf pour HD AC 11) (Gao et al., 2002; Kao et al., 2002). 11 s’agit des HDACs 1, 2, 3, 8, 11 et RPD3. Elles sont compactes et composées principalement du domaine catalytique (Zhou et al., 2001).
Les HDACs de Classe II: Ces protéines de 100 à 130 kDa présentent un profil d’expression
« tissu spécifique ». Les HDACs 4, 5 et 7 sont exprimées au niveau du cœur, des poumons et des muscles squelettiques (Kao et al., 2002). Les HDACs 4, 5 et 7 possèdent un domaine catalytique fortement conservé en position carboxy-terminale et constituent à elles trois, une sous famille (Kao et al., 2002). Les HDACs 4, 5, 6, 7, 9 et HDAl possèdent d’une part, un domaine catalytique HD AC fortement conservé en position carboxy-terminale (Zhou et al., 2001; Petrie et al., 2003) et d’autre part, un long domaine non catalytique en position N terminale (Zhou et al., 2001). HDAC6 fait exception à ces observations puisqu’elle possède un deuxième domaine catalytique en position N terminale (Gao et al., 2002; Kao et al., 2002).
En revanche, HD AC 10 est exprimée de manière ubiquiste avec une surexpression notable
dans le foie, la rate et les reins et son domaine amino-terminal seul peut réprimer la
transcription. 11 a été suggéré que ces HDACs sont fonctionnelles dans le noyau et que leur
exportation du noyau est un simple chemin d’inactivation mais néanmoins, un rôle
fonctionnel des HDACs dans le cytoplasme ne peut pas être exclu (Fischle et al., 2001 ; Kao et
al., 2002; Thiagalingam et al., 2003). La séquestration cytoplasmique des HDACs de classe
II Joue un rôle important dans la régulation de l’activité enzymatique associée aux cofacteurs.
Un niveau additionnel de complexité peut-être ajouté par les modifications post- traductionnelles des corépresseurs et/ou des HDACs contrôlant l’association en un complexe enzymatiquement actif.
Pour les HDACs de classe 1 et 11, leur fonction est médiée à travers le recrutement et leur association avec des partenaires. En effet, des corépresseurs transcriptionnels comme SMRT/N-CoR et mSin3A sont nécessaires pour « activer » leur activité enzymatique HD AC.
On parle dès lors de complexe répresseur de haut poids moléculaire. Ces derniers permettent une désacétylation restreinte à l’environnement de la chromatine spécifique des gènes pour lesquels ils ont été ciblés (Guenther et al., 2001). Néanmoins, les HDACs ont aussi été montrées pour interagir directement avec la séquence spécifique de liaison à l’ADN de certains facteurs de transcription et réprimer leur promoteur cible (Kao et al., 2002) ceux-ci incluant les récepteurs nucléaires aux hormones, les facteurs de liaison E-box et les protéines de liaison méthyl-cytosine MeCp2 (Fischle et al., 2001) (voir plus loin).
Les HDACs de Classe 111: Le prototype de la classe 111 est une protéine silencieuse de la famille Sir2 {Saccharomyces cerevisiae) (Chang et al., 2002; Thiagalingam et al., 2003). La réaction enzymatique apparaît pour être unique et requiert le cofacteur NAD+ (Kao et al., 2002; Gallo et al., 2004) pour être active (Guenther et al., 2001; Zhou et al., 2001).
Actuellement, chez les Mammifères, sept protéines Sirtuins (SIRT 1 à 7) ont été identifiées (Kyrylenko et ai, 2003). Leur fonction reste largement inconnue mais leur dépendance vis-à- vis du cofacteur NAD+ pourrait les incriminer dans un lien entre l’activité métabolique et l’acétylation des histones/protéines (Kyrylenko et al., 2003).
Le recrutement de protéines à activité HDAC dans des complexes de co-répression peut être mis en évidence par l’utilisation d’un inhibiteur spécifique de cette activité enzymatique, en l’occurrence la trichostatine A (TSA). Les HDACs 1-11 (à l’exception de HDAC6), tes HDACs RPD3 et HD Al sont sensibles à l’inhibition par la TSA (Zhou et ai, 2001; Kao et al., 2002). En rev
2mche, les HDACs de classe 111 de la famille Sir2 sont insensibles à la TSA (Zhou et al., 2001; Gao et al., 2002; Kao et al., 2002).
Alternativement aux histones, les HDACs et les HATs peuvent utiliser des facteurs de transcription comme substrat (voir plus loin) et l’élimination ou l’addition de groupes acétyles
Introduction
6
sur ces facteurs de transcription peut être cruciale dans le contrôle de l’initiation de la transcription. L’acétylation du coactivateur au récepteur nucléaire ACTR par p300 prévient son interaction avec le récepteur p aux oestrogènes et d’autres coactivateurs ayant pour conséquence une atténuation de l’activation transcriptionnelle induite par les oestrogènes (Chen et al., 1999; Hu et al., 2000). D’autres faeteurs de transcription comme GATA-1 (Boyes et al., 1998) et p53 (Gu and Roeder, 1997), les protéines du groupe à haute mobilité (HMG) et le facteur de la machinerie basale TFuF, ont été montrés pour être acétylés (Huang et al., 2000). A côté de l’utilisation de facteurs de transcription comme substrat d’acétylation, les HDACs peuvent aussi séquestrer des cofacteurs critiques du complexe d’initiation de la transcription par des interactions protéine-protéine, ce qui réprime l’activation des gènes (FIu et al., 2000).
Une balance fine entre les activités HATs et HDACs des queues des histones peut donc être un des mécanismes utilisés par la cellule pour maintenir l’équilibre entre la stimulation et l’inhibition de l’initiation de l’expression des gènes (Gao et al., 2002; Kao et al., 2002; Lacoste et ai, 2003).
Les extrémités des histones peuvent subir d’autres modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, la méthylation et/ou l’ubiquitinylation. Comme l’acétylation ou la désacétylation, ces modifications peuvent être associées à un état d’activation ou de répression de la transcription des gènes.
La phosphorylation des histones
La phosphorylation s’opère sur des résidus sérines ou thréonines des extrémités des
histones. Aussi, la phosphorylation de l’histone H3 (cette histone est responsable en partie
des interactions entre les fibres de ehromatine) sur la sérine 10 peut-être corrélée à une
activation transcriptionnelle de gènes précoces tels que c-jun, c-fos et c-myc (Strelkov and
Davie, 2002; Lacoste et al., 2003). De plus, la phosphorylation des histones joue également
un rôle dans la réparation de l’ADN ayant subi des cassures doubles brins. Chez les
Mammifères, le résidu 139 de l’histone H2A est ciblé par la kinase ATM/ATR (Redon et al.,
2002). Cette phosphorylation établit un large domaine chromatinien autour des sites doubles
brins sur l’ADN, et permettrait le recrutement de complexes de reconfiguration de la
chromatine afin de faciliter l’accès de la machinerie de réparation à l’ADN (Lacoste et al., 2003). D’autres résidus des histones peuvent également être phosphorylés, notamment la sérine 28 de H3, la sérine 14 de H2B ainsi que la sérine 1 de H4 et de H2A. La caractérisation du rôle de ces modifications et des enzymes qui y participent est en cours (Lacoste et ai, 2003).
La méthylation des histones
Les résidus lysines ou arginines des histones sont également méthylés par plusieurs enzymes de la famille de protéines histones méthyl-transférases (HMTs) (Zhang and Reinberg, 2001). Cette modification post-traductionnelle des histones et en particulier celle de la lysine 9 de l’histone H3, s’avère fondamentale pour la répression de l’expression génique (Heard et al., 2001; Fuks, 2003). En effet, la méthylation de la lysine 9 crée un site de fixation pour le répresseur HPl {heterochromatin g_rotein /), une protéine associée à la formation de l’hétérochromatine et qui facilite le recrutement des méthyl-transférases de l’ADN (voir plus loin). Les mutation des gènes dim-5 chez le champignon Neurosposa crassa et kryptonite chez la plante Arabidopsis thaliana (deux gènes codant des HMTs) ont pour conséquence une réduction de la méthylation des histones mais également de l’ADN (Fuks, 2003). Dans le contexte d'A. thaliana, des données d’interaction in vitro suggèrent que LHP1, homologue du répresseur HP 1 des Mammifères, est associé à la méthyl-transférase de l’ADN CMT3 (Jackson et al., 2002). Ces résultats mettent en avant une connexion entre méthylation des histones et méthylation de l’ADN.
Une question essentielle reste posée. La méthylation constitue t-elle une modification permanente ou réversible, ce qui revient à se demander s’il existe des déméthylases d’histones. Il s’emblerait qu’il existe un phénomène de protéolyse des domaines amino
terminaux des histones méthylés (Bannister et ai, 2002; Lacoste et ai, 2003).
L’ubiquitinylation des histones
Les histones, principalement H2A mais aussi H2B et H3, peuvent être ubiquitinylées de façon transitoire. Cette modification à aussi été associée à la régulation de 1a transcription (Baarends et al., 1999; Jason et al., 2002). Si l’ajout de plusieurs copies d’ubiquitine est très souvent associé à la dégradation, par le protéasome, de la protéine modifiée; la modification
Introduction
8
H2A N-SGRGKQGGKARARKTRSSRAGL, P ac
5 10 15 20
ac ac ac ac P
H2B N-PEPSKSAPAPKKGSKKAITKAQKKDGKKRKRSRK.
5 10 15 20 25 30
m m m
ac
"ac m ac ac m m P m
H3 N-AKTKQTAR STGGKAPKKQLATKAAKKSAPATGGVKK.
5 10 15 20 25 30 35
P m ac ac ac ac m
H4 N-SGAGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRD
5 10 15 20
Figure 3 : Résumé des modifications post-traductionnelles des extrémités N-terminales des histones.
La composition en acides aminés des extrémités N-terminales des quatre molécules d’histones (H) est représentée. Les modifications post-
traductionnelles sont indiquées : la phosphorylation est indiquée en bleu, l’acétylation en rouge et la méthylation en vert.
des histones semble particulière car elle ne met en jeu qu’une simple mono-ubiquitinylation
« non dégradative » d’une lysine dans le domaine carboxy-terminal des histones (Lacoste et ai, 2003).
En conclusion, la structure de la chromatine est régulée par diverses modifications post-traductionnelles au niveau des extrémités des histones. La figure 3 présente les différentes modifications relevées pour les 4 molécules d’histones formant le nucléosome.
Par exemple, l’extrémité amino-terminale de l’histone H3 est acétylée au niveau des lysines 9, 14, 18 et 23, phosphorylée au niveau des sérines 10 et 28 et méthylée au niveau des lysines 2, 4, 9, 17, 26, 27, 36 et 79 (Cheung et ai, 2000; Lacoste et ai, 2003). La lysine 9 de l’histone H3 peut être soit acétylée, soit méthylée, ces modifications étant mutuellement exclusives (Lacoste et al., 2003). La proximité et la juxtaposition de certains de ces sites ont amené les chercheurs à proposer un modèle selon lequel la modification d’un site régule la modification d’un autre site. Plusieurs résultats d’expériences confortent cette hypothèse. Par exemple, la phosphorylation de la sérine 10 de l’histone H3 renforce l’acétylation de la lysine 14 de cette même histone. Ces deux modifications conduisent à la répression de la méthylation de la lysine 9 pour activer, in fine, la transcription du gène c-fos suite à des signaux mitogènes comme les facteurs de croissance et les esters de phorbol (Cheung et al., 2000; Lacoste et ai, 2003). De même, les modifications du domaine amino-terminal de l’histone H4 peuvent avoir des effets régulateurs les unes sur les autres. L’acétylation des lysines 8 et 12 par le coactivateur transcriptionnel p300/CBP est augmentée lorsque l’arginine 3 est méthylée. De plus, l’acétylation des lysines 5, 8, 12 et 16 inhiberait la méthylation de l’arginine 3 (Zhang and Reinberg, 2001).
11 apparaît que donc ces modifications ont une influence les unes sur les autres, non seulement lorsqu’elles sont présentes sur une même queue d’histone, mais également en trans. En effet, il existe un lien entre l’ubiquitinylation de la lysine 123 de H2B et la méthylation des lysines 4 et 79 de H3 (Briggs et al., 2002). La combinaison de ces modifications permet de relâcher ou de compacter la structure de la chromatine pour activer ou réprimer l’expression des gènes (Turner, 2002; Lacoste et al., 2003).
Introduction
9
SWI/SNF ISWI Mi2/NURD
Figure 4 : Composition des sous-unités des différentes familles de complexes de remodelage de la chromatine.
Les protéines à activité ATPase dans le complexe Swi/Snf, Iswl et Mi-2/NuRD sont
représentées en violet.
A.2.1.b) Modifications non covalentes des histones
La structure de la chromatine est également modulée par des complexes multiprotéiques possédant tous une sous-unité catalytique à activité ATPase dépendante de l’ADN. Ces complexes appelés complexes de remodelage de la chromatine fonctionnent de manière plus mécanique; ils utilisent l’énergie libérée par l’hydrolyse de l’ATP pour catalyser une modification conformationnelle de la chromatine, consistant en une torsion de l’ADN (Havas et ai, 2000), qui provoquerait un déplacement du nucléosome le long de celui-ci libérant ou masquant ainsi des régions de régulation transcriptionnelle (Kingston and Narlikar, 1999). La nature de la sous-unité catalytique est la base du classement de ces complexes de remodelage (Xhue et ai, 1998; Langst and Becker, 2001; Martens and Winston, 2003). La sous-unité Swi2/Snf2 définit la première famille de complexes de remodelage, appelée Swi/Snf. Ces complexes modifient les nucléosomes et rendent l’ADN plus accessible aux protéines. L’ATPase Iswl définit la deuxième famille de complexes de remodelage, nommée Iswl. Les complexes de la famille Iswl ne semblent pas se lier à l’ADN ou aux nucléosomes avec une forte affinité. Ils pourraient interagir avec les extensions des histones.
La troisième famille est appelée Mi-2/NuRD par référence à sa sous-unité catalytique Mi-2 (Figure 4) (Vignali et al., 2000; Martens and Winston, 2003).
Le mécanisme de ciblage de ces complexes au niveau des promoteurs reste encore à déterminer. Cependant, la sous-unité Swi2/Snf2 contient un motif dénommé bromodomaine (également présent chez certains facteurs de transcription) et qui lie les résidus lysines acétylés des queues amino-terminales des histones. Ce domaine est requis pour l’association stable, in vitro, de Swi/Snf avec la chromatine (Hassan et al., 2002; Martens and Winston, 2003). Cette interaction permet la rétention du complexe protéique sur des régions de la chromatine hyperacétylées (Lacoste et ai, 2003). De plus, des expériences de co
immunoprécipitation ont montré que le récepteur aux glucocorticoïdes interagit physiquement avec le complexe de remodelage Swi/Snf (Vignali et al., 2000). En outre, il a également été montré que ce complexe pouvait être directement associé à des facteurs généraux de la transcription et notamment l’holoenzyme ARN polymérase de type 11. Des travaux ont montré, dans le cas du promoteur de l’anti-trypsine al humain, que le recrutement de Swi/Snf ne s’opère qu’après l’assemblage complet du complexe de préinitiation de la transcription (voir plus loin) (Soutoglou and Talianidis, 2002; Martens and Winston, 2003).
Introduction
10
A Le complexe HMT/HPl r^cfute lesDnmt au niveau des cytokines à modifier
Coopération entre Dnmt et HDAC Coopération entre Dnmt et HMT
\
^ Les MBD recrutent le complexe HMT/HPl au niveou des résidus H3K9 à métKyler
Figure 5 ; Mécanismes moléculaires de verrouillage de la transcription par méthylation de l’ADN et modifications de la chromatine.
Dans une première phase (A), l’association entre les méthyl-transférases de l’ADN (Dnmts) et les histones désacétylases (HDACs) conduit à l’acétylation des histones et, au moins dans certaines situations, à la méthylation des cytosines, provoquant une compaction de la chromatine et donc une répression de la transcription. Par ailleurs, les Dnmts sont recrutées par le répresseur HPl (heterochromatin protein 1), lui-même fixé spécifiquement sur les histones H3 méthylées sur la lysine 9 (H3K9) par action de l’enzyme histone méthyle transférase (HMT). Dans une deuxième étape (B), la méthylation des CpG permet la fixation de la protéine MBD (jnethyl-CpG binding domain) qui recrute une activité HDAC. De plus, le facteur MBD recrute une activité HMT qui permet la liaison de HPl et la répression, par un mécanisme encore inconnu, de la transcription.
La méthylation de l’ADN pourrait ainsi en retour influencer la modification des histones, permettant ainsi le verrouillage total et stable de l’expression génique. Ac: groupe acétyle; me:
groupe méthyle. Adapté d’après (Fuks, 2003).
Au sein des complexes de remodelage on observe également des protéines à activité HAT ou HD AC (Xue et al., 1998; Zhang et al., 2002). Ainsi le complexe Mi-2/NuRD comprend les protéines à activité histone désacétylase, HDACl et HDAC2, De même, le complexe Swi/Snf est associé à HDACl dans la médiation de la répression du promoteur de la cycline DI (Zhang et al., 2002).
A.2.2. Modification de VADN : la méthylation
Parmi les mécanismes de verrouillage de l’expression des gènes, la méthylation des cytosines, modification chimique spécifique et réversible de l’ADN, apparaît de plus en plus comme un niveau de contrôle important. Cette modification est dite « épigénétique » parce qu’elle module l’activité du génome sans en affecter directement la séquence (Fuks, 2003).
Elle est localisée dans des régions génomiques spécifiques riche en dinucléotides CpG. Trois enzymes catalysant la réaction de transfert des résidus méthyles sur les cytosines ont été clonés. Il s’agit des DNA méthyl-transférases Dnmtl, DnmtSa et Dnmt3b (Bestor, 1988;
Okano et al., 1999; Rountree et al., 2001). La méthylation de l’ADN participe au maintien de l’état compacté de la chromatine. Il semblerait que la molécule d’histone H1 interagisse plus fortement avec T ADN lorsque celui-ci est méthylé (McArthur and Thomas, 1996).
La méthylation de TADN peut inhiber la fixation de facteurs qui reconnaissent des séquences riches en GC. En outre, divers travaux ont montré une connexion mécanistique étroite entre méthylation de l’ADN et la désacétylation des histones. En effet, des répresseurs à domaines MBD (methyl-CpG-binding domain), sont capables de recruter des HDACs au niveau des séquences génomiques méthylées par les Dnmts, ce qui a pour effet de désacétyler les histones et de maintenir une structure condensée de la chromatine (Jones et al., 1998; Nan et al., 1998; Rountree et al., 2000; Fuks et al, 2001). MeCp2, une protéine à domaine MBD, possède un domaine répresseur de la transcription appelé TRD {transcriptional repression domain) (Hendrich and Bird, 1998) qui recrute des complexes corépresseurs tels que mSin3A qui recrute à son tour des enzymes à activité HD AC (Jones et al., 1998; Nan and Bird, 2001).
En outre, MeCp2, se fixe aux CpG méthylés par les Dnmts et pourrait influencer la méthylation de la lysine 9 de l’histone H3 (Tazi and Bird, 1990).
La méthylation de l’ADN et des histones pourrait constituer ime boucle de régulation ayant pour conséquence de propager et de maintenir de façon stable les états épigénétiques répressifs de la chromatine (Figure 5) (Fuks, 2003). Cette régulation est particulièrement
Introduction
11
A B
______________ [^:
TATA
t
Ç jtf Ï i ]^ I ^
TATA
t
______________
TATA
t
TATA
l
TATA
TATA
HOLOENZYME
î
Figure 6 : Assemblage du complexe de pré-initiation de la transcription.
A) Modèle séquentiel d’assemblage du complexe de pré-initiation. Le complexe TF,jD se lie à l’ADN au niveau de la boîte TATA. TFjjA vient stabiliser le complexe ADN-TFjjD. Ensuite, les autres facteurs TF„B, TFjjF, TARN polymérase II (POLII), TFj,E et TFjjH viennent s’ajouter tour à tour pour former le complexe de pré-initiation de la transcription.
B) Modèle de l’holoenzyme. Les facteurs TF,|B, TF„F, l’ARN polymérase II (POLII), TFj|E et TFjjH sont associés dans la cellule sous forme d’un grand complexe appelé holoenzyme. Ce complexe multiprotéique est recruté en une fois sur l’ADN pour former le complexe de pré
initiation de la transcription.
adaptée aux situations cellulaires qui nécessitent l’extinction totale et stable d’un gène ou d’une région génomique spécifique. C’est par exemple le cas pour l’inactivation du chromosome X chez les Mammifères femelles, dont l’ADN est méthylé et les lysines 9 de l’histone H3 désacétylées et méthylées (Tazi and Bird, 1990; Peters et al, 2002),
A.3. La machinerie basale de transcription
A l’heure actuelle, le modèle le plus couramment proposé est le suivant : une fois la chromatine relâchée, la machinerie basale de transcription peut prendre place sur l’ADN.
Cette machinerie basale est constituée de l’ARN polymérase de type II et des GTF (Orphanides et al, 1996; Kim et al, 1997) incluant les protéines des complexes TFnA, TFnB, TFiiD, TFiiE, TFiiF et TFnH (Roeder, 1991). L’assemblage de ces facteurs et de l’ARN polymérase II forme le complexe de pré-initiation PIC iÿre-initiation çomplex). La mise en place du PIC sur l’ADN s’opère sur la boîte TATA (une séquence de 7 bases, TATA A située à environ 25-30 paires de bases en amont du site d’initiation de la transcription) par l’intermédiaire de la protéine TBP {TATA binding protein) (Figure 6). Certains gènes sont dépourvus de boîte TATA. Dans ces conditions, le complexe protéique TFnD (composé de la TBP et des cofacteurs associés appelés TAFs) est recruté et stabilisé sur l’ADN via des interactions protéine-protéine avec des facteurs de transcription se fixant au niveau de séquences riches en pyrimidines appelées « initiateurs ». Il a en effet été montré que l’activation de promoteurs ne contenant pas de boîte TATA pouvait être médiée par des interactions entre la protéine TAFllO, appartenant au complexe TFnD, et les facteur de transcription Spl ou CREB (Azizkhan et ah, 1993; Duhr et al., 2001; Zhou and Chiang, 2001). Souvent, ces gènes possèdent plusieurs sites d’initiation de la transcription probablement à cause de l’absence de boîte TATA (Geng and Johnson, 1993).
A.4. Les facteurs régulateurs
Lorsque la machinerie basale de transcription est positionnée au niveau du promoteur minimal d’un gène, son activité peut être stimulée ou réprimée par les facteurs régulateurs de la transcription. Ces facteurs reconnaissent des séquences spécifiques dans les régions
Introduction
12
bHLH HTH
C C
Figure 7 : Structure des principaux différents domaines de liaison à l’ADN des facteurs de transcription.
bHLH : domaine à motif hélice-boucle-hélice basique (représentation d’un dimère).
HTH : domaine à motif hélice-coude (tour)-hélice.
bZIP ou LZ : domaine à motif de fermeture éclair à leucines (les leucines sont représentées par les boules jaunes).
ZnF: domaine à motif en doigts de zinc (deux domaines sont représentés, les ions zinc sont
représentés par les boules bleues).
proximales et distales du promoteur core. Ce sont eux qui assurent un contrôle spatio- temporel de l’expression des gènes dans la cellule.
A.4.1. Principaux domaines fonctionnels
Les facteurs de transcription sont des protéines modulaires qui possèdent au moins im domaine de liaison à l’ADN et au moins un domaine de régulation de 1a transcription.
Parfois, certains facteurs possèdent également un domaine de dimérisation pour ceux qui ne peuvent se fixer sur P ADN que sous forme de dimères ou encore im domaine de fixation pour un ligand. Dans ce dernier cas, il s’agit par exemple du récepteur aux oestrogènes dont l’activité est dépendante de la fixation de l’hormone (Wilson et al., 1990).
A.4.1.a) Les domaines de liaison à l’ADN
La structure tridimentionnelle des facteurs de transcription est adaptée à leur fonction;
en effet, ils adoptent une structure spatiale qui est complémentaire à celle du fragment d’ADN qu’ils doivent reconnaître (Verger and Duterque-Coquilladud, 2002; Alvarez et al., 2003;
Marmorstein and Fitzgerald, 2003). Les facteurs de transcription ont tous une conformation tridimensionnelle contenant au moins une hélice a dont le diamètre est de 1,2 nm. Le sillon majeur de l’ADN (en conformation B) est caractérisé par ime largeur de 1,2 mn, ce qui explique que l’hélice a puisse parfaitement s’insérer dans le grand sillon de l’ADN (Lehninger, 2001; Rawn, 2001). Les facteurs de transcription sont capables de cibler leur domaine de liaison sur l’ADN, non pas en reconnaissant uniquement la séquence nucléotidique proprement dite mais en reconnaissant aussi la structure particulière que l’ADN adopte au niveau de cette séquence cible (Verger and Duterque-Coquillaud, 2002; Alvarez et al., 2003; Marmorstein and Fitzgerald, 2003). Sur base de la conservation de la structure du domaine de liaison à l’ADN, les facteurs de transcription peuvent être classés en quatre grandes sous familles (Patikoglou and Burley, 1997). Les principaux domaines de liaison à l’ADN sont : (1) le motif hélice-boucle-hélice basique (bHLH pour basic helix-loop-helix), (2) le motif hélice-coude-hélice (HTH pour helix-turn-helix), (3) le motif de fermeture éclair à leucine (LZ pour leucine zipper) et (4) le motif en doigts de zinc (ZnF pour zinc finger) (Figure 7).
Introduction
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A.4.1.b) Les domaines régulateurs de la transcription
Les domaines régulateurs de la transcription peuvent être soit des domaines activateurs, soit des domaines répresseurs. Ces domaines sont beaucoup moins bien caractérisés que les domaines de liaison à l’ADN et ont été définis, entre autres, par des expériences de fusion à im domaine hétérologue de liaison à l’ADN comme celui des protéines GAL4 (levure) ou LEXA (bactérie) et l’étude de leurs systèmes rapporteurs correspondants. Pour certains d’entre eux, une classification de ces domaines a été faite sur base de leur composition en acides aminés. Par exemple, les domaines activateurs acides des facteurs de transcription p53 et Spl sont riches en aa aspartiques et/ou glutamiques (Ma and Ptashne, 1987; Courey et al, 1989). En revanche, pour le facteur de transcription CTF, le domaine activateur est riche en résidus prolines (Mermod et al., 1989).
La répression transcriptionnelle est également un mécanisme important dans le contrôle précis de l’expression génique. Il a été mis en évidence à plusieurs reprises, qu’un domaine riche en résidus hydrophobes comme les alanines est associé est un effet répresseur sur la transcription (Hanna-Rose and Hansen, 1996). C’est par exemple le cas pour la protéine EVXCl (Briata et al., 1997a) dont le domaine répresseur est constitué d’une cinquantaine d’aa riches en résidus alanines, ou encore poim la protéine Drl (Yeung et al., 1994; Kim et al., 1997; Nagano and Shiokawa, 1999) qui interagit avec TBP et prévient l’association de TFnB et du complexe TBP-TATA.
A,4,2, Modulation de Vactivité des facteurs de transcription
L’activité des facteurs de transcription peut être modulée par différents mécanismes.
Parmi ceux-ci, citons la dimérisation de la protéine, l’interaction avec d’autres protéines ou
encore des modifications post-traductionnelles, pouvant elles même moduler les interactions
protéine-protéine et/ou protéine-ADN (Verger and Duterque-Coquillaud, 2002; Alvarez et al.,
2003; Marmorstein and Fitzgerald, 2003). Ces événements majeurs permettent de stimuler ou
de réprimer l’activité des facteurs de transcription. Nous avons choisi d’illustrer ci-dessous
les mécanismes de fonctionnement de ces facteurs de transcription en prenant comme
exemple des membres de la famille Ets. En effet, l’un d’eux, Fev, fait l’objet de cette thèse et
sera présenté dans la dernière partie de l’introduction.
A.4.2.a) Les partenaires protéiques
Les protéines régulatrices agissent rarement seules. Elles sont souvent intégrées au sein de complexes multiprotéiques contenant, entre autres, d’autres facteurs de transcription mais également des coactivateurs ou des corépresseurs. Ensemble, ils activent ou répriment la transcription. Ce partenariat peut conduire à une synergie d’action de ces facteurs sur la transcription de gènes. Les mécanismes mis en jeu sont soit le recrutement du réel effecteur (une HDAC par exemple), soit un changement de conformation de l’ADN permettant une meilleure régulation des séquences régulatrices, soit une stabilisation des facteurs de transcription sur l’ADN. Citons par exemple la protéine LEF-1 dont la fixation sur Venhancer du gène TcRa induit une courbure de l’ADN nécessaire à l’interaction entre les dimères PEBP2/Ets-1 et CREB/ATF-2. En effet, au niveau de Venhancer du TCRa, les protéines PEBP2a et Ets-1 interagissent pour former un dimère. Ces protéines reconnaissent des sites adjacents et se lient de manière coopérative sur Venhancer. De plus, Ets-1 interagit avec les facteurs de transcription ATF-2 et CREB regroupés en dimères sur leur site propre de liaison. Cette interaction permettant in fine la stabilisation du complexe PEBP2/Ets-1 sur l’ADN (Giese étal, 1995).
A.4.2.b) Les modifications post-traductionnelles
Parmi les modifications post-traductionnelles actuellement étudiées, la phosphorylation de résidus sérines/thréonines par les kinases représente une pierre d’angle.
La phosphorylation des facteurs de transcription du groupe Elk (comprenant Elk-1, Sap-1, Sap-2), appartenant à la famille Ets, sur plusieurs résidus sérines/thréonines conservés dans la région carboxy-terminale, module l’activité transcriptionnelle et la fixation à l’ADN de ces protéines (Price et al, 1995; Whitmarsh et al, 1995; Buchwalter et al, 2004). En particulier, la phosphorylation de la sérine 383 est primordiale pour l’activité transcriptionnelle et la formation du complexe ternaire avec le facteur de réponse au sérum (SRF) (Gille et al, 1995) au niveau du site de l’élément de réponse au sérum (SRE) contenu au sein du promoteur cible.
Elk-1 est le substrat de plusieurs MAP kinases (mitogen activated protein kinase) : ERK (Treisman, 1994), p38 (Whitmarsh et al, 1997) et JNK (Whitmarsh et al, 1995). Des interactions physiques entre Elk-1 et les MAP kinases ERK et JNK (Gille et al, 1995) ont été mises en évidence. Elles semblent contribuer à la spécificité du substrat phosphorylé. Même
Introduction
