Les résultats présentés dans le papier montrent que l’activation de la voie de signalisation TGFE perturbe la différenciation des cellules acineuses au cours du développement, et perturbe l’identité acineuse lorsqu’elle est activée chez l’adulte. L’induction en parallèle de l’apoptose des cellules acineuses et d’une métaplasie acino-ductale (ou ADM) mène à la disparition quasi-totale du tissu acineux au profit de structures canalaires typiques d’un pancréas en régénération. Alors que le pancréas des animaux Ptf1a-CreERT2 ; LSL-TERICA se régénère, le pancréas des individus Ptf1a-CreERT2 ; LSL-KRASG12D ; LSL-TERICA développe précocément des lesions pré-néoplasiques de type PanINs. Nous démontrons donc pour la première fois que le TGFE est capable d’accélérer l’apparition de lésions tumorales induites par l’activation de KRAS dans le cadre de la tumorigénèse pancréatique. Cependant, ces travaux soulèvent plusieurs questions auxquelles il faut maintenant tenter d’apporter des réponses.
Premièrement, nous avons montré in vivo et in vitro que le TGFE était capable d’induire une ADM, notamment via l’activation des régulateurs majeurs de ce processus, que sont Sox9 et Hnf1E. Cependant, nos résultats ne permettent pas de savoir si cette activation est directe ou non. Des résultats préliminaires indiquent qu’in vitro, l’activation transcriptionnelle de Sox9 et Hnf1E intervient dès 2h après traitement au TGFE, suggérant une activation transcriptionnelle directe du programme d’ADM. Si ces résultats se confirment, des expériences d’inactivation de la voie canonique du TGFE, via des stratégies d’interférence à ARN (shSMAD4) permettront dans un premier temps de déterminer l’implication de la voie canonique ou des voies indépendantes de SMAD4 dans le processus d’ADM. Une immuno-précipitation de chromatine en utilisant des anticorps ciblant SMAD2/3 permettra d’identifier ou non le potentiel du complexe SMAD2/3 pour la fixation des promoteurs de Sox9 et Hnf1E. Il est également connu que le TGFE inhibe la transcription de c-myc, participant à l’effet cytostatique de la voie du TGFE. Mais c-myc est également un facteur de transcription primordial (voir paragraphe I-A) de l’embryogénèse pancréatique, en particulier de la mise en place du compartiment acineux [Shih et al. 20133 ; Bonal et al. 200942]. Des résultats préliminaires semblent indiquer que l’expression de c-myc diminue lorsque Kras et TGFE sont activés in vitro dans le modèle de cellules acineuses AR42J. Ceci pourrait contribuer à la perte d’identité des cellules acineuses. Les travaux récents de Liu et al. [2016418], mettent en évidence le rôle de SMAD4 ainsi que des
146 voies JNK et p38 dans l’induction de l’ADM de cellules acineuses humaines par le TGFE in
vitro. Il est possible que l’activation simultanée de plusieurs voies de signalisation par le TGFE soit nécessaire au développement du phénotype. L’utilisation d’inhibiteurs spécifiques de p38 et JNK permettra également de tester l’implication de ces voies dans l’induction de l’ADM par le TGFE. Il faut souligner que la voie RAS, activateur en amont des MAPK, semble être impliquée dans l’induction de l’ADM par le TGFE. En effet son activation est nécessaire à l’activation de l’expression de Sox9 et la répression de Cpa1 et Mist1 par le TGFE, et potentialise la surexpression de Hnf1E et Hes1 par le TGFE. Cependant, nos résultats ne nous permettent pas de déterminer si cet effet potentialisateur est dû à la potentialisation de la voie TGFE comme suggéré pas nos résultats, ou si un processus plus complexe de régulation chromatinienne est en jeu. Des immuno-précipitations de chromatine pour les différents marqueurs de chromatine ouverte ou fermée pourront apporter des éléments de réponse.
Deuxièmement, comme discuté dans le papier, nos résultats montrent la co-existence d’un phénotype d’apoptose et de dédifférenciation lorsque le TGFE est activé dans l’épithélium sain pancréatique. Cela suggère que les cellules qui survivent à la vague apoptotique enclenchent un programme de dédifférenciation de type ADM. De manière intéressante, un parallèle semblable a récemment été observé dans des cellules pancréatiques tumorales [David et al. 2016322]. Les auteurs démontrent que la TEM induite par le TGFE, et notamment l’expression de SNAIL, déclenche un mécanisme pro-apoptotique dans les cellules tumorales pancréatiques positives pour SMAD4. Un complexe SMAD2/SMAD3/SMAD4/SNAIL se fixe sur le promoteur de Klf5 et réprime sa transcription, entraînant le phénotype apoptotique. En l’absence de SMAD4, Klf5 est exprimé et l’apoptose est inhibée. Il serait donc intéressant de déterminer le statut d’expression de SMAD4 dans les cellules rentrant en ADM afin de déterminer si l’échappement à l’apoptose passe par la répression transcriptionnelle de SMAD4. De manière plus générale, la comparaison par analyse transcriptomique du profil d’expression des cellules saines et en ADM permettrait d’orienter la recherche du mécanisme de la mise en place du programme transcriptionnel à l’origine du phénotype ADM/progéniteur.
Etant donné le rôle suppresseur de tumeur décrit pour le TGFE dans le cadre de la tumeur épithélial pancréatique, il apparaît contradictoire de décrire une accélération de la tumorigénèse induite par KRASG12D lorsque la signalisation TGFE est activée de manière cellulaire-autonome dans l’épithélium pancréatique. Des résultats préliminaires suggèrent que l’expression du transgène TERICA pourrait être atténuée lorsque les lésions pancréatiques sont en place (à 2
147 mois et 6 mois après induction au Tamoxifène). Il reste également à déterminer le niveau d’expression des SMADs dans les différentes cohortes. La confirmation d’une baisse d’expression du transgène ou d’un membre de la voie de signalisation pourrait expliquer que les lésions continuent à se développer dans les pancréas d’animaux Ptf1a-CreERT2 ; LSL-KRASG12D ; LSL-TERICA. Cependant, il est aussi possible que les cellules ayant subi l’ADM puis la transformation tumorale induite par KRAS aient développer des mécanismes pour « utiliser » l’activation de la voie de signalisation TGFE, comme l’activation de voies de signalisation annexes coopérant avec le complexe SMAD2/3/4 au niveau transcriptionnel. La génération de cohortes de souris Ptf1a-CreERT2 ; LSL-KRASG12D ; LSL-TERICA ; SMAD4lox/lox permettrait de déterminer in vivo l’implication de la voie canonique dans le phénotype observé, ainsi que d’évaluer l’effet d’une activation de la voie TGFE en l’absence de SMAD4 sur la tumorigénèse pancréatique. Afin de dissocier de manière spatiotemporelle l’activation de KRAS et la modulation de la signalisation TGFE, il faut utiliser le nouveau modèle de recombinase développé par le groupe du Dr. Saur [Schönhuber et al. 2014524] et permettant l’activation de l’oncogène Kras par la recombinase FlpO exprimée sous le contrôle du promoteur Pdx1. La FlpO reconnaît et recombine des sites FRT. Ainsi, la génération de souris Pdx1-FlpO ; FRT-STOP-FRT-KRASG12D ; Sox9-CREERT2 ; LSL-TER1CA permettrait d’activer Kras dans l’ensemble des cellules pancréatiques et la voie de signalisation TGFE de manière inductible dans le compartiment canalaire. Les souris Pdx1-FlpO ; FRT-STOP-FRT-KRASG12D ; Sox9-CREERT2 ; SMAD4lox/lox, quant à elles, permettraient de reproduire fidèlement la séquence mutationnelle observée chez l’homme en inactivant plus tardivement SMAD4 dans les lésions canalaires. Il serait ainsi possible d’activer ou d’inactiver la voie du TGFE dans les lésions PanIN de différents grades.
Les travaux de thèse présentés dans ce manuscrit correspondent à la première étude s’intéressant à l’activation de la voie de signalisation TGFE dans le compartiment épithélial pancréatique. Cependant, cette activation cellule-autonome est restreinte au compartiment épithélial, et n’affecte pas directement le micro-environnement. Afin de se rapprocher d’avantage des conditions physiopathologiques observées chez l’humain, l’idéal serait de faire sécréter le TGFE par les fibroblastes, tout en activant l’oncogène Kras dans le compartiment épithélial pancréatique. Le laboratoire a généré et validé un modèle de souris permettant cela (résultats non publiés). L’expression de la flipase FlpO est placée sous contrôle du promoteur Fsp1, spécifique des fibroblastes, et permet la recombinaison d’une séquence FRT-STOP-FRT placée devant l’ADN complémentaire d’une forme constitutivement active du TGFE
148 (TGFECA) grâce à une mutation l’empêchant de se fixer au LAP (Latency Associated Protein). Ce modèle devrait permettre de compléter les modèles établis à ce jour et préciser le rôle du TGFE dans la carcinogénèse pancréatique.
Conclusion
Le TGFE est omniprésent tout au long de la tumorigénèse pancréatique, depuis les étapes précoces de la tumorigénèse jusqu’à l’ADKP métastatique. Mes travaux de thèse démontrent que la présence précoce et abondante du TGFEE perturbe l’identité des cellules acineuses et créé un terrain fertile à la transformation induite par KRASG12D. Le TGFE participe très certainement à l’immunosuppression précoce observée dès l’apparition des premières PanINs, et soutient en parallèle le tissu fibrotique entourant ces lésions. Il établit donc l’environnement idéal pour le développement de lésions de grades progressifs. Cet environnement persiste au cours de la tumorigénèse et auto-entretient un niveau élevé de TGFE à la manière d’une boucle de rétrocontrôle positive. Lorsque l’expression de SMAD4 est perdue, les cellules néoplasiques de la tumeur primaire prolifèrent sans frein, et les cellules mettent en place des mécanismes moléculaires métastatiques dépendants ou indépendants du TGFE. Bien que ces mécanismes soient mal connus, il se peut qu’une TEM indépendante de SMAD4 ou une dissémination indépendante de la TEM soit à l’origine de ce phénotype agressif. En présence de SMAD4, il est possible que la TEM soit le moyen de dissémination métastatique privilégié et s’avère moins efficace, expliquant la moindre propension des tumeurs positives pour SMAD4 à métastaser. Cependant, il est évident que de nombreux intermédiaires phénotypiques peuvent exister.
Une stratégie visant à inactiver le TGFE permettrait non seulement de restaurer une homéostasie saine du micro-environnement, mais pourrait aussi contribuer à la restauration d’une différenciation acineuse nécessaire à l’homéostasie de l’organe. En effet, des stratégies visant à restaurer une différenciation des cellules tumorales a récemment fait ses preuves dans le cadre du cancer du foie [Fitamant et al. 2015525]. Les premières études cliniques employant une inactivation systémique de la voie du TGFE en oncologie ont montré une très bonne tolérance et peu de toxicité. Cependant, il reste à évaluer l’impact d’une inactivation systémique du TGFE sur le comportement des cellules tumorales en fonction de leur profil génétique et transcriptionnel. Les résultats des essais cliniques en cours devront être analysés avec précaution afin de réorienter la recherche dans ce domaine si besoin.
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