Rôle du TGFbeta dans l’initiation de la carcinogénèse pancréatique

HAL Id: tel-01493681

https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01493681

HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci-entific research documents, whether they are pub-lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.

L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.

Rôle du TGFbeta dans l’initiation de la carcinogénèse

pancréatique

Nicolas Chuvin

To cite this version:

Nicolas Chuvin. Rôle du TGFbeta dans l’initiation de la carcinogénèse pancréatique. Biologie cellu-laire. Université de Lyon, 2016. Français. �NNT : 2016LYSE1211�. �tel-01493681�

1 N°d’ordre NNT : 2016LYSE1211

THESE de DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE LYON

l’Université Claude Bernard Lyon 1

Ecole Doctorale de Biologie Moléculaire et Cellulaire ED 340

Spécialité de doctorat : Biologie

Rôle du TGF

EE dans l’initiation de la

carcinogénèse pancréatique

Par

Nicolas CHUVIN

Thèse dirigée par : Dr. Laurent BARTHOLIN

Laboratoire : Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon

INSERM 01052 – CNRS UMR5286

Soutenue le 08/11/16

Devant le jury composé de :

Pr. Michel RIVOIRE, PUPH UCBL, Centre Léon Bérard Président

Dr. Corinne BOUSQUET, DR2 INSERM, Centre de Recherche en Cancérologie de Toulouse, Rapporteure

Dr. Sabine BAILLY, DR2 INSERM, CEA Grenoble, Rapporteure

Dr. Fabienne GUILLAUMOND-MARCHAI, CR1 INSERM, Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille, Examinatrice

Dr. Mathieu GABUT, CR1 INSERM, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, Examinateur

Dr. Laurent BARTHOLIN, CR2 INSERM, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, Directeur de thèse

2

REMERCIEMENTS

Je souhaiterais remercier les rapporteurs, le Dr. Corinne BOUSQUET et le Dr. Sabine BAILLY, ainsi que les autres membres de mon jury de thèse, le Pr. Michel RIVOIRE, le Dr. Fabienne GUILLAUMOND-MARCHAI, et le Dr. Mathieu GABUT d’avoir accepté d’évaluer mon travail.

Je remercie mon directeur de thèse Laurent BARTHOLIN de son soutien et de son encadrement permanents. Laurent, tu m’as pris sous ton aile dès mon M1 et tu m’as soutenu pour partir me former aux USA. Merci de m’avoir accepté en thèse à mon retour et de m’avoir proposé autant de sujets intéressants. Merci de m’avoir laissé m’exprimer, de m’avoir laissé une grande liberté, et de m’avoir encouragé dans ce que je voulais entreprendre à tous les instants de ma thèse. Je te remercie également d’avoir été autant à l’écoute et flexible sur des sujets plus personnels. J’espère que tu arriveras à maintenir l’esprit d’équipe, la solidarité et l’humain qui ont toujours caractérisé ton équipe. Sur un plan plus personnel, merci pour les virées bien sympathiques que tu as organisé afin de se dégourdir les jambes et l’esprit. Merci également de m’avoir ramené à La Tour du Pin quand Sofia allait accoucher !

Un grand merci également à Stéphanie SENTIS. Merci tout d’abord de m’avoir encadré au sein du groupe pédagogique du département de Biochimie. Merci au passage à toute l’équipe pédagogique qui m’a si bien accueillie. Mes années de monitorat ont été riches en expériences et en rencontres, et j’espère avoir apporté aux étudiants autant qu’ils m’ont apporté. Merci également de ton calme et de ta bonne humeur permanente au laboratoire. Merci pour tes conseils avisés, qu’ils soient scientifiques ou personnels. Tu es très à l’écoute et toujours prête à prendre du temps pour discuter de sujets personnels. Et puis comme on dit « qui aime bien châtie bien », je terminerai en te conseillant de ne jamais laissé la fenêtre du bureau ouverte, les courants d’air sont parfois traîtres !

Je souhaiterais également remercier Ulrich VALCOURT pour ses conseils techniques et conceptuels et les discussions scientifiques. Ca a été un plaisir de travailler avec toi, même si nos interactions ont malheureusement été plus limitées qu’avec les autres membres de l’équipe. Je souhaiterais remercier Johann GOUT pour l’ensemble de son œuvre. C’est rare de rencontrer des personnes comme toi Jo, dont l’intégrité n’a d’égal que l’altruisme. Tu m’as beaucoup appris scientifiquement et humainement. J’ai eu la chance pendant ma thèse d’avoir un excellent post-doc pour m’aiguiller, pour discuter science au quotidien, pour partager son expérience et me former. Moi, président de la République, je créerai un poste à l’Inserm rien que pour toi : consultant formateur pour les thésards (option cinéma). Sisi gros, chte jure jé tro kiffé cé zanné frére ! Et oui, car en plus tu as un sens de l’humour débordant, et les délires avec toi vont me manquer (m’ont déjà manqué en fait). Encore un grand merci !

Je remercie David VINCENT, thésard aujourd’hui post-doc qui m’a formé à mon arrivée en M1. Premier thésard de Laurent, serait-il au laboratoire ce que Jésus est à la religion chrétienne ? En tout cas aujourd’hui il a la barbe et porte des robes. Merci à toi pour ta patience et ton dynamisme, pour tes enseignements et tes conseils. Merci de m’avoir laissé continuer le beau projet que tu avais commencé, et d’avoir été si disponible pour m’aider à la terminer. Merci pour ton humour débordant qui a imprégné l’équipe d’une bonne humeur constante.

3 Je voudrais aussi remercier Roxane POMMIER, thésarde de 2 ans mon aînée, qui m’a montré la voie à suivre (avec David et Lindsay), celle de la persévérance et de la réussite. Merci pour tous les conseils que tu m’as donnés, pour les discussions scientifiques et personnelles qui ont été très enrichissantes. Je suis arrivé petit con et j’espère que j’ai grandi un peu, ou au moins que j’ai ouvert un peu plus mon esprit ! Merci aussi pour ton humour et pour l’incongruance de nos conversations parfois (incongruance du verbe incongruir je précise). C’est comme ci que dès fois ça a pas trop de sens qu’est-ce qu’on disait (tête de blonde). Prochaine étape : tu m’apprends la bio-info (ouais je sais on va se prendre la tête).

Je remercie également Lindsay ALCARAZ, la plus folle des thésardes talentueuses que j’ai jamais rencontrées. Merci pour ton énergie débordante, pour ton humour, pour la touche de couleur que tu as apporté au bureau. Merci de m’avoir montré qu’on peut porter du rose et être brillante (tu sais que j’étais plein de préjugés ;)). Merci d’avoir été une super voisine de bureau, toujours à l’écoute, prête à passer du sérieux à la rigolade en un claquement de doigt. Tu es une personne pleine de surprise alors continue à nous surprendre !

Un grand merci à Sylvie MARTEL, qui dirige la troupe des « gens en blanc». Je considère que j’ai eu une chance énorme d’avoir pu travailler avec toi ces 4 années. Dans le labo on dit que tu es la maman des thésards, et c’est vrai que tu montres l’exemple en te battant sur tous les fronts sans sourciller. C’est pas un hasard si on t’a déguisée en catcheuse ! Merci aussi pour ta bonne humeur permanente et ton humour que tu transmets à toute l’équipe même quand ça va mal ! Bravo et bon courage avec les nouveaux loustiques !

Je remercie Bastien KANIEWSKI d’être l’homme fort du CRCL. Je t’ai plus connu en tant que patron d’Anican qu’en tant qu’ingénieur dans l’équipe, mais dans les deux contextes tu as montré qui était le plus fort. Tu es un peu le Chuck Norris du CRCL. Merci pour ta main toujours tendue. Tu restes droit dans ton caleçon et on sait qu’on peut compter sur toi dans n’importe quelle position. Merci pour tous ces moments passés chez toi. Merci d’être toi-même en toute circonstance, de ne pas avoir peur de parler même devant les plus grands. Merci d’avoir relevé toutes les phrases ambigües de mes années de thèse (ces dernières ci-dessus y compris), mais sache que j’en pense réellement le fond. Car vois-tu, ça se passe comme ça chez le mac. Merci aussi à Elodie ROGER, qui entame maintenant sa thèse avec la plus grande motivation. Merci d’être passée pour une thésarde pendant un an alors que tu n’étais que en M2. Merci d’avoir supporté toutes les blagues stupides et graveleuses de l’équipe (je n’y suis pour rien). Merci pour ta bonne humeur et ta sympathie, ainsi que pour toute l’aide que tu m’as apporté à la fin de ma thèse. Continue tu es sur la bonne voie, mais évite la case prison (demande aux autres si tu comprends pas, c’est en 2e _{année qu’on voit ça) !}

Merci également à Sophie AIRES, qui a fait un passage rapide par le labo mais qui a su s’intégrer dans l’équipe très rapidement et a marqué les esprits par son sérieux et à sa discrétion, mais aussi par sa capacité à rire aux éclats la bouche fermée. Merci pour ta sympathie et l’attention que tu portes aux gens. Bravo pour ton poste bien mérité et n’oublie pas : les accras de morue ça vient des îles !

I would like to thank Karam YACOUB, young PhD student, who helped me a lot at the end of my PhD. You are a hard worker and have the guts to succeed in what you started. Keep in mind your objective. I am really impressed by your will to progress and wish you the best for your professional and personal life.

4 Muchas gracias Cassandre CALIGARIS por tu ayuda en los últimos meses de mi tesis. No hemos trabajado mucho juntos pero ya se que vas a hacer un muy buen post-doc en el laboratorio de Laurent. Gracias por tu sonreir siempre presente, por tus ideas nuevas, y por el

espíritu de equipo que transmites. Thank you Jonathan LEBEAU (Alias Jonny Canada) for your three month rotation you

performed in the lab. It was a real pleasure to have you in the lab. You are the most funny person I have met so far. Thank you for making easy teaching science, thank you for your craziness and for your ideas.

Je voudrais également remercier Nicolas GADOT et Julie VALANTIN, de la plateforme d’anapathologie, qui ont rendu bien plus simple ma thèse en permettant une interaction facile et intelligente. Merci à vous deux de garder le sourire même lorsqu’on vous amène un travail monstrueux à la fin d’une semaine difficile, de donner le maximum pour que les projets de chacun se déroulent le mieux possible.

Je voudrais remercier l’ensemble du personnel de la plateforme Anican (sauf Bastien je l’ai déjà fait faut pas exagérer) qui ont rendu plus facile la gestion des animaux pendant ma thèse. Je voudrais remercier Isabelle GODDARD et Emilie SERVOZ avec qui il a été facile et agréable de travailler.

Je remercie le Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche de m’avoir financé pendant ma thèse.

Je remercie ma femme, Sofia, qui m’a soutenu et surtout supporté pendant cette thèse. Merci de m’encourager à donner le meilleur de moi-même, d’avoir confiance en moi. Merci de m’apprendre à relativiser et à laisser la folie en moi s’exprimer. Merci pour ta sagesse et ton calme quand les évènements s’accélèrent. Merci de me donner l’exemple de la volonté. Je t’aime.

Merci à Helena, ma fille. Tu as été si sage pendant ces quelques mois compliqués. A croire que tu savais dans quelle famille de fous tu étais arrivée. Merci à toi qui nous comprend déjà, tu as tant à nous apprendre.

Merci à mes parents qui m’ont toujours encouragé de leur amour à aller chercher ce que je voulais, qui ont su me donner les bases et les valeurs pour me construire. Vous êtes toujours présents à mes côtés, vos conseils sont toujours appropriés. Vous avez raison, le travail finit par payer, et c’est pas fini.

Merci à mes grands-parents que j’admire beaucoup. Vous avez toujours été l’exemple que la solidarité, la complémentarité et la persévérance peuvent venir à bout de n’importe quel obstacle. J’espère avoir autant de choses intéressantes à raconter dans 50 ans.

Je souhaiterais remercier mon petit Frère, dont les mots parfois un peu durs ont le grand mérite de vous remettre les pieds sur terre quand il faut. Merci aussi d’avoir un mental en acier. Merci aux Boyz, mes amis de toujours (ou presque, 14 ans c’est la moitié de ma vie maintenant), qui m’ont toujours soutenu quelle que soit la distance qui nous séparait. Merci d’être aussi présents et de rester des grands enfants. On a besoin de rester gosses dans nos têtes les gars !

5

Résumé et mots-clefs

Résumé

Le pancréas est un organe assurant une fonction exocrine (sécrétion d’enzymes digestives) et une fonction endocrine (régulation de la glycémie via la sécrétion d’hormones). Le tissu exocrine est un parenchyme composé de cellules acineuses et de canaux alors que le tissu endocrine est organisé en îlots de Langerhans composé de cellules endocrines. Le pancréas possède une extraordinaire plasticité en condition de stress et est capable de régénération. Cependant, au cours de la régénération du compartiment exocrine, les cellules pancréatiques ré-expriment des facteurs de transcription embryonnaires induisant une métaplasie acino-canalaire (ADM pour Acino-Ductal Metaplasia) correspondant à l’acquisition d’un phénotype progéniteur et progéniteur par les cellules acineuses. Ces cellules en ADM sont capables de proliférer et de se redifférencier en cellules acineuses pour régénérer l’organe endommagé. Cependant, elles constituent également un terrain propice au développement de lésions pré-néoplasiques évoluant vers un adénocarcinome du pancréas (ADKP).

L’ADKP est la 5e _{cause de décès par cancer dans le monde occidental, et il est estimé qu’il}

constituera la 2e _{cause de mort par cancer d’ici à 2020. Le taux de survie à 5 ans est inférieur à}

4%, et la médiane de survie est d’environ 6 mois. Ce pronostic sombre est dû à une pathologie asymptomatique dans les phases précoces du développement tumoral, résultant en un diagnostic tardif. Seulement 10% des patients sont éligibles pour une intervention chirurgicale, et entre 50% et 60% des patients présentent déjà de nombreuses métastases au diagnostic. Les tumeurs primaires sont constituées de structures épithéliales néoplasiques entourées par un stroma abondant empêchant l’accès des chimiothérapies aux cellules tumorales. La compréhension des mécanismes d’initiation et de progression tumorale est donc primordiale pour développer de nouvelles stratégies visant à la détection et à la prise en charge thérapeutique optimale des patients atteints d’ADKP.

Le TGFE est une cytokine assurant de nombreuses fonctions physiologiques comme la régulation de l’immunité, la cicatrisation, le développement ou encore l’angiogenèse. Elle est communément décrite comme un suppresseur de tumeur dans les phases précoces de la tumorigénèse (cytostasie, apoptose) et un promoteur de tumeur dans les phases tardives de la progression tumorale (dédifférenciation, métastases). Cependant le TGFE est présent en forte quantité à toutes les étapes de la progression tumorale pancréatique, suggérant un rôle

pro-6 tumoral tout au long du développement de la pathologie. Il participe à la fibrose et à l’immunosuppression accompagnant la progression de la pathologie, et sa voie de signalisation est inactivée chez 50%, soutenant la vision de la dualité fonctionnelle du TGFbeta.

Le ciblage de la voie TGFE dans l’ADKP est complexe, puisqu’en dépit de son bénéfice potentiel sur l’inhibition de l’immunosuppression et de la fibrose, le risque de libérer la prolifération incontrôlée de la tumeur pancréatique est loin d’être négligeable. L’amélioration de la connaissance des mécanismes d’action du TGFE dans les différentes phases de l’ADKP et l’évaluation au niveau préclinique et clinique de l’effet d’inhibiteurs de la voie TGFE est donc nécessaire.

Les résultats en cours de soumission et présentés dans ce manuscrit mettent en évidence que l’activation de la voie de signalisation TGFE perturbe la différenciation des cellules acineuses au cours du développement, et perturbe l’identité acineuse lorsqu’elle est activée dans le pancréas chez l’adulte. L’induction en parallèle de l’apoptose des cellules acineuses et d’une métaplasie acino-canalaire (ou ADM) mène à la disparition quasi-totale du tissu acineux au profit de structures canalaires typiques d’un pancréas en régénération. Lorsque l’oncogène KRASG12D _{est exprimé en parallèle dans le tissu pancréatique chez l’adulte, ce tissu canalaire}

régénératif est mis à profit par KRAS pour le développement précoce de lésions pré-néoplasiques. Mes travaux au sein de l’équipe du Dr. Laurent BARTHOLIN permettent donc de démontrer in vivo un nouveau rôle du TGFE dans la carcinogénèse pancréatique. Malgré les ses fonctions antiprolifératives, le TGFE peut contribuer à l’initiation tumorale via la perturbation de l’identité des cellules acineuses. Bien que cela ne soit pas démontré par nos travaux, il est possible qu’une stratégie thérapeutique visant à cibler le TGFE dans le cadre de l’ADKP permette une re-différenciation de la tumeur, favorable à un retour à l’homéostasie.

Mots-clefs

7

Summary and key words

Summary

The pancreas is an organ with both exocrine (secretion of digestive enzymes) and endocrine (hormone-mediated regulation of glycaemia) functions. The exocrine compartment is a parenchyma composed of acinar and duct cells, whereas the endocrine compartment is organized in islets of Langerhans that are composed of endocrine cells. The pancreas is extraordinary plastic and has the ability to regenerate under stress conditions. However, during exocrine regeneration, pancreatic cells re-express embryonic transcription factors that induce acinar-to-ductal metaplasia (ADM), which corresponds to the acquisition of a mixed progenitor and ductal phenotype by acinar cells. These ADM cells proliferate and differentiate into acinar cells to replenish the damaged organ. Nevertheless they also constitute a fertile soil to the development of pre-neoplastic lesions that eventually progress toward Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (PDA).

PDA is the 5th cause of cancer related death in the western countries, and is estimated to move the second rank by 2020. The 5-year survival rate is less than 4%, and the median survival is around 6 months. The poor prognostic of this tumor is due to asymptomatic early phases of the disease, resulting in a late diagnosis. Only 10% of the patients are eligible for surgical resection, and 50-60% already display a metastatic disease at diagnosis. Primary tumors are composed by ductal neoplastic lesions embedded into a highly abundant stroma that prevents the access of chemotherapeutic drugs to the tumor cells. Thus, understanding tumor initiation and progression mechanisms is needed to develop new strategies aiming at detecting and taking care of patients in the most optimal manner.

TGFE is a cytokine playing several physiological functions such as immunity regulation, wound healing, development or angiogenesis. It is commonly accepted that TGFE has a tumor suppressor role in the early steps of tumorigenesis (cytostasis, apoptosis) and a tumor promoter role in the late phases of cancer progression (dedifferentiation, metastases). However, TGFE is abundant at all stages of pancreatic carcinogenesis, suggesting a tumor promoter role all along PDA development. It contributes to the induction and maintenance of fibrosis and immunosuppression characteristic of the pathology. Inactivation of this signaling pathways occurs in about 50% of the patients, supporting the duality of TGFE.

8 Therapeutic targeting of TGFE signaling in PDA is complex. Even though it may have a benefit by inhibiting immunosuppression and fibrosis, it may also give rise to an unchained proliferation of tumor cells. Improving the understanding of TGFE mechanisms of action in PDA, and evaluation of TGFE inhibitors at the pre-clinical and clinical stage is necessary to assess this risk.

Results presented in this manuscript and being submitted demonstrate that activation of TGFE signaling disturb acinar cell differentiation during development, and disrupts acinar cell identity when activated in the adult pancreas. The simultaneous induction of acinar cell apoptosis and ADM leads to the massive loss of acinar cells and the emergence of ductal structures typical of pancreas regeneration. When the KRASG12D _{oncogene is expressed in}

combination with the activation of TGFE signaling, these regenerative duct structures are harnessed by TGFE to develop early neoplastic lesions. Thus, my work in Dr. Laurent BARTHOLIN’s team demonstrates a new function of TGFE in pancreatic carcinogenesis in

vivo. Despite its anti-proliferative role, it contributes to the tumor initiation through the

disruption of acinar cell identity. Although our work does not address this question, a therapeutic strategy targeting TGFE signaling may allow the re-differentiation of the tumor and facilitate the restoration of homeostasis.

Keywords

9

Informations concernant la préparation de

la thèse

Cette thèse a été préparée au sein du Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon (INSERM U1052-CNRS-UMR5286) dirigé par le Pr Alain Puisieux, dans l’équipe « TGFE et cancer du pancréas » dirigée par le Dr. Laurent BARTHOLIN, sur le site du Centre Léon Bérard situé 28 rue Laennec, 69373 Lyon Cedex 08.

10

« Je ne perds jamais. Soit je gagne, soit j’apprends »

11

Table des matières

ABBREVIATIONS ... 14

TABLE DES FIGURES ... 18

PREAMBULE ... 20

INTRODUCTION ... 21

I- LE PANCREAS SAIN ET SES PATHOLOGIES EXOCRINES ... 22

A) Structures et fonctions intégrées du pancréas ... 22

B) Organogénèse du pancréas ... 24

1) Naissance des bourgeons pancréatiques (E8.5-E9.5)... 24

2) Transition primaire (E9.5-E11.5) ... 25

3) Transition secondaire (E11.5-E17.5) ... 28

a) Ségrégation des progéniteurs du tronc et apicaux ... 28

b) Différenciation de la lignée acineuse ... 29

c) Ségrégation des progéniteurs canalaires et endocrines ... 29

d) Différenciation de la lignée endocrine ... 31

C) DYSFONCTIONNEMENTS DU PANCREAS EXOCRINE ... 32

1) Quelle plasticité pour le pancréas ?... 32

a) Digression sur la régénération du compartiment endocrine face au diabète ... 33

b) Régénération du compartiment exocrine face à la pancréatite ... 36

Considérations cliniques ... 36

Modèles d’études animaux ... 38

Participation des lignées pancréatiques à la régénération du tissu exocrine ... 39

Rôle du microenvironnement dans la régénération... 42

Principales voies de signalisation impliquées à ce jour ... 44

c) Conclusion sur la plasticité et la régénération du pancréas ... 47

2) L’adénocarcinome du pancréas (ADKP) ... 48

a) Généralités de l’ADKP ... 48

Incidence et mortalité ... 48

Facteurs de risque ... 50

Symptômes, diagnostics et traitements ... 51

b) Histologie de la tumorigénèse pancréatique ... 56

c) Génétique du cancer du pancréas ... 58

d) La question de la cellule d’origine de l’ADKP ... 62

12

La transition ADM-PanIN ... 68

e) Caractéristiques agressives de l’ADKP ... 70

Evolution spatio-temporelle de la tumeur : conséquences d’un diagnostic tardif . 70 L’ADKP est une tumeur localement très infiltrante ... 72

L’ADKP est une tumeur métastatique : mais depuis quand ?... 72

Rôle du stroma abondant dans le soutien de la tumorigénèse ... 75

Résistance aux traitements chimio-thérapeutiques conventionnels ... 81

D) CONLUSION ... 83

II- LE TRANSFORMING GROWTH FACTOR % (TGFE) : UN AMI QUI VOUS VEUT DU BIEN ... 84

A) Fondements historiques et scientifiques du TGFE ... 84

B) Le TGFE est produit sous la forme d’un précurseur activable : mécanismes et conséquences fonctionnelles ... 85

C) Les voies de signalisation du TGFE : une complexité toujours croissante... 88

1) Coup de projecteur sur les récepteurs ... 88

a) Les récepteurs de type II et I ... 89

b) Récepteurs de type III ... 91

2) Les voies de signalisation dépendantes des SMADS... 92

a) Voie(s) canonique(s) ... 94

b) Signalisation dépendante de SMAD2/3 mais indépendante de SMAD4 ... 96

3) Les voies de signalisation indépendantes des Smads... 97

4) Dialogue moléculaire entre le TGFE et les autres de voies de signalisation ... 100

D) Régulation des voies de signalisation TGFE ... 102

1) Régulation de l’activité des récepteurs ... 102

2) Régulation de l’activité des Smads ... 103

3) Conclusion ... 105

E) Implication des voies de signalisation TGFE dans les processus biologiques physiologiques ... 105

1) Développement embryonnaire ... 105

2) Cicatrisation ... 107

3) Régulation de l’immunité dans un contexte physiologique ... 107

4) Régulation de la prolifération et de l’apoptose des cellules ... 109

5) Régulation des cellules souches tissulaires ... 110

6) Stimulation de l’angiogénèse ... 111

13 III- COMPRENDRE LA MULTIPLICITE DU TGFE DANS L’ADKP POUR

PROPOSER UNE STRATEGIE THERAPEUTIQUE ... 112

A) Quel rôle pour le TGFE au cours de la pancréatite ... 112

B) l’ADKP ... 113

1) Altérations de la voie de signalisation TGFE dans l’ADKP chez l’homme ... 113

2) Analyse des modèles murins modélisant une inactivation de la voie TGFE dans un contexte tumoral pancréatique ... 115

C) Passer outre la dualité du TGFE pour saisir une vision intégrée de son rôle dans la tumorigénèse pancréatique ... 119

1) Effet du TGFE sur la cellule cancéreuse ... 119

a) Cytostasie et apoptose ... 119

b) TEM ... 121

c) Induction et maintien des cellules souches cancéreuses ... 123

d) Aiguillage de la voie de signalisation TGFE vers une fonction « suppresseur de tumeur » ou « pro-tumorale » ... 124

e) Effet de la restauration de SMAD4 sur les cellules cancéreuses ... 127

f) Conclusion sur l’effet du TGFE sur la cellule épithéliale tumorale ... 127

2) Effet du TGFE sur le microenvironnement de la tumeur pancréatique ... 128

a) TGFE et fibroblastes associés au cancer ... 128

b) Contexte immunosuppresseur de l’ADKP ... 129

c) TGFE et innervation de la tumeur ... 132

d) Conclusion ... 133

D) Comment envisager des stratégies thérapeutiques ciblant la signalisation TGFE dans l’ADKP ... 133

1) Essais pré-cliniques jusqu’à ce jour pour l’inhibition du TGFE dans l’ADKP ... 133

2) Essais cliniques : inhibiteurs du TGFE dans l’ADKP... 138

3) Stratégies combinatoires avec les inhibiteurs du TGFE : perspectives ... 139

4) Cibler des sous-populations de patients : un intermédiaire à la médecine personnalisée ... 140

QUESTION BIOLOGIQUE POSEE ... 143

RESULTATS ... 144

PERSPECTIVES ET CONCLUSION ... 145

14

ABBREVIATIONS

ADKP : Adénocarcinome du Pancréas

ADM : Acino-Ductal Metaplasia (Métaplasie acino-canalaire) ALK : Activin-Like-Kinase

D-SMA : a-Smooth Muscle Actin ATM : ataxia telangiectasia mutated BMP : Bone Morphogenetic Protein E-cat : beta-caténine

BRCA1/2 : Breast Cancer 1/2

CA19-9 : Carbohydrate Antigen 19-9

CDKN2A : Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor 2A CEA : Carcinoembryonic Antigen

CK19 : Cytokératine 19 CKK : Cholécystokinine Cpa1 : Carboxypeptidase A1

CTLA-4 : Cytotoxic T-Lymphocyte Associated Protein 4 CTL : lymphocytes T cytotoxiques

DC : Dendritic Cell

DCLK-1 : Doublecortin Like Kinase 1 DNAse : Désoxyribonucléase

DPC4/SMAD4 : Deleted in Pancreatic Cancer 4 EGF : Epithelial Growth Factor

Ela1 : Elastase 1

ERK : Extracellular signal-regulated kinases EU : Union Européenne

FGF : Fibroblast Growth Factor

FOLFIRINOX : association d’un antimétabolite analogue des bases pyrimidiques, le

5-fluorouracile, d’un sel de platine, l’oxaliplatine, et d’un inhibiteur de l’ADN topoisomérase 1, l’irinotécan

15 GDF : Growth and Differentiation Factor

GEMM : Genetically Engineered Mouse Model GM-CSF : Granulocyte Colony Stimulating Factor GTP : Guanosine Tri-Phosphate

Hes1 : Hes Family BHLH transcription factor 1 Hh : Hedgehog

HSC : Hematopoietic Stem Cell Hnf1b : HNF1 homeobox b.

ICAM-1 : InterCellular Adhesion Molecule-1 IKK : IkB kinase

IL : Interleukine Ins : Insuline

iPSC : induced Pluripotent Stem Cell IPMN : Intra Papillary Mucinous Neoplasm JAK : Janus Kinase

JNK : c-Jun N-terminal Kinase LAP : Latent Associated Protein LTBP : Latent TGFb Binding Protein

MKP2 : Mitogen-activated protein Kinase Phosphatase 2 MI : Macrophage

NI : Neutrophil

MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinase MCN : Mucinous Cystic Neoplasm

MDSC : Myeloid Derived Suppressor Cell MEC : Matrice Extra-Cellulaire

MMP : Matrix Metallo-Proteinase MPC : Multipotent Stem Cell MSC : Mesenchymal Stem Cell Mst-1 : Macrophage Stimulating 1

16 MUC-1 : Mucin-1

Ngn3 : Neurogenin 3 Nkx6.1 : Nk6 homeobox 1 NK : Natural Killer cell

Nr5a2 : Nuclear Receptor Subfamily 5 Group A Member 2 NFkB : Nuclear Factor k B

PAI-1 : Plasminogen activator Inhibitor 1 PanIN : Pancreatic Intraepithelial Neoplasia Par6 : Partitioning Defective Protein 6 Pax4 : Paired Box 4

PAP1 : Pancreatitis Associated Protein 1 PDL : Pancreatic Duct Ligation

PD-1/PDL-1 : Programmed Death-1/Programmed Death-ligand 1 Pdx1 : Pancreatic and duodenal homeobox 1

PDGF : Platelat Derived Growth Factor PI3K : Phospho-Inositide 3 Kinase PP : Polypeptide Pancréatique PP2A : Protein Phosphatase 2A Ppx : Partial Pancreatectomy PRSS1 : Protease Serine 1

PSC : Pancreatic Stellate Cells (Cellules pancrétiques étoilées) Ptf1a : Pancreatic Specific Transcription Factor 1a

RBPJ : Recombination Signal Binding Protein For Immunoglobulin Kappa J Region RNAse : Ribonucléase

ROS : Reactive Oxygen Species (Dérivés Réactifs de l’oxygène) Shh : Sonic hedegehog

Smo : Smoothened Sox9 : SRY-Box 9

SPARC : Secreted Protein Acidic and Rich in Cystein SPINK1 : Serine Peptidase Inhibitor Kajal Type 1

17 STAT : Signal Transducers and Activators of Transcription

TAK1: TGFE activated kinase 1 TAM : Tumor Associated Macrophage TERI/II : TGFE receptor type I/II

TEM : Transition Eptihélio-Mésenchymateuse TGFD : Transforming Growth Factor a

TGFE : Transforming Growth Factor b

TIMP : Tissue Inhibitor of Metalloproteinases TNFD : Tumor Necrosis Factor a

TP53 : Tumor Protein p53

TRAF-4/6 : TNF Receptor Associated Factor 4/6 Treg : Lymphocytes T régulateurs

TRIM33 : Tripartite Motif Containing 33 VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor YAP : Yes Associated Protein

YFP : Yellow Fluorescence Protein 5-FU : 5-Fluorouracil

18

TABLE DES FIGURES

Figure 1 : Anatomie, structure et histologie du pancréas. ... 23

Figure 2 : Importance du mésoderme dans la définition des régions pancréatiques. ... 25

Figure 3 : Développement embryonnaire du pancréas : morphologie, cellules et facteurs de transcription. ... 27

Figure 4 : Formation de l’arbre canalaire au cours de l’organogénèse pancréatique chez la souris. ... 31

Figure 5 : Vision proposée de l’évolution de l’homéostasie au cours des pathologies pancréatiques ... 33

Figure 6 : Les différents mécanismes cellulaires de régénération du compartiment endocrine ... 34

Figure 7 : Structure et ultrastructures des complexes tubulaires observés dans le cas de pancréatite chez l’homme ... 38

Figure 8 : Description morphologique et moléculaire du processus de dédifférenciation acineuse.. ... 40

Figure 9 : Régénération du compartiment exocrine suite à une pancréatite.. ... 42

Figure 10 : Incidence et mortalité de l’Adénocarcinome pancréatique. ... 49

Figure 11 : Diagnostic de l’ADKP : de l’opérabilité au traitement le plus adapté.. ... 53

Figure 12 : Histologie et génétique de la tumorigénèse pancréatique. ... 58

Figure 13 : La voie de signalisation RAS. ... 59

Figure 14 : Altérations génétiques retrouvées dans l’adénocarcinome du pancréas. ... 61

Figure 15 : La transition régénération-néoplasie, un mécanisme peu compris.. ... 70

Figure 16 : Dynamique de l’agressivité de la tumeur pancréatique. ... 73

Figure 17 : Interaction des cellules tumorales avec son stroma. ... 80

Figure 18 : Structure et métabolisme de la Gemcitabine. ... 82

Figure 19 : Structure, sécrétion et maturation du TGFEE. ... 86

Figure 20 : Différents mécanismes d’activation du TGFE latent. ... 88

Figure 21 : Structure et phosphorylations des récepteurs de type II et I.. ... 90

Figure 22 : Structure des récepteurs de type III. ... 91

19 Figure 24 : Voies de signalisation TGFEE dépendantes des SMADs. ... 95 Figure 25 : Voies de signalisation TGFE indépendante des SMADs. ... 99 Figure 26 : Les principaux dialogues moléculaires de la voie de signalisation TGFE. . 101 Figure 27 : Les différents niveaux de régulation de la voie de signalisation TGFE. ... 104 Figure 28 : Les différentes fonctions du TGFE sur l’homéostasie du système

immunitaire. ... 109 Figure 29 : La dualité de fonction du TGFE au cours de la carcinogénèse ne se limite pas au statut de SMAD4. ... 126 Figure 30 : Rôle du TGFE dans le micro-environnement tumoral de l’ADKP.. ... 130

Tableau 1 : Correspondance des différentes étapes du développement embryonnaire entre les espèces humaine et murine ... 24 Tableau 2 : Risque approximatif de développer un ADKP en fonctions de facteurs environnementaux et génétiques. ... 50 Tableau 3: Caractérisation histo-pathologique des différents modèles d’ADKP lorsque les modifications génétiques sont induites dans les progéniteurs embryonnaires.. ... 65 Tableau 4 : Liste des modèles de souris avec une activation inductible de KrasG12D_{. ... 66} Tableau 5 : Comparaison des caractérisitques physiopathologiques des patients et des modèles murins présentant une inactivation de SMAD4. ... 118 Tableau 6 : Différents essais précliniques chez la souris visant à inactiver la voie de signalisation du TGFE dans le cadre de la tumorigénèse pancréatique. ... 137 Tableau 7 : Les différents inhibiteurs du TGFE en clinique dans le cadre de l’ADKP . 139 Tableau 8 : Exemple de décisions thérapeutiques en fonction du statut de SMAD4 et RUNX3 dans le cadre de l’ADKP ... 142

20

PREAMBULE

Mes travaux de thèse se sont intéressés à comprendre le rôle de l’activation du TGFE dans l’initiation de la tumorigénèse pancréatique. Avant d’exposer les résultats issus de ces travaux de recherche et en cours de soumission, j’ai souhaité présenter dans une première partie de l’introduction le pancréas comme un organe dont la compréhension de l’embryogénèse permet d’analyser ses aspects pathologiques, notamment la pancréatite et le développement de l’adénocarcinome pancréatique (ADKP). Dans une deuxième partie, j’ai voulu donner une vision globale de la signalisation TGFE, de sa régulation, ainsi que des fonctions biologiques non pathologiques associées. La subtilité et la complexité de cette voie de signalisation qui, je l’espère, ressortira de ce chapitre, a pour but de mieux comprendre les différents rôles que le TGFE peut jouer tout au long de la progression tumorale pancréatique, que je présente dans une dernière partie. Il s’agira alors d’analyser non pas la dualité mais la multiplicité fonctionnelle du TGFE dans l’ADKP et de comprendre le défi d’une inactivation thérapeutique de cette voie de signalisation dans ce contexte. J’espère ainsi montré que mes travaux de thèse, présentés à la suite, apportent une nouvelle vision du rôle du TGFE dans la carcinogénèse pancréatique. La mise en perspective de mes travaux proposera des hypothèses et des méthodes pour répondre aux questions que soulèvent mes travaux. Je préciserai également en quoi mes travaux renouvellent l’intérêt du ciblage thérapeutique du TGFE dans l’ADKP (discussion de la publication et perspectives).

21

22

I- LE PANCREAS SAIN ET SES PATHOLOGIES

EXOCRINES

A) Structures et fonctions intégrées du pancréas

Le pancréas est une glande annexe de l’appareil digestif, logée dans l’anse duodénale et derrière l’estomac (Fig. 1). C’est une glande amphicrine, c’est-à-dire qu’elle possède une fonction exocrine et endocrine, chacune étant assurée par un compartiment précis du tissu pancréatique.

Le compartiment exocrine constitue la majorité du tissu pancréatique ; il est composé d’acini et de canaux assurant la fonction digestive du pancréas. Les acini, composés de cellules acineuses et situés à l’extrémité du réseau canalaire, sécrètent des enzymes protéolytiques (trypsine, chymotrypsine, carboxypeptidase), des ribonucléases (RNAse), des désoxyribonucléases (DNAses), une lipase et une amylase. A part la lipase et l’amylase, ces enzymes sont sécrétées sous forme inactive. Elles sont déversées dans les canaux pancréatiques, où sont sécrétés des bicarbonates, l’ensemble débouchant dans le duodénum au niveau des canaux de Wirsung (principal) et Santorini (accessoire) (Fig. 1). Au niveau du duodénum, les pro-enzymes pancréatiques sont activées par les sucs gastriques. Les bicarbonates jouent alors un rôle de tampon en neutralisant l’acidité du chyme stomacal. Cette neutralisation est essentielle puisque la grande majorité des enzymes pancréatiques sont inactives en milieu acide. Le tissu exocrine pancréatique possède une particularité histologique par rapport aux autres glandes digestives exocrines (comme les glandes salivaires) : la présence de cellules acineuse à l’interface entre les cellules acineuses et les cellules canalaires. Ces cellules centro-acineuses sont elles aussi sécrétrices de bicarbonates, et possèdent des caractéristiques à la fois de cellules acineuses, canalaires, et progénitrices. Elles pourraient notamment jouer un rôle dans la régénération du tissu exocrine comme discuté plus loin [Beer et al. 20161_].

Le compartiment endocrine est quant à lui plus discret au sein du tissu pancréatique. L’unité du tissu endocrine est l’îlot de Langerhans, compartiment bien délimité composé de cinq types de cellules endocrines. Les cellules D sont responsables de la sécrétion de glucagon, une hormone hyperglycémiante. Les cellules E sécrètent quant à elles l’insuline, unique hormone hypoglycémiante. Les cellules G sécrètent la somatostatine, qui a pour effet d’inhiber la sécrétion d’insuline et de glucagon. Les cellules H produisent la ghréline, hormone responsable du déclenchement de la sensation d’appétit et les cellules PP sécrètent le polypeptide pancréatique (PP) qui permet de limiter les sécrétions biliaire et pancréatique. Le rôle essentiel

23 du compartiment endocrine pancréatique est donc la régulation de la glycémie [Pan et al. 20112 _;

Shih et al. 20133 _{; Jorgensen et al. 2007}4_].

Figure 1: Anatomie, structure et histologie du pancréas. En haut, un schéma de l’anatomie du pancréas et de sa structure en 3D permet de mieux appréhender l’histologie du pancréas présenté en bas. D’après Shih et al. 20133_.

24

B) Organogénèse du pancréas

Note : Les processus embryologiques et les mécanismes moléculaires abordés ci-après correspondent à des études faites chez la souris. Cependant, le développement du pancréas chez la souris et chez l’homme sont très similaires, et les informations de ce paragraphe peuvent également être appliquées au développement du pancréas humain [Jennings et al. 20155_{]. Afin}

de faciliter l’appréhension du processus chez l’humain, la correspondance entre les différents stades du développement embryonnaires chez la souris, notés E0.5 – E21, et le de nombre de jours de gestation chez l’homme est indiquée Tableau 1.

Tableau 1 : Correspondance des différentes étapes du développement embryonnaire entre les espèces humaine et murine. Jpc : jour post-coïte. (d’après le cours d’embryologie de l’université de médecine de The University of New South Wales, Sydney, Australia, et d’après Jennings et al. 20155₎

L’ensemble des types cellulaires constituant le pancréas sont issus de progéniteurs communs. L’apparition de ces progéniteurs communs au cours du développement, exprimant le facteur de transcription Pdx1 (Pancreatic and Duodenal Homeobox 1), marque le début du bourgeonnement embryonnaire pancréatique. Au cours des transitions primaires puis secondaires, des processus de prolifération et différenciation permettent la génération des différents lignages cellulaires pancréatiques.

1) Naissance des bourgeons pancréatiques (E8.5-E9.5)

En amont de l’apparition des bourgeons pancréatiques, des régions pré-pancréatiques ventrales et dorsales se spécifient à E8.5 au niveau de l’endoderme de l’intestin antérieur [Shih et al. 20133_{] (Fig. 2). Ce processus requiert notamment l’inhibition de la voie Sonic Hedgehog}

(Shh) [Apelqvist et al. 19976_{], de la voie des Bone Morphogenic Proteins (BMPs) [Rossi et al.}

20017_{], ainsi que l’activation de la voie du Retinoic Acid (RA) [Martin et al. 2005}8_{]. En}

particulier, la présence de la notochorde (sécrétion de Fibroblast Growth Factor 2 et ActivinE2) et de l’aorte dorsale (sécrétion de Vascular Endothelial Growth Factor) sont indispensables à

25 l’inhibition de la voie Shh et à l’activation transcriptionnelle de Pdx1 [Pan and Wright 20112_],

facteur de transcription définissant les bourgeons pancréatiques ventraux et dorsaux (Fig. 2).

Figure 2 : Importance du mésoderme dans la définition des régions pancréatiques (d’après Pan et Wright 20112_).

2) Transition primaire (E9.5-E11.5)

La transition primaire correspond à la spécification des progéniteurs endodermiques pré-pancréatiques en progéniteurs pré-pancréatiques (Fig. 3). Après la spécification des domaines pré-pancréatiques dorsaux et ventraux, certains facteurs de transcription deviennent spécifiquement exprimés au niveau des régions prospectives pancréatiques à E9.5, comme PDX1 [Guz et al. 19959_{], PTF1A (Pancreas specific Transcription Factor 1a) [Krapp et al. 1998}10_{], SOX9 (SRY}

Box 9) [Seymour 200711_{] et HNF1E (HNF1 homoeobox E) [De Vas et al. 2015}12_{]. Ces facteurs}

de transcription permettent d’induire la différenciation de progéniteurs endodermiques non pancréatiques en progéniteurs pancréatiques, et sont également nécessaires à des étapes plus tardives de l’organogénèse du pancréas [Ahlgren 199613 _{; Krapp et al. 1998}10 _{; Kawaguchi}

200214 _{; Seymour 2007}11 _{; Afelik 2006}15 _{; Haumaitre et al. 2005}16 _{; Poll et al. 2006}17_{]. En}

l’absence de l’un de ces facteurs de transcription, la formation des bourgeons pancréatiques a lieu mais des défauts sévères de la croissance cellulaire et des processus de différenciation consécutifs sont observés. Ces facteurs (PDX1, PTF1a, SOX9 et HNF1E) sont donc essentiels à la formation des bourgeons pancréatiques et à l’engagement des différents progéniteurs dans leur voie de différenciation spécifique (Fig. 3).

Bien que les facteurs de transcription caractéristiques des progéniteurs pancréatiques soient relativement bien identifiés, les mécanismes permettant la mise en place et le maintien de ces progéniteurs sont moins caractérisés. Cependant, les tissus du mésoderme (mésenchyme) adjacents aux régions pancréatiques sont connus depuis longtemps pour avoir un rôle déterminant dans l’organogénèse pancréatique dès les stades précoces [Golosow et Grobstein

26 196218_{]. Des études plus récentes confirment ces observations et apportent une première}

réponse moléculaire. En effet, le Fibroblast Growth Factor 10 (FGF10) exprimé par le mésenchyme adjacent aux bourgeons pancréatiques est essentiel à la prolifération des cellules progénitrices pancréatiques lors de la formation des bourgeons [Bhushan et al. 200119_{]. De}

manière intéressante, les cellules épithéliales progénitrices du pancréas expriment le Fibroblast Growth Factor Receptor 2 (FGFR2), suggérant une signalisation directe du mésenchyme vers l’épithélium des bourgeons pancréatiques pour permettre la croissance des bourgeons et la spécification de la lignée pancréatique [Bhushan et al. 200119 _{; Dichmann 2003}20_{]. Ceci a été}

précisé par les travaux de Seymour et al. 201221_{, dans lesquels ils démontrent que le FGF10}

sécrété par le mésenchyme permet le maintien de l’identité pancréatique des progéniteurs exprimant FGFR2, via l’activation du facteur de transcription Sox9. L’ablation génétique de Sox9 compromet l’expression de FGFR2, indiquant que FGF10/FGFR2/Sox9 forment une boucle de régulation positive de type « feedforward ». De plus Sox9 et Hnf1E ont tous les deux des sites putatifs de fixation sur le promoteur de Ptf1a, et la délétion de Hnf1E dans le pancréas empêche l’expression de Ptf1a et Pdx1 [Pan et Wright 20112 _{; Poll et al. 2006}17 _{; Solar et al.}

200922_{]. Ainsi Sox9 et Hnf1b sont les acteurs initiaux majeurs permettant la mise en place des}

progéniteurs pancréatiques.

D’autres voies de signalisation, comme la voie Epithelial Growth Factor (EGF) [Miettinen et al. 200023_{] ou Notch [Murtaugh et al. 2003}24_{], sont également impliqués dans la}

différenciation en progéniteurs pancréatiques, mais les cellules sources à l’origine de ces signaux ainsi que leur mode de transduction n’ont pas encore été identifiés. Ainsi les tissus du mésoderme avoisinant l’endoderme pré-pancréatique sont essentiels pour l’acquisition et le maintien des caractéristiques des progéniteurs pancréatiques.

27 Figure 3 : Développement embryonnaire du pancréas : morphologie, cellules et facteurs de transcription. Le schéma de droite permet la visualisation des facteurs de transcription (en bleu) nécessaires à la mise en place de chacune des lignées cellulaires pancréatiques aux différentes étapes de l’organogénèse (adapté d’après Shih et al. 20133_).

28 3) Transition secondaire (E11.5-E17.5)

A l’issu de la transition primaire, les bourgeons pancréatiques sont composés uniquement de cellules progénitrices multipotentes (MPC pour Multipotent Progenitor Cells), caractérisés entre autres par les facteurs de transcription Pdx1, Ptf1A, Sox9, Hes1, Nkx6.1, et Hnf1b [Pan et Wright 20112_{]. Ils n’ont pas encore l’architecture de l’organe final. La différenciation des}

MPC en cellules pancréatiques matures (cellules acineuses, cellules canalaires, et cellules endocrines), ainsi que l’acquisition de la structure arborescente du pancréas, correspond à un processus en plusieurs étapes appelé transition secondaire (Fig 3).

a) Ségrégation des progéniteurs du tronc et apicaux

La première étape de la transition secondaire est la ségrégation des progéniteurs en deux sous-types : des progéniteurs du tronc (trunk progenitors) et de l’apex (tip progenitors) (Fig. 3). Les progéniteurs du tronc sont caractérisés par les facteurs de transcription Nkx6.1 (Nk6 homeobox 1), Hes1 (Hes family HLH transcription factor 1), Sox9, Hnf1E et permettent de générer les lignées endocrines et canalaires. Les progéniteurs apicaux sont caractérisés par l’expression des facteurs de transcription Ptf1a et c-myc, et sont à l’origine de la différenciation de la lignée acineuse [Shih et al. 20133 _{; Zhou et al. 2007}25_{]. La ségrégation entre les}

progéniteurs du tronc et les progéniteurs apicaux est régulée par la voie Notch, même si son rôle reste mal compris. En effet, alors que certaines études montrent qu’une inactivation de la voie Notch in vivo accélère la différenciation des progéniteurs apicaux [Afelik et al. 201226 _;

Horn et al. 201227 _{; Magenheim et al. 2011}28_{], d’autres indiquent que cela accélère la}

différenciation des cellules pancréatiques endocrines [Apelqvist 199929 _{; Jensen 2000}30_{]. En}

accord avec la première série d’études, l’activation de la voie de signalisation Notch in vivo oriente les MPC vers une différenciation en progéniteurs du tronc [Afelik et al. 201226 _{; Esni et}

al. 200431 _{; Murtaugh et al. 2003}24_{]. Ces différences sont probablement dues à la finesse du}

réglage du processus de différenciation. En effet, un niveau élevé de signalisation de la voie Notch augmente considérablement le niveau d’expression du facteur de transcription Nkx6.1, qui inhibe directement la transcription du facteur Ptf1a, entraînant alors une différenciation en progéniteurs du tronc. A l’inverse, un niveau faible d’activation de la voie Notch permet au facteur Ptf1a d’inhiber directement la transcription de Nkx6.1, entraînant une différenciation en progéniteur apical [Schaffer et al. 201032_{] (Fig 3, E12.5 schéma de droite). La notion}

29

b) Différenciation de la lignée acineuse

La différenciation des précurseurs du domaine apical en cellules acineuses nécessite l’expression des facteurs de transcription PTF1-L, Nr5a2, et Mist1. Ptf1a forme un complexe avec Rbp-jl, appelé PTF1-L, qui va gouverner le programme transcriptionnel permettant la mise en place du phénotype acineux : il active notamment l’expression de l’ensemble des enzymes digestives et des protéines nécessaires à l’exocytose des granules de zymogène [Masui et al. 200733 _{; Rose et al. 2001}34_{]. Nr5a2, une cible transcriptionnelle de Ptf1a, coopère avec PTF1-L}

dans l’activation des gènes nécessaires à la mise en place du phénotype acineux [Holmstrom et al. 201135_{]. Ptf1a est ainsi le facteur majeur synchronisant le programme transcriptionnel}

acineux. Cependant, il n’est pas suffisant pour induire cette différenciation puisque l’expression ectopique de Ptf1a dans les cellules Pdx1+ ne permet pas une différenciation prématurée du compartiment acineux, mais bloque le développement des précurseurs du tronc [Schaffer 201032_{]. Cela suggère que l’inhibition de la différenciation des précurseurs du tronc est}

essentielle à la mise en place du programme de différenciation acineuses. Un autre facteur de transcription, Mist1, pourrait permettre la différenciation terminale de la lignée acineuse. En effet, son expression est indépendante de Ptf1a/PTF1-L [Masui et al. 201036_{], et son absence}

entraîne le développement de cellules acineuses peu différenciées, avec un défaut de polarité et une incapacité à exocyter les granules de zymogènes [Pin et al. 200137_{]. Le processus de}

différenciation acineuse se termine à E15.5 environ (Fig. 3). S’ensuit une étape fondamentale d’expansion du compartiment acineux grâce à la prolifération des cellules acineuses jusqu’à ce que la taille finale de l’organe soit atteinte. Les mécanismes moléculaires responsables de cette expansion sont mal connus. En effet, alors que les cellules acineuses matures expriment toujours Ptf1a et Mist1, ces deux facteurs restreignent l’expansion du tissu acinaire [Jia et al. 200838 _{; Rodolosse et al. 2004}39_{]. Parmi les candidats pouvant promouvoir la prolifération des}

cellules acineuses, on trouve Nr5a2 [Benod et al. 201140 _{; Botrugno et al. 2004}41_{], c-myc [Bonal}

et al. 200942 _{; Nakhai et al. 2008}43_{] et E-catenin [Murtaugh et al. 2005}44 _{; Wells et al. 2007}45_].

Les cellules acineuses matures expriment les marqueurs Ptf1a et Mist1 et les enzymes Cpa-1, Ela-1 et Amylase (Fig. 3).

c) Ségrégation des progéniteurs canalaires et endocrines

A l’issu de la ségrégation entre les deux types de précurseurs (E12.5), les progéniteurs du tronc sont engagés dans un programme de différenciation leur permettant de générer les lignées canalaires et endocrines. Une première étape de morphogénèse permet aux progéniteurs du tronc de s’organiser en tubules hiérarchisés au sein de l’organe bourgeonnant, appelés canaux

30 primitifs [Hick et al. 200946_{, Kesavan et al. 2009}47_{, Villasenor et al. 2010}48_{]. Ce processus de}

tubulogénèse implique d’abord l’acquisition d’une polarité des progéniteurs du tronc grâce à la voie Rho-GTPase. Cette nouvelle polarité confère aux futures cellules canalaires la capacité de former un lumen au pôle apical, formant une structure appelée rosette. La fusion de ces rosettes en un plexus luminal permet à la structure tubulaire de se former (Fig. 3 - E12.5, Fig. 4). La croissance et la hiérarchisation de l’arbre canalaire est dirigée par la division des progéniteurs apicaux [Puri et Hebrok 200749_{], elle-même sous l’influence de facteurs sécrétés par le}

mésenchyme environnant [Li et al. 200450_{]. Ces canaux primitifs constituent l’épithélium qui}

génère l’ensemble des cellules endocrines (en plus des cellules canalaires) [Hick et al. 200946_,

Kopp et al. 201151_{] (Fig 3, cellules Ngn3+ migrant depuis le canaux primitifs). Alors que la}

majorité des facteurs de transcription exprimés dans les progéniteurs du tronc, tels que Sox9, Hes1, Hnf1E sont conservés au sein des cellules canalaires, ils sont exclus des progéniteurs endocrines [Shih et al. 20133 _{; Pan et Wright 2011}2_{]. En effet, au cours de la transition}

secondaire, une sous-population de cellules des canaux primitifs acquière l’expression du facteur de transcription Ngn3 (Neurogenin 3), élément initial primordial dans la différenciation de la lignée endocrine. D’un point de vue mécanistique, le niveau d’activation de la voie Notch semble ici encore avoir une fonction essentielle. En effet, une forte activation de cette voie permet l’activation transcriptionnelle de Sox9 et Hes1, permettant une répression transcriptionnelle de Ngn3 et une dégradation de la protéine correspondante. A l’inverse, une faible activation de la voie Notch n’autorise l’expression que de Sox9, et la transcription de Ngn3 est alors possible [Shih et al. 201252_{] (Fig 3, E15.5, maintien de Hes1 dans les}

progéniteurs canalaires). Cependant, le mécanisme sous-jacent à l’activation différentielle de la voie Notch dans une sous-population minoritaire des canaux primitifs n’est pas connu.

31 Figure 4 : Formation de l’arbre canalaire au cours de l’organogénèse pancréatique chez la souris. On voit que les lumières secondaires apparaissant à e11.5 fusionnent plus tard pour former l’arbre canalaire pancréatique (d’après Hick et al. 200946_).

d) Différenciation de la lignée endocrine

Les précurseurs Ngn3+ sont capables de générer l’ensemble du panel des cellules endocrines générant du glucagon (α-cells), de l’insulin (β-cells), de la somatostatin (δ-cells,) et du pancreatic polypeptide (PP-cells), et de la ghrelin (ε-cells), même si les progéniteurs Ngn3+

deviennent très vite unipotents [Desgraz & Herrera 200953_{]. Les progéniteurs endocrines}

migrent depuis les canaux primitifs pour coloniser le tissu stromal environnant [Gouzi et al. 201154_{, Miyatsuka et al. 2011}55_{] où ils formeront les ilôts de Langherans (Fig 3, cellules Ngn3}+

migrant depuis les canaux primitifs). Cette migration implique un processus de transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) peu après la différenciation en précurseur endocrine [Rukstalis et al. 200756_{]. Le tissu stromal, quant à lui, sera remplacé progressivement par le}

tissu acineux en expansion.

Le processus de différenciation des différents types cellulaires endocrine se fait via l’activation de différentes combinaisons de facteurs de transcription. Par exemple, Pax4 (Paired

32 Box 4), Pdx1 et Nkx6.1 sont déterminants pour la différenciation en cellules E, puisque des expériences de gain de fonction de ces facteurs de transcription dans les cellules progénitrices favorise la différenciation du compartiment E>Collombat et al. 200957 _{; Schaffer et al. 2010}32 _;

Yang et al. 201158_{@. La protéine ARX (Aristaless Related homeobox) quant à elle est essentielle}

à la différenciation des cellules progénitrices en cellules D>Collombat et al. 200759_@.

Cependant, l’activation de ces facteurs de transcription plus tardivement au cours de la transition secondaire ne permet pas aux cellules déjà engagées dans une différenciation de modifier leur « chemin » de différenciation [Schaffer et al. 201032 _{; Yang et al. 2011}58_],

indiquant que la régulation spatio-temporelle de l’activation de ces gènes est primordiale à la mise en place des différentes populations cellulaires.

.

C) DYSFONCTIONNEMENTS DU PANCREAS EXOCRINE

1) Quelle plasticité pour le pancréas ?

L’homéostasie peut s’appliquer aussi bien à un organe sain qu’à un organe pathologique. Lorsque l’organe est endommagé, il y a rupture de l’homéostasie physiologique (équilibre stable). Se met alors en place une homéostasie transitoire pathologique (équilibre instable) pour revenir à l’équilibre physiologique (Fig. 5). C’est le processus de « cicatrisation » ou de régénération qui commence. Afin de régénérer un organe, plusieurs mécanismes de réparation cellulaire existent : prolifération du type cellulaire manquant à partir du réservoir de cellules existant, prolifération et différenciation de cellules souches ou progéniteurs, et conversion d’un type cellulaire existant vers le type cellulaire manquant. On comprend que dans tous les cas, une grande plasticité cellulaire est nécessaire. Le terme de plasticité est entendu ici comme défini par Mills et al. (201560_{), c’est-à-dire la capacité d’une cellule différenciée de moduler}

son état de différenciation et d’acquérir certaines caractéristiques d’une autre lignée cellulaire. Cette plasticité permet à la cellule de résister à un stress soutenu, d’éviter la mort cellulaire et donc de contribuer au retour à l’homéostasie pour l’organe. Nous nous intéresserons non seulement à la plasticité du compartiment exocrine, mais aussi à celle du compartiment endocrine. L’idée est, en étant relativement exhaustif, de permettre une vision intégrée de la plasticité du pancréas et de mettre en évidence des procédés communs.

33 Figure 5 : Vision proposée de l’évolution de l’homéostasie au cours des pathologies pancréatiques

a) Digression sur la régénération du compartiment endocrine face au diabète

Alors que nous nous intéresserons par la suite exclusivement au compartiment exocrine, il est intéressant de mentionner la plasticité du compartiment endocrine, afin de faire ressortir dans un second temps des mécanismes communs permettant le contrôle de l’homéostasie. La compréhension des mécanismes de régénération du compartiment endocrine présente un intérêt majeur pour la mise en place de nouvelles thérapies contre le diabète. Le diabète correspond dans la majeure partie des cas à une perte physique ou fonctionnelle des cellules E productrices d’insuline, seule hormone hypoglycémiante. On distingue deux types de diabète : le diabète de type 1 correspond à une réaction auto-immune à l’encontre des cellules E, et le diabète de type 2 correspond à insulino-résistance acquise. Dans tous les cas, une insuffisance dans le système de régulation de la glycémie par l’insuline en est la conséquence fonctionnelle.

Comprendre comment les cellules pancréatiques fonctionnelles (cellules acineuses, canalaires, et endocrine non E peuvent se transdifférencier en cellules E fonctionnelles ouvrirait la voie à des thérapies moléculaires et cellulaires innovantes dans le cadre du diabète. Cinq hypothèses majeures ont été proposées : 1) régénération par réplication des cellules E préexistantes (Fig. 6A); 2) régénération par inter-conversion depuis d’autres cellules endocrines en cellules E(Fig. 6B) 3) néogénèse de cellules E à partir des canaux (Fig. 6C) ; 4) Transdifférenciation de cellules acineuses en cellules E (Fig. 6D) 5) Existence de cellules souches multipotentes à l’âge adulte, [Pan et Wright 20112 _{; Migliorini et al. 2016}61_{] (Fig. 6E).}

34 Ces différentes hypothèses ne sont pas mutuellement exclusives, et peuvent même d’ailleurs être complémentaires.

Figure 6 : Les différents mécanismes cellulaires de régénération du compartiment endocrine. Le compartiment endocrine peut se régénérer à partir des cellules E (A), des cellules D (B), et de cellules souches pluripotentes adultes (E). Les cellules canalaires peuvent entamer une reconversion endocrine mais la différenciation reste incomplète (C). Quant aux cellules acineuses, aucune donnée ne démontre leur participation à la régénération du compartiment endocrine (E).

35 Alors que le taux de renouvellement des cellules E d’un pancréas sain est très faible [Teta et al. 200562_{], la combinaison des techniques de pulse-chase et de traçage de lignée ont permis de}

mettre en évidence que, aussi bien en condition normale qu’en condition de stress, la régénération des cellules E se fait exclusivement par auto-renouvellement à partir de cellules E préexistantes [Dor et al. 200463 _{; Teta et al. 2007}64_{]. Cependant, les cellules E constituent une}

population hétérogène, et seule certaines sous-populations sont capables de réplication [Bader et al. 201665_{]. Il faut d’ailleurs nuancer ces études avec les travaux de Talchai et al. [2012}66_]

qui montrent que les cellules E sont dans un état dédifférencié dans des conditions diabétiques, et que ces cellules dédifférenciées sont capable de se redifférencier en cellules E compétentes (Fig. 6).

De manière intéressante, alors que la duplication des cellules E est toujours le mécanisme exclusif de régénération du compartiment E lorsque 95% de ces cellules sont détruites, on observe une conversion des cellules D en cellules E lorsque 99% du compartiment endocrine est éliminé [Thorel et al. 201067_{]. Bien que la raison de cette différence reste inconnue, il est}

intéressant d’imaginer qu’un système de contrôle du nombre de cellules E est en place, permettant de maintenir un réservoir de cellules suffisant à partir duquel la régénération peut se faire par réplication. Les mécanismes d’inter-conversion endocrine sont susceptibles de varier en fonction de l’âge, puisque qu’une trans-différenciation de cellules G en cellules E semble responsable de la régénération du compartiment E avant la puberté [Chera et al. 201468_{]. Reste}

à comprendre l’avantage sélectif d’un tel mécanisme de régénération.

Des expériences de traçage de lignage cellulaire in vivo ont montré que des cellules canalaires matures exprimant Hnf1E ne sont pas à l’origine de nouvelles cellules E après destruction du compartiment endocrine (par ligation du canal pancréatique et destruction chimique EGF/gastrin) [Solar et al. 200922_{]. De la même manière, consécutivement à une lésion}

du pancréas, une partie des cellules Sox9+ réexpriment Ngn3 mais échouent dans l’établissement de nouvelles cellules endocrines matures [Kopp et al. 201151_{] (Fig. 6). A}

l’inverse, d’autres études ont identifié des cellules progénitrices longeant les canaux capables de réexprimer Ngn3 et l’insuline lorsque la masse cellulaire E est détruite [Xu et al. 200869 _;

Al-Hasani et al. 201370_].

Quant au compartiment acineux, le plus abondant dans le pancréas, il présente évidemment un grand intérêt dans l’optique de thérapies cellulaires pour le diabète. Cependant, toutes les études publiées à ce jour montrent que, quel que soit le type de dommage causé au pancréas,

36 les cellules acineuses ne participent pas à la régénération du compartiment endocrine lors de la réparation du tissu [Desai et al. 200771 _{; Blaine et al. 2010}72_{]. En revanche, il est possible de}

forcer la reprogrammation des cellules acineuses en cellules endocrines de type E [Zhou et al. 200873_].

Enfin, l’existence de sous-population de cellules souches multipotentes au sein des îlots de Langerhans, capable de générer de novo des cellules E, a été mise en évidence [Smukler et al. 201174_].

Il est important de noter qu’un traitement immunosuppresseur dans un modèle de souris diabétique inhibe la régénération du compartiment E, suggérant une importance du système immunitaire dans le retour à la normal des fonctions endocrines [Nir et al. 200775_].

Ainsi dans des conditions pathologiques, la source majoritaire pour la régénération des cellules E est le réservoir de cellules E restant après le dommage subi par l’organe, les autres types cellulaires pancréatiques n’intervenant que dans des conditions extrêmes. Cependant, cela n’empêche pas le développement de stratégies de thérapie cellulaire permettant de dédifférencier in vitro des cellules progénitrices ou des cellules acinaires en cellules E [Jennings et al. 20155 _{; Puri et al. 2014}76_].

b) Régénération du compartiment exocrine face à la pancréatite

Comme nous l’avons vu précédemment, le pancréas produit en abondance des enzymes digestives. Le moindre dysfonctionnement du compartiment exocrine peut donc mener à une sécrétion excessive et délocalisée ces enzymes, menant à une autodigestion du pancréas et de son environnement (en témoigne la gravité des fistules pancréatiques). Il est donc d’une importance primordiale pour le pancréas exocrine d’être doté d’une plasticité lui permettant de se régénérer rapidement.

Considérations cliniques

D’un point de vue clinique, la régénération du compartiment exocrine est observée dans des cas de pancréatite. Il existe deux types de pancréatites : aigüe et chronique.

Des douleurs abdominales et des nausées sont symptomatiques de la pancréatite aigüe. Le diagnostic différentiel de la pancréatite aigüe avec d’autres pathologies gastro-intestinales peut être fait grâce à la détection dans le sang d’enzymes digestives pancréatiques telles que la lipase ou l’amylase [Murtaugh et al. 201577_{]. En effet, au cours d’une pancréatite aigüe, les cellules}

37 acineuses du pancréas sécrètent en quantité anormale les enzymes digestives. Même si la plupart des cas sont bénins, la présence de tissu nécrotique au sein du pancréas est de très mauvais pronostic. Cela s’associe à un dysfonctionnement général de nombreux organes et entraîne le décès du patient. Une des causes principales de la pancréatite aigüe est la présence de calculs biliaires (le canal de Wirsung rejoint les canaux biliaires au niveau du duodénum). Mais d’autres stress externes comme une intoxication, un empoisonnement, ou une forte prise d’alcool peuvent également en être à l’origine.

La pancréatite chronique, quant à elle, est principalement associée à l’alcoolisme. Elle est également caractérisée par des douleurs abdominales mais les enzymes digestives sont absentes de la circulation. La pancréatite chronique peut être vue comme l’évolution d’une pancréatite aigüe qui ne s’est pas résorbée [Murtaugh et al. 201577_{]. En effet, sous l’influence de différents}

stress extérieurs (comme l’alcool), les enzymes digestives sont sécrétées en quantité trop abondante sur une longue période, entraînant une autodigestion de l’organe qui s’accompagne de nécrose et d’inflammation (phase aigüe), et le prolongement de ce stress fait évoluer l’inflammation en fibrose (phase chronique) [Dawra et al. 201178_{]. Consécutivement, une}

destruction massive du parenchyme acineux conduit à une absence de sécrétion d’enzymes digestives.

Les enzymes digestives pancréatiques sont au cœur de la problématique de la pancréatite. La majeure partie des mutations prédisposant à la pancréatite concernent les gènes codant pour les enzymes digestives (PRSS1 pour Protéase Serine 1, CTRC pour Chymotrypsin C) ou leurs inhibiteurs (SPINK1 pour Serine Peptidase Inhibitor Kazal type 1) [Whitcomb et al. 201379_].

Aucun traitement n’est disponible à ce jour, les inhibiteurs de trypsine et autres protéases n’ayant aucun effet [Singh et al. 200580_{]. Cependant, de récentes observations montrent que le}

stress du réticulum endoplasmique des cellules acineuses pourrait être le point de départ du dysfonctionnement des cellules acineuses, ce qui ouvre la voie à de nouvelles opportunités thérapeutiques [Logsdon et al. 201381_{]. Il existe des cas familiaux de pancréatite chronique,}

pour lesquels on retrouve des mutations dans des gènes tels que PRSS1 ou SPINK1 [Ryan et al. 201482_].

L’étude du phénomène de régénération du compartiment exocrine est particulièrement compliquée chez l’homme. La chirurgie est devenue très rare dans le cadre de la pancréatite, puisque seuls certains patients ayant développé une pancréatite nécrotique sont éligibles à une résection chirurgicale de la partie nécrotique. Le phénomène de régénération doit alors être extrapolé à partir des pancréas prélevés post-mortem, c’est-à-dire à partir d’organes ayant