Effet du TGF E sur la cellule cancéreuse

Nous nous intéresserons dans ce paragraphe à l’effet que le TGFE peut avoir sur la cellule cancéreuse épithéliale. De nombreuses études décrites ci-après basent leur conclusion sur des expériences d’inactivation de SMAD4. Cependant, il est nécessaire de rappeler que la perte de SMAD4 peut aussi affecter la signalisation des Activines et BMPs qui sont importantes pour le processus métastatique dans d’autres types de tumeurs comme le mélanome, le cancer de la prostate ou du sein [Yachida et al. 2013442].

a) Cytostasie et apoptose

Le TGFE est connu pour son effet cytostatique sur les cellules non-néoplasiques (voir paragraphe II)E)4)). Cet arrêt du cycle cellulaire est aussi observé chez les cellules tumorales au début de la tumorigénèse.

120 Il a été démontré que le SMAD4 activé par le TGFE était capable d’activer la transcription de cibles telles que p21 et p15/Ink4B, deux kinases dépendantes des cyclines (CDKs) essentielles à l’arrêt du cycle cellulaire en phase G1 afin que le point de contrôle puisse se faire [Grau et al. 1997443 ; Dai et al. 1999a444 ; Peng et al. 2002445]. La régulation de p21 par SMAD4 est indépendante de p53 [Datto et al. 1995389]. TGFE inhibe également l’expression de CDK4 et stabilise Rb (Retinoblastoma), ce qui entraîne un arrêt du cycle cellulaire [Ewen et al. 1993446]. L’activation de p21, p15, et CDK4 par le TGFE peut aussi se faire via la répression transcriptionnelle directe de l’oncogène c-myc par SMAD4 [Warner et al. 1999447]. C-myc est capable de se fixer sur les promoteurs de p21, p15, et CDK4 et de réprimer leur transcription. Ces mécanismes sont observés dans de nombreux types cellulaires différents [Massagué et al. 2008448] et en particulier dans les cellules pancréatiques [Schniewind et al. 2007449, Knudsen et al. 2016425 ; Ying et al. 2016450]. Dans ces conditions, la perte de SMAD4 résulte en la perte de l’inhibition de la prolifération cellulaire, à cause de la perte de l’expression de p21 et p15. Le TGFE peut également inhiber la croissance cellulaire indépendamment de SMAD4 [Dai et al. 1999b451], notamment via déphosphorylation de S6K par PP2A [Derynck et al. 2003333].

Le TGFE est capable d’induire l’apoptose des cellules tumorales dans certaines conditions, via des voies dépendantes et indépendantes des SMADs. TGFE peut induire la formation du complexe de transcription Rb/E2F4 suite à l’activation de SMAD2 et SMAD3, menant ainsi à l’apoptose de cellules tumorales prostatiques [Yang et al. 2008452]. Les SMADs activent la transcription de TIEG1 (TGFE-Inducible-Early-responsive-Gene 1) dans de nombreuses cellules épithéliales, et de DAPK (Death Associated Protein Kinase) dans des cellules tumorales hépatiques [Siegel et al. 2003395]. Le TGFE peut également directement réguler les acteurs directs des voies apoptotiques via les SMADs, comme les protéines de la famille Bcl2, XIAP (X inhibitors of apoptosis protein) ou Bad, comme observé dans des cellules tumorales du sein et de la prostate [Sanchez-Capelo 2005453 ; Principe et al. 2014405]. L’activation de BIK et la répression de Bcl-XL par le TGFE est aussi impliquée dans l’induction de l’apoptose par le TGFE dans le lymphome de Burkitt [Spender et al. 2009454]. Bim est quant à lui le médiateur de l’apoptose induite par TGFE dans les adénomes intestinaux [Wiener et al. 2014455]. Il a été décrit récemment que la TEM induite va l’activation des SMADs dans des cellules d’ADKP pouvait entraîner l’apoptose via la coopération de SMAD2/3/4 et SNAIL au niveau transcriptionnel [David et al. 2016322].

121 Indépendamment des SMADs, le TGFE induit l’apoptose via l’activation des voies JNK et p38 dans de nombreux types cellulaires, non transformés ou tumoraux [Sanchez-Capelo 2005453]. Par exemple, l’activation par le TGFE de la voie TRAF6/TAK1/JNK/p38 régule l’apoptose induite par TGFE dans des cellules de cancer de la prostate [Sorrentino et al. 2008339]. De manière intéressante, cette activation est indépendante de l’activité kinase de TERI, ce qui suggère une régulation différentielle possible entre la voie TRAF6 et celle des SMADs. La protéine adaptatrice DAXX, qui intéragit avec TERII, fait également le lien entre la signalisation TGFE et les mécanismes apoptotiques dans des cellules B de lymphomes, via l’activation de la voie JNK [Perlman et al. 2001397]. Le TGFE peut également déclencher l’apoptose de cellules du cancer du côlon via l’inhibition de la voie PI3K/AKT/survivin [Wang et al. 2008456]. Bien que certaines cellules tumorales soient réfractaires à l’apoptose induite par TGFE, l’expression de certaines protéines comme ARTS (Apoptosis Related Protein in the TGFE signaling pathway) est nécessaire à la sensibilisation des cellules à l’apoptose induite par TGFE dans des cellules tumorales prostatiques [Siegel et al. 2003395].

En revanche, il a été montré in vitro que le TGFE pouvait promouvoir la croissance d’oncosphères à partir de cellules d’ADKP négatives pour SMAD4, alors qu’il réduit ce potentiel pour les cellules positives pour SMAD4 [David et al. 2016322]. De manière intéressante, Bardeesy et al. [2006166] ont montré que des cellules d’ADKP murins positifs pour SMAD4 répondaient différemment selon qu’elles provenaient de tumeur modérément différenciées ou de tumeur dédifférenciées. En effet, alors que le TGFE entraîne l’arrêt du cycle cellulaire et la mort des cellules de tumeurs différenciées, le même traitement sur les cellules SMAD4 positives issues de tumeurs dédifférenciées résultait en une augmentation de leur prolifération. Au-delà du statut de SMAD4, l’état de différenciation de la cellule épithéliale est donc aussi à prendre en compte dans l’évaluation du rôle du TGFE dans la carcinogénèse.

b) TEM

La TEM, processus physiologique essentiel à l’embryogénèse, est un mécanisme adopté par les cellules cancéreuses et leur permettant de migrer et de promouvoir la dissémination métastatique. Comme nous l’avons vu plus haut, le TGFE peut induire la TEM via les voies de signalisation SMAD4-dépendantes et SMAD4-indépendantes. Il est couramment admis que l’activation de la TEM par le TGFE est un évènement tardif au cours de la tumorigénèse [Moustakas et Heldin 2007457 ; Heldin et al. 2009458]. L’activation des SMADs par le TGFE permet l’activation transcriptionnelle de facteurs embryonnaires gouvernant le processus de

122 TEM comme SNAIL, à l’origine de la baisse d’expression des gènes épithéliaux et de l’expression des gènes mésenchymateux [Heldin et al. 2009458]. Les voies indépendantes des SMADs peuvent également contribuer au phénotype de TEM, via les voies ERK, PI3K, p38, JNK, RhoA comme décrit précédemment [Derynck et al. 2003333] (Fig. 25). Par exemple, la TEM induite par le TGFE peut être inhibée par l’inhibiteur de MEK1 dans des cellules d’ADKP [Ellenrieder et al. 2001459]. De plus, le TGFE peut stimuler l’expression du facteur de transcription embryonnaire SNAIL non seulement via l’activation des SMADs, mais aussi de la voie RAS/ERK, des voies PI3K et Wnt, ainsi que via la voie TAK1/NKNB [Principe et al. 2014405]. Alors que l’activation de la voie RhoA permet la régulation des jonctions serrées et la perte d’adhérence, la voie PI3K/AKT/mTor permet de réguler la synthèse protéique et le métabolisme de la cellule cancéreuse. La voie NFNB permet également de donner un signal de survie aux cellules. De plus, il a été montré la capacité du TGFE à induire la TEM indépendamment de SMAD4 pouvait dépendre du statut de protéines de la famille p53. En effet, la perte d’expression de la protéine TAp73 (Transcriptionnally Active p73) dans un modèle de GEMM développant des ADKP accélère la progression tumorale et induit la TEM via les voies TGFE indépendantes de SMAD4 [Thakur et al. 2016441].

Il reste à démontrer si ces voies de signalisation peuvent être activées en parallèle ou si elles sont mutuellement exclusives. L’activation de ces voies simultanément pourrait permettre à la cellule, via un seul signal (TGFE), de mobiliser toutes les ressources nécessaires à la mise en place de la reconversion transcriptionnelle et phénotypique correspondant à la TEM. Cela peut également permettre la mise en place de configurations de facteurs de transcription qui régulent les différentes fonctions de la voie de signalisation TGFE [Massagué et al. 2012315].

Il est intéressant de rappeler qu’une dissémination métastatique étendue de la tumeur pancréatique humaine est associée avec une perte d’expression de SMAD4 [Iacobuzio-Donahue et al. 2009429]. Le groupe du Dr. Hingorani a récemment proposé une explication à cette observation [Whittle et al. 2015439]. Ils ont généré des animaux Pdx-Cre ; LSL-KRASG12 ; LSL-TP53R172H ; SMAD4+/lox (KPDC) et Pdx-Cre ; KRASG12 ; LSL-TP53R172H ; SMAD4lox/lox (KPDDC). Les animaux KPDC présentent une tumeur qui prolifère plus rapidement que les souris KPC, mais sans engendrer de métastase. Lorsque le dernier allèle sauvage de SMAD4 est perdu dans ce contexte, ou lors de l’évolution de la tumorigénèse des souris KPDDC, la tumeur croît encore plus rapidement et développe autant de métastases que les souris KPC. Les auteurs ont corrélé le potentiel métastatique avec le niveau d’expression de

123 RUNX3, qui est élevé dans les souris KPC et KPDDC, et bas dans les souris KPDC. Cependant, le mécanisme de régulation de l’expression de Runx3 reste inconnu. Il sera intéressant de déterminer si ce mécanisme est dépendant des voies TGFE indépendantes de SMAD4 ou s’il est totalement indépendant de la signalisation TGFE.

L’étude montre également que, en dépit de la capacité des cellules issues de tumeurs KPDDC à former des métastases, elles sont réfractaires à la TEM induite par le TGFE en termes de morphologie et de modifications transcriptionnelles. Cela mène donc à remettre en question la relation TEM/métastase [Whittle et al. 2015b460]. Il y a en effet de plus en plus de travaux suggérant que la capacité de cellules tumorales à réaliser une TEM n’est pas une garantie de leur potentiel métastatique, l’inverse étant également vrai. Il est par exemple possible que des cellules migrent en groupe sans que le processus de TEM n’intervienne. Une fois dans la circulation, il est intuitif de comprendre que ces groupes de cellules ont davantage de probabilité d’être bloquées dans les capillaires terminaux et de coloniser l’organe hôte de la métastase. Ce domaine reste très débattu et de nouvelles études sont nécessaires à l’évaluation du potentiel pathologique de ces groupes de cellules circulantes. La TEM, si elle ne mène pas toujours à un phénotype métastatique, peut en revanche déboucher sur l’induction cellules souches cancéreuses [Mani et al. 2008461]. Le TGFE permet l’induction de cellules cancéreuses mammaires CD144Hi/CD24low dotées d’un fort de potentiel de formation de mammosphères. De même, des cellules souches cancéreuses hépatiques CD133+ apparaissent après traitement au TGFE, et correspondent à des cellules résistantes à l’apoptose induite par le TGFE [Principe et al. 2014405].

L’arrêt du cycle cellulaire et la TEM induits par le TGFE sont deux fonctions complémentaires. En effet, ce sont des processus synchronisés puisque l’arrêt du cycle cellulaire est nécessaire à la migration des cellules [Heldin et al. 2009458]. La voie de signalisation TGFE est capable d’inhiber la prolifération des cellules tumorales pancréatiques et de promouvoir leur migration en même temps [Schniewind et al. 2007449] (Fig. 29A).

c) Induction et maintien des cellules souches cancéreuses

La TEM, si elle ne mène pas toujours à un phénotype métastatique, peut en revanche déboucher sur l’induction cellules souches cancéreuses [Scheel et al. 2012462]. Le TGFbeta permet l’induction de cellules cancéreuses mammaires CD44Hi/CD24low dotées d’un fort de potentiel de formation de mammosphères [Mani et al. 2008461]. La TEM contrôle également le

124 maintien de cellules souches mammaires non transformées, mais via un programme transcriptionnel différent du programme de TEM mis en place au sein des cellules souches tumorales [Ye et al. 2015463]. De même, des cellules souches cancéreuses hépatiques CD133+ apparaissent après traitement au TGFE, et correspondent à des cellules résistantes à l’apoptose induite par le TGFE [Principe et al. 2014405]. Dans le cadre du gliome, la voie de signalisation TGFEa-Sox4-Sox2 induit les cellules souches initiant le gliome [Ikushima et al. 2009464].

d) Aiguillage de la voie de signalisation TGFE vers une fonction « suppresseur de tumeur » ou « pro-tumorale »

Bien que la voie TGFE dépendante de SMAD4 soit davantage impliquée dans les fonctions « suppresseur de tumeur » du TGFE et que les voies SMAD4 indépendantes soient associées aux effets pro-tumoraux de cette cytokine, il est clair que l’on ne peut pas restreindre la fonction duelle du TGFE à cette dichotomie.

SMAD4 a pour cibles transcriptionnelles des gènes aux fonctions variées et entièrement dépendantes de SMAD4 [Zhou et al. 1998465 ; Zawel et al. 1998466 ; David et al. 2016322]. Il contrôle la régulation de gènes à l’origine non seulement de l’inhibition de la croissance cellulaire mais aussi de la migration cellulaire. Les gènes régulés par TGFE indépendamment de SMAD4 sont quant à eux impliqués dans la TEM et des programmes de facteurs de transcription dont les fonctions ne sont pas encore connues avec précision [Levy et al. 2005467] (Fig. 29A).

Tout d’abord le complexe SMAD2/3 est capable de se lier à l’ADN sans SMAD4 (Dupont et al. 2005440 ; David et al. 2016322] et peut activer un programme transcriptionnel favorisant la progression tumorale. De manière originale, le mutant R172H (ou R175H) de P53 peut se fixer au domaine MH2 de SMAD3, interrompt l’interaction entre SMAD2/3 et SMAD4, mais potentialise l’activation de certains gènes de la TEM comme SLUG [Ji et al. 2015468]. Ce complexe p53R175H-SMAD2/3, dans des cellules d’ADKP, est aussi capable d’inhiber la transcription de p63, un facteur de transcription qui réprime un ensemble de gènes métastatiques. La formation de ce complexe requiert l’activation oncogénique de RAS pour se former [Adorno et al. 2009469]. Ainsi l’induction de la TEM par la voie TGFE-SMADs opèrerait via le mutant p53 dans un contexte Kras activé, ce qui correspond à l’environnement génétique d’une partie des patients atteints d’ADKP. Déterminer la sous-population de patients portant la

125 mutation KrasG12D, le mutant TP53R172H et les allèles de SMAD4 intact permettrait peut-être d’adopter une nouvelle stratégie thérapeutique. Par ailleurs, il faut distinguer les différents types d’altérations de p53 rencontrées dans le cadre du cancer du pancréas. En contradiction avec les résultats précédents, les mutations faux-sens de TP53 sont davantage associées à une perte de SMAD4 alors que les mutations non-sens de TP53 sont associées à un des allèles SMAD4 intacts. Ceci suggère que la perte de SMAD4 pourrait permettre d’éliminer la cytostasie résiduelle potentiellement induite par les mutants p53 [Yachida et al. 2013442]. Ceci corrèlerait avec le rôle moteur de la mutation TP53R172H dans la dissémination métastatique alors que l’inactivation complète de TP53 en combinaison avec KRASG12D ne conduit à aucune métastase [Morton et al. 2010470, Weissmueller et al. 2014471], ainsi qu’avec le pronostic sévère des patients négatifs pour SMAD4 [Iacobuzio-Donahue et al. 2009429]. Il serait ainsi possible de définir différentes sous-populations de patients selon le statut génétique de p53 et SMAD4, auxquelles correspondent différentes fonctions du TGFE sur les cellules épithéliales tumorales. Cette première stratification nécessite d’avantage d’analyse pour pouvoir être transférée au niveau clinique. Il est intéressant de faire le parallèle entre p53 et p73, un membre de la famille p53, puisque l’inactivation de l’isoforme TAp73 dans le cadre de l’ADKP favorise la TEM induite par les voies TGFE indépendantes de SMAD4.

Deuxièmement, différents facteurs de transcription présents à un instant t dans le noyau peuvent coopérer avec les SMADs, que ce soit avec ou sans SMAD4. Etant donné les coopérations de la voie TGFE au niveau transcriptionnel (décrites en II)C)3) et II)C)4), Fig. 25 et 26), il est raisonnable d’imaginer que certaines configurations de facteurs de transcription orientent la signalisation TGFE vers des fonctions pro-tumorales.

Enfin, d’autres mécanismes permettant au TGFE d’activer ses fonctions oncogéniques, tels que la phosphorylation des SMADs au niveau de la région linker, ou l’induction des NFATs (Nucear Factor of activated-T cells) [Inman et al. 2011472] (Fig. 29B). Une autre hypothèse est que les fonctions oncogéniques du TGFE s’expriment lorsque ses fonctions cytostatiques et/ou apoptotiques sont compromises. Par exemple, l’activation fréquente d’AKT et de Src dans les tumeurs permettrait d’inhiber l’apoptose induite par TGFE via SMAD3 et DAPK (Death Associated Protein Kinase) respectivement [Principe et al. 2014405].

Ainsi, le statut génétique ou transcriptionnel des protéines de la famille p53, la combinaison de facteurs de transcription exprimés à un instant t, et l’inactivation des fonctions cytostatiques

126 et apoptotiques du TGFE semblent être les éléments majeurs de la transition du rôle suppresseur de tumeur du TGFE à celui de promoteur de tumeur (Fig. 29B).

Figure 29 : La dualité de fonction du TGFEE au cours de la carcinogénèse ne se limite pas au statut de SMAD4. A) TGFE régule des ensembles de gènes bien définis en fonction de l’implication de SMAD4 [Levy et Hill 2005467]. B) Le passage du rôle suppresseur de tumeur

127 au rôle promoteur de tumeur du TGFE repose sur de nombreuses modifications génétiques et épigénétiques [Inman et al. 2011472].

e) Effet de la restauration de SMAD4 sur les cellules cancéreuses

Il semble relativement clair que les différentes fonctions du TGFE reposent non seulement sur une combinatoire signalétique impressionnante, mais également sur une balance entre ses différentes voies de signalisation. Il est alors intéressant de voir si la restauration de la voie de signalisation SMAD4 dépendante dans des cellules d’ADKP négatives pour SMAD4 permet de retrouver la fonction cytostatique du TGFE.

La réexpression de SMAD4 dans des cellules d’ADKP négatives pour SMAD4 n’a pas d’effet sur la prolifération mais restaure la migration des cellules in vitro. De manière intéressante, l’absence de SMAD4 sensibilise les cellules à l’inhibition de la migration en ciblant EGFR [Chen et al. 2014473]. A l’inverse il a été montré que la restauration de l’expression de SMAD4 inhibe la croissance tumorale en culture ou en xénogreffes et également leur capacité invasive via l’inhibition de l’expression de ETS-1 [Duda et al. 2003474, Fullerton et al. 2015475]. Enfin, il est important de noter que la réexpression de SMAD4 inhibe également l’anoikis [Ramachandra et al. 2002476].

Ainsi l’effet de la restauration de SMAD4 sur la prolifération et la migration des cellules semble dépendre du type cellulaire utilisé. L’utilisation du système TetON-TetOFF in vivo serait un outil intéressant pour répondre à cette question en respectant davantage les contraintes physiopathologiques.

f) Conclusion sur l’effet du TGFE sur la cellule épithéliale tumorale

En conclusion, le rôle du TGFE sur le compartiment épithélial tumoral, en particulier pancréatique, semble beaucoup dépendre du stade d’évolution de la tumeur, du contexte génétique (statut de SMAD4, p53) et moléculaire des cellules tumorales (combinaisons de facteurs de transcription), mais aussi du cocktail de cytokines présent dans le milieu extra-cellulaire. Récemment, Principe et al. [2016438] ont comparé l’inactivation de la voie de signalisation du TGFE de manière systémique ou ciblée dans le compartiment épithélial pancréatique. Alors que l’inactivation systémique de la signalisation TGFE diminue la progression tumorale, l’inactivation dans le tissu épithélial uniquement favorise le

128 développement de lésions pancréatiques. Il semblerait donc que le rôle pro-tumoral du TGFE réside majoritairement dans son effet sur le stroma abondant dans l’ADKP (Fig. 30)