Composition du Jury P

PRÉSIDENT

Philippe Lebrun SECRÉTAIRE

Roland Pochet

MEMBRES FACULTAIRES

Jean-Marie Boeynaems Olivier Pradier

Patrick Robberecht EXPERTS ÉTRANGERS

Geneviève Dupont Emmanuel Hermans

O BJECTIFS

Cette thèse trouve son origine dans les expériences cliniques, menées par Pierre Philippart, au cours desquelles l’os maxillaire de patients édentés a été reconstruit à l’aide d’une "pâte osseuse". Dans cette "pâte" constituée d’os crânien réduit en poudre et de plasma enrichi en plaquettes (PRP), la coagulation a été enclenchée par l’ajout de facteur tissulaire humain recombinant. Des analyses histologiques de l’os ainsi reconstruit ont démontré l’existence d’une ossification dense et la présence de nombreux vaisseaux sanguins.

C’est à partir de ce modèle, illustrant à la fois la coagulation et la signalisation des facteurs de coagulation que nous avons entamé ce travail qui a comporté deux étapes.

Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés au "double effet", coagulant et signalant, des sérines protéases de la voie extrinsèque de la coagulation. Bien que, dans le modèle de la cascade de coagulation, les sérines protéases soient activées successivement, il n’avait pas encore été montré que les cellules sont capables de répondre à ces stimulations successives. De plus, il restait aussi à démontrer que les sérines protéases de la coagulation peuvent être pro-coagulantes et signalantes sur des cellules en mono-couche adhérentes. La première partie de ce travail a donc consisté en l’analyse de la signalisation calcium et l’augmentation de la sécrétion des interleukines 6 (IL-6) et 8 (IL-8) induites dans les HUVEC, des cellules endothéliales humaines de culture primaire, par ajouts successifs des sérines protéases de la coagulation par les zymogènes activés in situ.

En second lieu, nos travaux ont porté sur l’action des sérines protéases dans les cellules SaOS-2, lignée d’ostéosarcomes humains présentant des propriétés ostéoblastiques.

Le but de ces recherches a été d’analyser, par la mesure des variations du calcium intracellulaire, la réponse des cellules SaOS-2 à une stimulation par les sérines protéases de la coagulation. En guise de réponse biologique, nous avons mesuré l’effet de ces sérines protéases sur la survie des cellules SaOS-2 incubées dans un milieu en absence de sérum.

P ^ARTIE I :

I NTRODUCTION

C HAPITRE 1 :

LE FACTEUR TISSULAIRE ET LES SÉRINES PROTÉASES

DE LA COAGULATION

A

-

Les expériences menées au cours de cette thèse portent sur l’effet de sérines protéases de la voie dite "extrinsèque" de la coagulation sur des cellules endothéliales et des ostéosarcomes. Ce chapitre de l’introduction va permettre de décrire les trois sérines protéases utilisées lors des manipulations, à savoir le facteur VII, le facteur X et la thrombine. Bien qu’il ne s’agisse pas, à proprement parler, d’une sérine protéase, le premier point sera consacré au facteur tissulaire, récepteur transmembranaire à l’origine du déclenchement de la cascade de coagulation et dont le rôle dans la signalisation induite par certaines sérines protéases d’intérêt a été montré au cours de la thèse.

1. L E FACTEUR TISSULAIRE

Ce point se base de sur l’article de revue publié dans le Tissue Engineering and Regenerative Medicine Journal (Daubie V, Pochet R, Houard S, Philippart P. Tissue factor : a mini-review. J Tissue Eng Regen Med 2007, 1 : 161-169 – article repris en annexe).

1.1. L

Le facteur tissulaire est aussi appelé facteur III de la coagulation, thromboplastine ou antigène CD142. Les deux symboles utilisés pour le facteur tissulaire sont, principalement, TF (pour « Tissue Factor ») et F3 (pour « Factor III »). Dans ce travail, l’abréviation TF sera régulièrement retenue.

1.2. L

D

Bien que ces notions n’interviennent pas dans le travail de recherche, il m’est apparu essentiel d’introduire la protéine en donnant des informations sur sa localisation génomique, son ARNm et le peptide signal, essentiel à sa localisation transmembranaire.

1.2.1. GÈNE - CHROMOSOME

Chez l’humain, le gène du FACTEUR TISSULAIRE se trouve sur le chromosome 1, en position 1p21-p22, et il n’existe aucune autre copie de ce gène dans le génome humain^[1]. Il est constitué de 12443 paires de bases (chr1 : 94767461-94779903) organisées en 6 exons séparés par 5 introns.

Il est à noter que le gène du facteur V de la coagulation, cofacteur du facteur Xa pour l’activation de la thrombine, est le seul autre gène à se trouver sur le chromosome 1.

Cependant, contrairement au cas d’autres facteurs de coagulation co-localisés sur un même chromosome, il n’existe aucun lien fonctionnel entre ces deux protéines.

1.2.2. ARN MESSAGER – ADN COMPLÉMENTAIRE

L’ADNc du facteur tissulaire a été cloné pour la première fois en 1987, par quatre équipes simultanément[2, 3, 4, 5].

L’ARN messager (ARNm) correspondant est constitué de 2153bp. La séquence codante démarre au nucléotide 124 (AUG) et révèle ainsi un cadre ouvert de lecture de 885bp,

L’ARNm est transcrit en une préprotéine possédant une séquence de tête de 32 acides aminés et une protéine mature de 263 acides aminés. La région codante de l’ARNm est suivie par 1142 nucléotides de la séquence 3’ non codante.

La région 3’ non-codante est riche en AU, caractéristique qui se retrouve dans l’ARN de beaucoup de médiateurs de l’inflammation et qui peut promouvoir une dégradation rapide de ces ARNm^{[4, 6, 7]}.

1.2.3. LE PEPTIDE SIGNAL

La préprotéine du facteur tissulaire possède un peptide signal de 32 acides aminés Cette séquence, même si elle n’a pas la longueur usuelle d’une séquence initiatrice qui fait généralement 15 à 29 acides aminés, présente une structure ressemblant à un peptide signal d’une protéine liée à la membrane ou secrétée^[3].

1.3. L

Le facteur tissulaire existe in vivo sous deux formes : la forme complète, telle que décrite initialement, et une forme tronquée dite "alternativement épissée" (figure 1). Ces deux formes sont décrites ci-dessous car leur expression sera mise en évidence dans la lignée d’ostéosarcomes et elles seront utilisées au cours de certaines manipulations.

En plus de ces formes naturelles, deux types de facteur tissulaire recombinant, le facteur tissulaire soluble (sTF) et le facteur tissulaire tronqué (tTF), ont été utilisés dans les manipulations sur les cellules endothéliales et ostéoblastiques. Si ces molécules se distinguent par une forme tronquée de la protéine (figure 1), la structure restante est identique à celle de la forme complète.

Figure 1. Représentation schématique des différentes formes de facteur tissulaire. Le TF et le asTF sont des formes naturelles produites par les cellules tandis que le sTF et le tTF sont des formes recombinantes produites

par génie génétique^[357]

1.3.1. LE POIDS MOLÉCULAIRE

La protéine déduite de la séquence de l’ARNm présente un poids moléculaire de 29,593kDa^[3], valeur éloignée de celle communément déterminée de 46kDa après migration sur gel d’électrophorèse^[8]. Cette différence peut s’expliquer par la présence de sites de glycosylation "N-linked" probables en position Asn¹¹, Asn¹²⁴, Asn^{137 [2, 5, 9]}. De plus, la séquence de 13 acides aminés en position 160-172 possède 7 acides aminés qui sont soit des sérines, soit des thréonines, indiquant qu’une glycosylation "O-linked" est possible^{[3, 5]}.

1.3.2. LE FACTEUR TISSULAIRE SOUS SA FORME COMPLÈTE

Le facteur tissulaire, dans sa forme mature, est constitué de trois régions : - une région extracellulaire de 219 acides aminés ;

- une région transmembranaire de 23 acides aminés ; - une queue cytoplasmique de 21 acides aminés.

1.3.2.1. Le domaine extracellulaire

Le facteur tissulaire est un membre de la famille des récepteurs aux cytokines de classe II. Son domaine extracellulaire partage des homologies structurelles avec les récepteurs aux interférons α et β^[10].

Le domaine extracellulaire du facteur tissulaire est constitué par deux domaines compacts et présentant la structure d’un domaine fibronectine type III canonique, reliés par un lien polypeptidique unique entre Pro¹⁰² et Asn¹⁰⁷ (figure 2)^{[10, 11]}.

Le facteur tissulaire comporte également cinq résidus cystéines, dont quatre sont extracellulaires^[2] et forment des ponts disulfure (Cys⁴⁹-Cys⁵⁷ et Cys¹⁸⁷-Cys²⁰⁹) (figure 2)^[12]. Il a été démontré que le second pont disulfure est essentiel à l’activité du facteur tissulaire^[13].

Figure 2. Structure « ruban » du domaine extracellulaire du facteur tissulaire. Les feuillets β du premier domaine fibronectine III sont numérotés de β1_A à β7_G et les feuillets β du second domaine fibronectine III sont numérotés de β8A à β16G. La flèche noire montre la liaison entre les deux domaines ; les cercles rouges

indiquent les sites possibles de N-glycosylation ; les traits bleus indiquent les ponts dissulfures^[357]

1.3.2.2. La queue intracytoplasmique

La queue intracytoplasmique du facteur tissulaire est constituée de 21 acides aminés.

Elle contient deux sites potentiels de phosphorylation : un site consensus pour la phosphorylation par la protéine kinase C (PKC) en Ser^{253 [14]} et un site de phosphorylation indépendant de la PKC en Ser^258[15]. La phosphorylation en Ser²⁵³ est un régulateur positif de la phosphorylation en Ser²⁵⁸.

Le domaine intracytoplasmique du facteur tissulaire est également palmitoylé en Cys²⁴⁵. Cette palmitoylation permet de localiser le facteur tissulaire dans des micro-domaines membranaires mais est également un régulateur négatif de la phosphorylation en Ser^258[16].

1.3.3. LE FACTEUR TISSULAIRE ALTERNATIVEMENT ÉPISSÉ

Alors qu’il était admis que le facteur tissulaire était synthétisé in vivo sous sa forme complète, Bogdanov et al ont montré, en 2003, la synthèse in vivo d’une forme alternative du facteur tissulaire^[17]. Ce facteur tissulaire, dénommé facteur tissulaire alternativement épissé (asTF = "alternatively spliced tissue factor"), est une protéine de 206 acides aminés dont les résidus 1 à 166 sont identiques à la forme complète du facteur tissulaire, tandis que les résidus 167 à 206 forment une nouvelle queue C-terminale. Il ne possède donc ni de domaine transmembranaire, ni de queue intracytoplasmique.

La paire de lysines Lys¹⁶⁵-Lys¹⁶⁶, qui intervient dans les interactions entre le facteur tissulaire et le facteur VIIa^[18], est conservée dans la forme alternativement épissée^[17].

Bien qu’il ne possède ni domaine transmembranaire, ni queue intracytoplasmique, le asTF présente une activité pro-coagulante en présence de phospholipides^[17].

1.4. L’

Dans cette thèse, j’ai notamment mis en évidence l’expression du facteur tissulaire dans une lignée d’ostéosarcome (SaOS-2). Son expression était déjà bien documentée pour d’autres types cellulaires, notamment dans les cellules endothéliales qui ont également été utilisées ici. Les paragraphes suivants font le point sur les connaissances actuelles de l’expression du facteur tissulaire dans les tissus et les cellules.

1.4.1. LE FACTEUR TISSULAIRE DANS LE TISSU INTERSTITIEL

Les premières recherches sur l’expression du facteur tissulaire, menées par Drake et al^[24], et se basant sur des marquages immunohistochimiques, faisaient apparaître le facteur tissulaire dans le tissu interstitiel entourant les vaisseaux sanguins, avec une prédominance pour l’adventice, formant de la sorte un "manchon hémostatique" capable d’activer la cascade de coagulation lors de la rupture de la paroi des vaisseaux sanguins^[19].

Par la suite, des études ont montré que le facteur tissulaire est aussi exprimé dans les fibroblastes, les adipocytes^[20], les astrocytes^[21] et les pérycites^[22]. Les cellules de muscle lisse n’expriment pas le facteur tissulaire sauf lorsque son expression est induite par des facteurs de croissance^[23]. De même, dans des conditions physiologiques normales, le facteur tissulaire n’est pas exprimé par les cellules endothéliales. Cependant, son expression peut y être induite in vitro grâce à différents stimulants tels que le TNF-α^[24], les lipopolysaccharides^[25], les cytokines^[26] et l’histamine^[27]. L’induction in vivo du facteur tissulaire dans les cellules endothéliales continue à faire débat, bien que quelques études ont mis en évidence sa présence dans l’endothélium de patients anémiques et dans des modèles de septicémie induite par Escherichia coli chez les babouins^{[28, 29]}.

Au niveau des organes, la distribution du facteur tissulaire n’est pas uniforme. Ainsi, des quantités importantes de facteur tissulaire ont été détectées dans les organes hautement vascularisés, tels que les poumons, le cerveau et le placenta^{[19, 30]}. D’autres études, portant cette fois sur l’expression du gène dans la souris, ont montré que le facteur tissulaire est également exprimé, mais de façon moindre, dans le cœur, les reins, les intestins, les testicules, la peau et l’utérus, alors qu’il ne semble pas exprimé dans les muscles squelettiques et n’apparaît que très faiblement dans le muscle cardiaque[21, 30, 31, 32, 33, 34].

Le facteur tissulaire alternativement épicé a été détecté dans les poumons, le placenta et le plasma^[17]. Il a également été détecté dans des cellules, telles les cardiomyocytes^[35] et de nombreuses cellules cancéreuses (glioblastome, mélanome, carcinome gastrique,…)^[36].

1.4.2. LE FACTEUR TISSULAIRE DANS LE SANG

Jusqu’à la fin des années 1990, aucune étude n’avait montré l’expression du facteur tissulaire dans des cellules non stimulées du sang. C’est en 1999 que Giesen et al ont démontré l’existence d’un facteur tissulaire circulant dans le sang, qu’ils ont dénommé

"blood-borne TF"^[37]. Les sources actuelles de ce facteur tissulaire ne sont pas encore parfaitement déterminées. Cependant, la décryption semble jouer un rôle dominant dans ces phénomènes.

Le blood-borne TF existe sous une forme encryptée, et donc non fonctionnelle, séquestré dans les cellules et les micro-particules^[38]. La décryption du facteur tissulaire, qui pourrait accompagner la transposition des phospholipides anioniques vers le feuillet externe des cellules^[39], se produit lors d’une lésion ou d’une activation cellulaire^[38].

Actuellement, le rôle fonctionnel du facteur tissulaire circulant reste controversé.

Certains auteurs considèrent en effet que la quantité de facteur tissulaire circulant est insuffisante pour générer un caillot hémostatique^[40] et que la coagulation ne peut être déclenchée que par le facteur tissulaire exprimé dans la paroi des vaisseaux sanguins^[41] alors que d’autres articles décrivent un facteur tissulaire circulant capable d’activer la coagulation^[42].

2. L ES SÉRINES PROTÉASES D ’ INTÉRÊT

2.1. I

Les sérines protéases utilisées au cours de cette thèse sont au nombre de trois : le facteur VIIa, le facteur Xa et la thrombine.

Dans un premier temps, leur structure sera brièvement décrite, avec une emphase sur les domaines actifs leur conférant leur propriété d’activation d’autres sérines protéases et de leur(s) récepteur(s). Par la suite, les modifications subies lors de l’activation seront explicitées, car les manipulations réalisées au cours de cette thèse font intervenir ce mécanisme d’activation.

2.2. S

’

Les sérines protéases d’intérêt sont des glycoprotéines composées de domaines structurels ou fonctionnels identiques (figure 3), à savoir^[43] :

- un peptide signal qui intervient dans la sécrétion de la protéine sous forme de zymogène, c’est-à-dire sous une forme non-active ;

- un domaine Gla dans la région N-terminale et qui contient les acides γ- carboxyglutamiques liant les ions Ca²⁺ nécessaires à son activité protéase ;

- deux domaines semblables au facteur de croissance épidermique, pour les facteurs VIIa et Xa, ou deux domaines Kringle, pour la thrombine ;

- un peptide d’activation ;

- un domaine sérine protéase ou domaine catalytique.

A

B

C

Figure 3. Structure "déroulée" comparative des trois sérines protéases d’intérêt, (A) le facteur VIIa, (B) le facteur Xa et (C) la thrombine, sous leur forme de zymogène, mettant en parallèle les caractéristiques communes. Les positions des acides aminés de la triade catalytique sont représentées par les boules noires

(adapté de [273]).

Les sérines protéases d’intérêt sont sécrétées dans la circulation sanguine sous une forme non activée, appelée "zymogène", composée d’une seule chaîne d’acides aminés, à l’exception du facteur X, est composé de deux chaînes (figure 3). L’activation est réalisée par le clivage d’un lien Arg-Xxx. La forme activée est toujours constituée de deux chaînes, une chaîne lourde et une chaîne légère, reliées entre elles par un seul pont disulfure.

La triade catalytique (His, Asp, Ser) caractéristique des sérines protéases est toujours constituée des mêmes acides aminés, dont la position dans chacune des sérines protéases d’intérêt est donnée dans la table 1.

Facteur VIIa His⁴¹ Asp⁹⁰ Ser¹⁹² Facteur Xa His²³⁶ Asp²⁸² Ser³⁷⁹ Thrombine His³⁶³ Asp⁴¹⁹ Ser⁵²⁵

Table 1. Position des acides aminés de la triade catalytique dans les sérines protéases d’intérêt.

2.3. S

La synthèse des zymogènes facteur VII, facteur X et prothrombine se déroule dans le foie. Elle requiert pour cela la vitamine K, d’où le nom régulièrement donné de "protéines dépendant de la vitamine K"[44, 45, 46]. Lors de leur synthèse initiale, ces molécules possèdent une séquence de tête qui contient la séquence signal hydrophobe nécessaire à leur sécrétion [44]. Cette séquence est aussi importante pour la modification post-translationnelle des protéases car elle contient le site de reconnaissance pour la γ-carboxylation qui permet la création du domaine Gla^[47].

Généralement, cette séquence est clivée en deux étapes, la première donnant naissance au "propeptide", et la seconde donnant naissance au zymogène mature^[44].

Le cas du facteur X est différent vu que le zymogène est déjà constitué de deux chaînes séparées et reliées entre elles par un pont disulfure. Dans ce cas, le clivage protéolytique nécessaire à la formation du zymogène se produit dans l’appareil de Golgi^[48].

La suite de ce chapitre contient une description plus détaillée des trois sérines protéases d’intérêt.

2.4. L

VII(

)

2.4.1. LA DÉNOMINATION

Le zymogène porte le nom de facteur VII, abrégé sous la forme de FVII. De même, la forme activée prend le nom complet de facteur VII activé, écrit sous la forme de facteur VIIa ou de FVIIa.

2.4.2. GÈNE – CHROMOSOME

Etant donné que le facteur VII activé provient du clivage du zymogène facteur VII, la description du gène et la localisation chromosomique présentées ci-dessous ne concernent que le zymogène.

Le gène codant pour le facteur VII se trouve sur le chromosome 13, en position 13q34, et est formé de 12,8 kb. Il contient neuf exons et huit introns^[49].

2.4.3. LA STRUCTURE DE LA PROTÉINE

Le zymogène facteur VII est une sérine protéase de 406 résidus et d’une masse moléculaire calculée de 45,512 kDa. Il contient une séquence de tête de 60 acides aminés qui est éliminée lors de la synthèse^[46].

La forme activée est faite de deux chaînes polypeptidiques de 20 kDa et 30 kDa environ. La chaîne légère est reliée à la chaîne lourde par un pont disulfure au niveau des Cys¹¹⁰ de la chaîne légère et la Cys¹³⁵ de la chaîne lourde (figure 4)^[46].

Figure 4. Structure de la forme "pre-pro-protéine" du facteur VII, reprenant notamment la séquence "pre-pro"

de tête, numérotée de –1 à –60^[46].

La chaîne légère, de 152 acides aminés, contient les résidus d’acide γ- carboxylglutamique formant un domaine Gla liant le Ca²⁺. Ce domaine est suivi de deux domaines semblables au facteur de croissance épidermique (EGF-like domain), un groupe de résidus hydrophobiques se trouvant à l’interface entre le domaine Gla et le premier domaine semblable à l’EGF^[50]. Elle possède 7 ponts disulfures internes (figure 4) et un site probable de glycosylation liée à Asn (Asn¹⁴⁵)^[46].

Lors des manipulations faisant intervenir l’activation des sérines protéases ou le sang en coagulation, l’ajout de CaCl2 à la solution est nécessaire, sans quoi ni l’activation, ni la coagulation ne se produisent. Cela s’explique par le fait que 8 sites de liaison au Ca²⁺ ont été identifiés dans le domaine Gla et le premier domaine EGF[51, 52,53]. La présence d’ions dans le domaine Gla est essentielle à la liaison du facteur VIIa avec les phospholipides, tandis que ceux présents dans le premier domaine EGF interviennent dans sa liaison avec le facteur tissulaire, indispensable pour que le facteur VIIa joue son rôle protéolytique^[50].

La chaîne lourde, obtenue après clivage en Arg¹⁵², est formée de 254 acides aminés.

Elle contient le domaine sérine protéase (= le domaine catalytique) constitué de la triade catalytique His⁴¹, Asp⁹⁰ et Ser¹⁹². Quatre ponts disulfures et un site probable de glycosylation liée à Asn (Asn¹⁷⁰) y sont présents^[46].

2.4.4. LA CONCENTRATION SANGUINE

La grande majorité du facteur VII présent dans le sang s’y trouve sous la forme du zymogène, à une concentration moyenne de 10nM^[50]. Cependant, la forme activée se retrouve en faible quantité dans le sang où elle représente entre 1% et 2% de la concentration totale en facteur VII^[54].

2.4.5. LE COMPLEXE FACTEUR TISSULAIRE – FACTEUR VIIA

Le facteur VIIa isolé présente une activité catalytique quasi nulle. En fait, seule son association avec le facteur tissulaire permet de lui conférer son activité catalytique, nécessaire à l’activation du facteur X et du récepteur PAR-2.

Le complexe formé par le facteur tissulaire et le facteur VIIa possède une forme allongée, tout comme ses deux composants pris séparément, et s’étend sur une longueur approximative de 115 Å pour un diamètre compris entre 40 Å et 50 Å^[55].

Dans le complexe, le facteur VIIa s’enroule quasi complètement autour du facteur tissulaire et, vu qu’il s’agit d’une plus grande protéine que le facteur tissulaire, le domaine sérine protéase émerge au-dessus du facteur tissulaire^[51].

L’interface entre les deux molécules peut être divisée en trois régions[51, 55, 56,57] : - l’interface domaine sérine protéase (FVIIa) – partie supérieure du premier

domaine fibronectine de type III (TF) ;

- l’interface domaine EGF-1 (FVIIa) – domaine entre les deux domaines fibronectine de type III (TF) ;

- l’interface domaine Gla (FVIIa) – partie inférieure du second domaine fibronectine de type III (TF).

De façon intéressante, la structure de la forme soluble du facteur tissulaire, donc sans domaine transmembranaire et queue intracytoplasmique, est quasi identique entre la forme libre et la forme liée au facteur VIIa, indiquant que le facteur tissulaire (soluble) ne subit que de petits changements de conformation lors de la liaison avec le facteur VIIa[10, 55, 58]. Le facteur tissulaire impose une conformation générale au facteur VIIa qui, autrement, est très flexible^[55].

2.6. L

X(

)

2.6.1. L’HISTORIQUE

La première description du facteur Xa date des années 1950. En 1956, Telfer rapporte le cas d’une jeune fille (Prower) dont le temps de génération de thrombine est extrêmement long^[59]. Un an plus tard, Hougie décrit les paramètres anormaux de coagulation d’une patiente dénommée Stuart, qui peuvent être corrigés en mélangeant son sérum à celui d’un patient déficient en facteur VII^[60]. Ce facteur fut appelé facteur X lors de la création de la nomenclature officielle des facteurs de coagulation en 1962^[44].

2.6.2. LA DÉNOMINATION

Le facteur Xa de la coagulation porte également le nom de facteur de Stuart-Prower ou thrombokinase. Généralement, il est abrégé sous la forme écrite de FX pour le zymogène et FXa pour la forme active.

2.6.3.GÈNE – CHROMOSOME

Le gène du facteur X humain, dénommé F10, se trouve sur le chromosome 13q34, à seulement 2,8 kb d’écart du gène du facteur VII^[61]. Il présente une longueur de 22 kb. Sept

introns et huit exons ont été détectés dans la région codante et la région 3’ non codante du gène^[44].

2.6.4. ARN MESSAGER – ADN COMPLÉMENTAIRE

L’ADNc du facteur X a été cloné en 1986 par deux équipes simultanément^{[43, 62]}. Il a une taille de 1502 bp, comprenant notamment une séquence de 25 acides aminés 5’ non codant. La partie codant est formée de^{[43, 44]} :

- 120 bp codant pour la séquence de tête de 40 acides aminés ; - 1344 bp codant pour les acides aminés de la chaîne mature ; - une courte région non transcrite de 10bp en 3’.

2.6.5. LA STRUCTURE DE LA PROTÉINE

Le zymogène facteur X est une glycoprotéine de 58 kDa^[62] constitué d’une chaîne légère de 139 acides aminés (16,9 kDa) et d’une chaîne lourde de 306 acides aminés (42,1 kDa), reliées entre elles par un pont disulfure entre Cys¹³¹ et Cys³⁰² (figure 5)^{[43, 62]}. A l’inverse du zymogène facteur VII, le zymogène facteur X a déjà subi des clivages qui ont entraînés l’élimination des 3 acides aminés Arg¹⁴⁰-Arg^{142 [63]}. La triade catalytique est ici formée par les acides aminés His²³⁶, Asp²⁸² et Ser^379[63].

La chaîne légère contient trois domaines caractéristiques, à savoir le domaine Gla, une courte séquence hydrophobe et deux domaines semblables au facteur de croissance épidermique (EGF1 & EGF2) (figure 5). Le domaine Gla est constitué de 11 acides γ- carboxyglutamiques et un acide β-hydroxyaspartique ^{[63, 64]}. Enfin, cette chaîne possède 7 ponts disulfures ^[63].

La chaîne lourde possède le peptide d’activation et le domaine sérine protéase ^[63]. Le peptide d’activation est constitué de 52 acides aminés. Il est glycosylé en Asn^181[65] et Asn¹⁹¹

[66], glycosylation qui joue un rôle important dans l’activation du facteur X.

Figure 5. Représentation schématique de la séquence d’acides aminés du facteur X^[63].

2.6.6. LA CONCENTRATION SANGUINE

Le zymogène facteur X circule dans le sang à une concentration moyenne de 170nM, concentration bien plus élevée que le facteur VII (10nM)^[44].

2.6.7. L’ACTIVATION DU FACTEUR X

Dans le cas qui nous occupe, l’activation du zymogène facteur X se réalise dans le complexe tenase extrinsèque composé du complexe facteur tissulaire – facteur VIIa, de phospholipides et d’ions calcium^[63].

Le zymogène facteur X est déjà clivé en une chaîne lourde et une chaîne légère.

L’activation de ce zymogène en facteur Xa se produit par le clivage du lien entre Arg¹⁹⁴ et Ile¹⁹⁵, libérant ainsi le peptide d’activation et laissant la chaîne lourde à 254 acides aminés (27 kDa)^{[63, 67]}. Une auto-protéolyse additionnelle peut prendre place au niveau de la liaison entre Arg⁴²⁹ et Gly⁴³⁰, donnant lieu à la formation de la forme β du facteur Xa, et induisant l’élimination d’un petit peptide de la partie C-terminale de la chaîne lourde. Actuellement, aucune différence fonctionnelle n’a été observée entre les deux formes^[63].

2.7. L

2.7.1. L’HISTORIQUE

La notion de thrombine a été émise pour la première fois en 1845 par un physiologiste écossais du nom de Buchanan. Il est le premier scientifique à avoir proposé l’idée que la coagulation provenait d’un agent circulant dans le sang, agent auquel il a donné le nom de thrombine^[68]. La première description de la thrombine date de 1852 et est l’œuvre d’Alexander Schmidt^[69]. Ce n’est que bien plus tard, en 1951, que la protéine a été purifiée et il a encore fallu attendre cinq ans pour réaliser son séquençage^[70].

2.7.2. LA DÉNOMINATION

La nomenclature standard, basée sur les chiffres romains, identifie la thrombine comme le facteur II activé de la coagulation. La prothrombine est appelée facteur II de la coagulation^[71]. Bien souvent, la thrombine s’écrit sous la forme FIIa pour facteur II activé de la coagulation ou sous la forme TR pour thrombine. De même, le zymogène prothrombine s’écrit sous la forme FII pour facteur II de la coagulation ou PT pour prothrombine.

2.7.3. GÈNE – CHROMOSOME

La prothrombine, zymogène de la thrombine, est localisée sur le chromosome 11, en position 11p11. Son gène est constitué de 20,3 kb, organisé en 14 exons séparés par 13 introns. La taille des exons varie entre 25 et 315 paires de bases alors que les introns varient entre 84 et 9447 paires de bases^[72].

2.7.4. ARN MESSAGER – ADN COMPLÉMENTAIRE

L’ADNc de la prothrombine a été cloné par Degen en 1983^[72]. Il a une taille de 2005 paires de bases organisées comme suit :

- une séquence de tête de 36 acides aminés ; - les 579 acides aminés de la forme secrétée ; - un codon stop ;

- une région non-codante de 97 acides aminés ; - une queue poly(A) de 27 paires de bases.

2.7.5. LA STRUCTURE DE LA PROTÉINE

La thrombine-α est une protéine de 39kDa, se présentant sous forme ellipsoïdale et d’une dimension approximative de 45 x 45 x 50 ų, avec une profonde et étroite dépression en son centre et contenant le site actif^{[73, 74]}.

Elle est formée de deux chaînes polypeptidiques : la chaîne A de 36 acides aminés et la chaîne B de 259 acides aminés, reliées de façon covalente par un pont disulfure (Cys¹- Cys¹²²)^{[74, 75]}. Des ponts hydrogène se forment également entre les deux chaînes^[74]. A l’inverse des autres sérines protéases d’intérêt, la thrombine ne lie pas le Ca²⁺, même lorsque ce dernier est présent à des concentrations de plusieurs millimoles^[76].

L’activité catalytique de la thrombine est finement régulée par des domaines de reconnaissance qui régulent son interaction avec différents substrats et inhibiteurs^[74]. Parmi ces domaines, deux d’entre eux jouent un rôle central dans la fonction de la thrombine : le site de reconnaissance du fibrinogène et le site de liaison à l’héparine^[77].

Le site de reconnaissance du fibrinogène (FRS = "fibrinogène recognition site"), aussi appelé premier exosite liant les anions ("anion binding exosite I"), est fondamental dans la reconnaissance de son récepteur par la thrombine, comme ce sera expliqué dans le chapitre suivant. Il est formé de la boucle Arg⁶⁷-Ile⁸² de la chaîne B et est situé à 20 Å du site catalytique^[77].

Le site de liaison à l’héparine (HBS = "heparin binding site"), parfois dénommé second exosite liant les anions ("anion binding exosite II"), est localisé au niveau C-terminal de la chaîne B, à environ 30 Å de la zone catalytique^{[74, 77]}. Le site HBS intervient dans la liaison de la thrombine à l’héparine et à la glycoprotéine Iβ plaquettaire, notamment^[77].

A

B

Figure 6. (A) Séquence des acides aminés de la chaîne A. Le pont dissulfide indique la position de la liaison avec la chaîne B de la thrombine. (B) Séquence des acides aminés de la chaîne B. Rouge = triade catalytique;

bleu = FRS ; vert = HBS ; souligné = résidu tryptophane ; fond jaune = boucle Na⁺ ; S-S = pont disulfure.

2.7.6. LA PROTHROMBINE

La prothrombine est une protéine de 72kDa et 622 résidus, synthétisée dans le foie et secrétée dans le sang sous la forme d’un zymogène de 579 résidus[71, 73, 78]. Sa concentration dans le plasma est d’environ 1,5µM et sa durée de demi-vie est de 65h^[71].

La prothrombine se caractérise par la présence de plusieurs sites particuliers dans sa structure. Ainsi, elle possède un domaine Gla N-terminal constitué 10 carboxyglutamate-γ, suivi par deux domaines Kringle F1 et F2 (figure 7)^{[73, 79]}.

Figure 7. Structure schématique de la disposition des différents domaines caractéristiques de la prothrombine (adapté de [73]).

La modification post-translationnelle des acides glutamiques de la partie N-terminale en carboxyglutamate-γ (Gla) dépend de la vitamine K^[80]. Le domaine Gla peut fixer 7 ions Ca^{2+ [81]} assurant la stabilité de ce domaine et, en présence de Ca²⁺, est responsable de l’attachement de la prothrombine aux membranes phospholipidiques^{[82, 83]}.

Les domaines Kringle sont formés de trois boucles reliées par des ponts disulfures^[84]. Les fonctions de ces domaines ne sont pas encore bien déterminées. Cependant, il semble que le second domaine interviendrait dans la liaison de la prothrombine au facteur Va dans le complexe prothrombinase^[73].

2.7.7. L’ACTIVATION DE LA PROTHROMBINE

L’activation de la prothrombine dans le complexe prothrombinase fait intervenir le facteur Xa et le facteur Va en présence de calcium sur des surfaces de phospholipides.

L’activation de la prothrombine en thrombine se produit suite à deux clivages :

- la partie contenant le domaine Gla et les deux domaines kringle est éliminée par une césure etre Arg²⁷² et Thr²⁷³

- le domaine catalytique est scindé en une chaîne lourde et une chaîne légère par un clivage au niveau de l’Arg³²⁰ et l’Ile^321[85].

2.7.8. D-PHE-PRO-ARG-CHLOROMETHYLKETON (PPACK)

PPACK est un inhibiteur électrophile de la thrombine qui sera utilisé au cours des expériences réalisées lors de cette thèse. Il s’agit d’une molécule synthétique développée à partir des résidus D-Phe-Pro-Arg imitant la séquence naturelle du fibrinogène à laquelle se lie la thrombine. En se liant à la thrombine, PPACK inactive la thrombine en réalisant une alkylation irréversible sur le résidu His^57[86].

Figure 8. Molécule de PPACK^[86].

3. L A COAGULATION

3.1. I

La coagulation est traditionnellement définie comme un mécanisme de défense contre le saignement et constituée d’un ensemble d’étapes menant à un point final facilement détectable : la formation d’un caillot sanguin^[87].

La coagulation met en jeu une série de conversion de zymogènes inactifs en sérines protéases actives, le tout en présence de calcium et sur des membranes cellulaires^{[88, 89]}. Le modèle de la coagulation dit en "cascade", qui fut un premier pas dans la compréhension du rôle des protéases de la coagulation et de leurs interactions biochimiques, a été introduit au milieu du XX^e siècle par Davie et MacFarlane^{[90, 91]}.

Plus tard, des expériences menées pour comprendre les effets induits par insuffisance des différents facteurs sur la coagulation ont conduit à proposer le modèle de la coagulation divisé en deux voies d’initiation : la voie extrinsèque, initiée par le facteur tissulaire, et la voie intrinsèque, initiée par les facteurs de contact. Les deux voies se rejoignent en aval après la formation du facteur Xa^[71]. Cependant, ce modèle, quoique conceptuellement attractif et très largement accepté, ne permet pas de comprendre toutes les constatations liées, notamment, à l’hémophilie^[87]. Ces lacunes ont mené Hoffman et Monroe à la formulation d’un modèle de coagulation basé sur les cellules (2001), qui met en avant les interactions des facteurs de coagulation avec des surfaces cellulaires spécifiques^[92].

3.2. L

Bien que la théorie la plus récente de la coagulation soit celle basée sur les cellules, le modèle traditionnel des deux voies, extrinsèque et intrinsèque (figure 9), est encore régulièrement utilisé. La voie extrinsèque va être abordée ici car elle permet de présenter les complexes tenase et prothrombinase intervenant dans la coagulation et qui ont été utilisés dans les expériences menées dans le cadre de cette thèse.

Le modèle traditionnel postule que la coagulation sanguine est initiée par le facteur tissulaire qui se retrouve exposé au flux sanguin, soit par rupture ou activation de l’endothélium suite à un processus inflammatoire, soit exprimé lorsqu’il est décrypté par différentes cellules[2, 88, 89, 93].

La phase dite d’"initiation" de la coagulation démarre par la liaison du facteur tissulaire au facteur VII ou facteur VIIa circulant, formant ainsi le complexe facteur tissulaire – facteur VIIa. Par la suite, le complexe facteur tissulaire – facteur VIIa forme, avec des phospholipides et du Ca²⁺, le complexe tenase extrinsèque qui active les zymogènes facteur IX et facteur X respectivement en facteur IX activé (facteur IXa) et facteur X activé (facteur Xa)^[94]. La faible quantité de facteur Xa ainsi formée se lie ensuite au facteur V activé (facteur Va) pour former, avec des phospholipides et du Ca²⁺, le complexe prothrombinase qui convertit la prothrombine en thrombine. La thrombine, produite seulement à quelques picomoles, clive à son tour le fibrinogène en fibrine insoluble et le facteur XIII en facteur XIII activé pour former le caillot de fibrine^{[89, 95]}.

Figure 9. Représentation schématique de la cascade de coagulation, en ce compris les voies d’initiation extrinsèque et intrinsèque (Enzyme Research Laboratories, UK).

3.3. L

Parmi l’ensemble des complexes intervenant dans la coagulation, sont seuls introduits ici les complexes qui seront utilisés ou formés au cours des expériences menées dans le cadre de cette thèse, à savoir le complexe tenase extrinsèque et le complexe prothrombinase.

3.3.1. LE COMPLEXE TENASE EXTRINSÈQUE

Le complexe tenase extrinsèque est constitué par le facteur tissulaire et le facteur VIIa, en présence de Ca²⁺ et de phospholipides. Il catalyse l’activation du zymogène facteur X en facteur Xa^[96].

Le facteur X se lie de façon réversible aux membranes de phospholipides via son domaine Gla^[51]. Au-delà de la liaison avec les phospholipides, le domaine Gla est également nécessaire à la reconnaissance du facteur X en tant que substrat du complexe^[97].

Initialement, les rôles des deux composants du complexe étaient scindés, le facteur VIIa activant le zymogène facteur X et le facteur tissulaire plaçant le facteur VIIa dans une configuration optimale à l’action protéolytique^[71]. Cependant, des expériences récentes ont permis de montrer que le facteur tissulaire participe également à l’activation du facteur X^[98].

L’intérêt de la formation des différents complexes est marquant pour le facteur VIIa.

En effet, l’activité catalytique de ce dernier varie fortement suivant la présence ou non du facteur tissulaire, ainsi que du calcium et des phospholipides. En absence de tous ces éléments, l’activité protéolytique du facteur VIIa est négligeable. En présence de calcium et de phospholipides, qui remplacent la membrane cellulaire, l’activité du facteur VIIa augmente^[94]. Enfin, en présence du facteur tissulaire, du Ca²⁺ et des phospholipides, son activité est 6x10⁶ fois plus élevée que lorsqu’il est seul (table 2)^[89].

Cofacteur Concentration K_m (µM) K_cat (min^-1)

- - >20 >1.5x10^-4

CaCl2 + PL * 2.5mM + 21µM 2.0.25 0.062

CaCl2 + PL + TF 2.5mM + 21µM + 9.4pM 0.23 885

Table 2. Activation du facteur X par le facteur VIIa en présence ou non des différents cofacteurs formant le complexe extrinsèque tenase.

3.3.2. LE COMPLEXE PROTHROMBINASE

Le complexe prothrombinase est construit par l’assemblage du facteur Xa et du facteur Va en présence de calcium, sur une membrane de phospholipides chargés négativement^[93]. Ce complexe a pour but de convertir la prothrombine en thrombine.

Si le rôle du facteur Xa est d’activer, par clivage, la prothrombine, le rôle du facteur Va serait de disposer le facteur Xa et la prothrombine dans la configuration requise pour une protéolyse maximale (figure 10)^[71].

Thrombine FXa

Plaquettes

Facteur Va

Figure 10. Positionnement du facteur Xa et de la prothrombine (A) en absence ou (B) en présence du facteur Va.

La barre issue du milieu de la molécule de prothrombine représente une partie de la molécule qui crée une

"entrave" empêchant l’activation de la prothrombine par des enzymes avec lesquelles elle n’est pas correctement alignée. Le facteur V permet de donner au facteur Xa et à la prothrombine une configuration

correcte pour l’activation^[71].

Comme pour le complexe tenase extrinsèque, les valeurs caractéristiques de l’activité du facteur Xa isolé ou en complexe sont reprises dans le tableau ci-dessous (table 3). On constate que le facteur Xa, dans le complexe prothrombinase, a une efficacité 1.1x10⁶ fois supérieure. De plus, sur base de l’activité prothrombinase, il a été montré que le facteur Xa était le facteur limitant pour l’activation de la thrombine par ce complexe^{[100, 101]}.

Cofacteur Concentration Km (µM) Kcat (min^-1)

- - 131 0.6

CaCl2 + PL + Va 2.5mM + 21µM + 10pM 1.0 5016

Table 3. Activation de la thrombine par le facteur Xa en présence ou non des différents cofacteurs formant le complexe prothrombinase.

C HAPITRE 2 :

LES RÉCEPTEURS AUX SÉRINES PROTÉASES D ’ INTÉRÊT

1. I NTRODUCTION

Certaines sérines protéases de la cascade de coagulation activent des récepteurs dénommés "protease-activated receptors" (PAR). Quatre récepteurs aux protéases sont actuellement connus, à savoir PAR-1, PAR-2, PAR-3 et PAR-4. Ils appartiennent à la famille des récepteurs liés aux protéines G possédant 7 domaines transmembranaires.

Les récepteurs PAR présentent un mécanisme d’activation spécifique. Les sérines protéases clivent leur(s) récepteur(s) au niveau de la queue N-terminale extracellulaire, entraînant l’exposition d’un ligand propre au récepteur, dénommé "tethered ligand", qui se lie de manière intramoléculaire à la seconde boucle extracellulaire du récepteur et l’active, initiant de la sorte de multiples cascades de signalisation (figure 11). Bien que ce mécanisme d’activation soit irréversible, la signalisation induite par les récepteurs PAR peut être arrêtée par leur désensibilisation et une perte membranaire.

Lors de lésions tissulaires, de nombreuses protéases activant les récepteurs PAR sont produites. Les récepteurs PAR sont donc des acteurs importants de la réparation tissulaire, de la survie cellulaire, de l’inflammation et de la douleur. Les récepteurs PAR interviennent aussi dans les affections vasculaires et les cancers.

Ce chapitre a pour but de présenter un aperçu des connaissances actuelles sur les récepteurs aux protéases 1 et 2 (PAR-1 et PAR-2). En effet, cette thèse a notamment pour but de montrer que l’activation de ces récepteurs est responsable des effets induits par les sérines protéases d’intérêt.

Figure 11. Localisation des différentes structures caractéristiques du récepteur à la thrombine (PAR-1)^[358].

2. P ROTEASE - ACTIVATED RECEPTOR -1 (PAR-1)

2.1. L

Le terme "PAR", adopté par le "NC-International Union of Biochemistry and Molecular Biology Nomenclature Committee"^[102], fait spécifiquement référence à la sous- famille des récepteurs couplés aux protéines G qui sont activés par un mécanisme protéolytique découvrant le ligand lié au récepteur-même. Ce comité a créé l’acronyme

"PAR" sur base du nom complet de la famille des récepteurs, à savoir "proteinase-activated receptor", mais a également accepté la terminologie plus courante de "protease-activated receptor"^[102].

Le récepteur à la thrombine porte plusieurs noms et peut être représenté par plusieurs symboles (table 4).

Dénomination française Dénomination anglaise Symbole Récepteur au facteur II de la

coagulation

Coagulation factor II receptor

(dénomination officielle)

CF2R Récepteur à la thrombine

(humaine) (Human) Thrombin receptor (H)TR - Protease-activated receptor-1

(dénomination couramment utilisée)

PAR-1

Table 4. Dénominations françaises et anglaises et symboles représentatifs donnés au premier récepteur à la thrombine

2.2. G

– C

Le gène du récepteur PAR-1 humain, qui porte le nom de "F2R", est localisé sur le chromosome 5, en position 5q13^[103]. Aucune autre copie de ce gène n’est présent dans le génome humain^[104]. D’une taille de 27kb, il est constitué d’un premier exon de 438bp, suivi d’un intron de 22kb et, finalement, d’un exon de 3167bp^[105].

Il est intéressant de noter que les gènes encodant les quatre membres connus de la famille des récepteurs PAR présentent une structure similaire, avec un seul intron interrompant la séquence codante^[106]. Les similitudes s’étendent aux loci génétiques, conservés à travers les différentes espèces, ce qui suggère une origine ancestrale

2.3. ARN

– ADN

L’ADN complémentaire est constitué de 3.5kb (3592bp). Sa séquence révèle une région non transcrite en 5’ riche en GC (bases 1 à 224), un cadre ouvert de lecture encodant pour une protéine de 425 acides aminés (bases 225 à 1499), et une longue région 3’ non transcrite contenant plusieurs signaux de polyadenylation et une queue terminale poly(A) (bases 1500 à 3480)^[108].

2.4. L

Le récepteur PAR-1 est une protéine constituée de 425 acides aminés^{[108, 109]}. La séquence contient 7 domaines hydrophobiques caractéristiques des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR). Le récepteur PAR-1 a un poids moléculaire apparent de 68-80kDa sur gel d’électrophorèse^{[105, 110]}, réduit à 36-40kDa après déglycosylation, ce qui se rapproche de la masse moléculaire calculée de 46,5kDa^[110].

Une séquence N-terminale extracellulaire de 75 acides aminés précède le premier domaine transmembranaire. Elle possède un site de clivage pour la thrombine (LDPR/S, Arg⁴¹ – Ser⁴²), ressemblant très fortement à la séquence LDPR/I clivée par cette dernière dans le zymogène de la protéine C et responsable de son activation^{[108, 109]}. Ce site est suivi par une séquence constituée de résidus chargés et aromatiques (D⁵¹KYEPF⁵⁶) ressemblant à la queue C-terminale de l’hirudine connue pour interagir avec un site liant les anions de la thrombine[105, 109, 111]

. Cette séquence est appelée domaine "hirudine-like".

2.5. L

’

La description du mécanisme d’activation du récepteur présente un double intérêt pour ce travail. D’une part, cette activation présente un caractère unique et différent de la simple liaison ligand – récepteur car elle fait intervenir les propriétés catalytiques des activateurs des récepteurs et, d’autre part, la connaissance de ce mécanisme d’activation permet d’expliquer certains des résultats obtenus.

La présence d’une séquence ressemblant à un site de clivage connu pour la thrombine (LDPR/S, Arg⁴¹ – Ser⁴²) à proximité d’un site "hirudine-like" connu pour interagir avec le site liant les anions de la thrombine suggère que la thrombine se lie au récepteur par l’intermédiaire de la région acide "hirudine-like" de l’extension N-terminale du récepteur et l’active par protéolyse du lien Arg⁴¹-Ser^{42[108, 112]}.

Plus précisément, la liaison du récepteur à la thrombine se décrit comme suit : la séquence chargée négativement Y⁵²EPFWEDEE⁶⁰ du récepteur se lie avec le site liant les anions de la thrombine par formation de contacts hydrophobiques ^[113].

Figure 12. Représentation du domaine liant les anions de la thrombine (sphère) et de la façon dont la partie N- terminale du récepteur vient s’ancrer dans ce domaine (Coughlin SR, Vu TK,Hung DT, Wheaton VI.

Characterization of a functional thrombin receptor. J Clin Invest 1992, 89: 351-355)

La protéolyse du résidu Arg⁴¹ par la thrombine induit la libération d’un fragment de la queue N-terminale du récepteur et dévoile une nouvelle queue N-terminale commençant par Ser⁴² dont les premiers acides aminés sont les suivants : S¹FLLRNPNDKYEPF¹⁴. Dans cette séquence, l’hexapeptide S¹FLLRN⁶, dénommé le "tethered-ligand", est le peptide activant le récepteur avec le meilleur potentiel^[114]. Ce dernier se lie aux résidus 244-268 (I²⁴⁴QVPGLNITTCHDVLNE²⁶⁰TLLEGYYA²⁶⁸) de la deuxième boucle extracellulaire pour

"auto-activer" le récepteur^[115].

Actuellement, aucune fonction pour le fragment amino-terminal libéré n’est connue^{[109, 116]}.

Figure 13. Positionnement du site de liaison au domaine de liaison des anions de la thrombine ("région de liaison à l’anion exosite") et du site de clivage sur la partie N-terminale du récepteur PAR-1, entouré par le site

de reconnaissance du site de clivage et le peptide agoniste.

En résumé, l’activation du récepteur PAR-1 est le résultat de deux actions (figure 14) : d’abord, la liaison de la thrombine qui clive la partie N-terminale du récepteur et, ensuite, la liaison de la nouvelle séquence N-terminale ainsi découverte à la seconde boucle extracellulaire. Les modifications de conformation suffisent à induire l’activation des protéines G intracellulaires.

Figure 14. Mécanisme d’activation de PAR-1. La thrombine (sphère) se lie au domaine N-terminal de PAR-1 grâce au site "hirudine-like" (oval). La thrombine clive alors le lien peptidique entre Arg⁴¹ et Ser⁴² grâce au site de reconnaissance approprié ("site de clivage" - cercle) découvrant la séquence SFFLRN (losange) qui se lie de

façon intramoléculaire à la seconde boucle extracellulaire du récepteur pour induire l’effet signalant transmembranaire^[129].

2.6. L’

Le récepteur PAR-1 a été localisé à ce jour dans de nombreux tissus et types cellulaires, à un point tel que certains scientifiques le proposent comme récepteur ubiquitaire.

PAR-1 est exprimé dans le cerveau, les poumons, le cœur, l’estomac^[117], le colon^[118], les reins et les testicules^[102]. Son expression a été montrée dans plusieurs types cellulaires : les plaquettes, les cellules endothéliales, les cellules de muscle lisse vasculaire, les leucocytes, les fibroblastes, les neurones, les mastocytes, les ostéoblastes, les lymphocytes T et les monocytes^{[102, 119]}.

3. P ROTEASE - ACTIVATED RECEPTOR -2 (PAR-2)

3.1. L

Le récepteur PAR-2 porte plusieurs noms et peut être représenté par les symboles correspondants suivants (table 6) :

Dénomination française Dénomination anglaise Symbole - Coagulation factor II receptor-like 1

(Dénomination officielle)

CF2RL1

- Thrombin receptor-like 1 TRL1

- Protease-activated receptor-2

(Dénomination couramment utilisée)

PAR-2 Récepteur couplé aux protéines G 11 G protein-coupled receptor GPR11

Table 6. Dénominations françaises et anglaises et symboles représentatifs donnés au récepteur PAR-2.

3.2. G

– C

Le gène du récepteur PAR-2, qui porte le nom de "F2RL1", est localisé sur le chromosome 5, en position 5q13^[120], séparé de seulement 90kb du gène codant pour le récepteur PAR-1^{[112, 120]}.

Tout comme pour le gène de PAR-1, le gène du PAR-2 humain est divisé en deux exons séparés par un intron d’environ 14kb^[120].

3.3. ARN

– ADN

L’ADN complémentaire du récepteur PAR-2 comprend 1477bp. La séquence révèle une région non transcrite 5’ riche en GC (bases 1 à 203), un cadre ouvert de lecture de 1191bp (bases 204 à 1394), et une région non transcrite (bases 1395 à 1477)^[104].

3.4. L

Le récepteur PAR-2 est constitué de 397 acides aminés^[104]. La séquence révèle 7 domaines hydrophobes, correspondant à 7 domaines transmembranaires^{[104, 120]}.

Le récepteur présente un poids moléculaire de 55-100kDa sur gel d’électrophorèse, poids qui est réduit à 33-48kDa après dé-glycosylation par la N-glycosidase F^[121], ce qui se rapproche du poids moléculaire calculé de 44.125kDa^[104].

L’analyse de la séquence N-terminale du récepteur PAR-2 a mis en évidence la présence d’un site de clivage par la trypsine entre Arg³⁶ et Ser^37[112].

3.5. L’

De façon similaire au récepteur PAR-1, le clivage par la trypsine entre les acides aminés Arg³⁶ et Ser³⁷ découvre une nouvelle séquence N-terminale qui joue le rôle de

"tethered-ligand" : SLIGKV^[122].

A l’inverse du récepteur PAR-1, qui possède un site "hirudine-like" participant à la liaison de la protéase sur le récepteur, en l’occurrence la thrombine, aucun site de liaison aux protéases n’a été identifié dans le récepteur PAR-2^[109]. Cela a conduit à la création du concept de "récepteur PAR générique" pour PAR-2, qui servirait à la transmission du signal pour une grande variété de protéases^[123].

Tout comme pour PAR-1, la deuxième boucle extracellulaire du récepteur PAR-2 semble jouer un rôle important dans la liaison du "tethered-ligand" libéré lors du clivage protéolytique^[124]. Cependant, les études menées par Lerner^[124] ont aussi montré la possibilité d’une interaction avec la troisième boucle extracellulaire, une modification de celle-ci entraînant une diminution importante de l’activation du récepteur.

3.6. L’

Le récepteur PAR-2 est exprimé dans beaucoup de tissus humains. Les analyses par Nothern blot de l’ARNm de 16 types de tissus ont montré son expression dans le foie (++), les reins (+++), le pancréas (+++), l’intestin grêle (++) et le colon (++). Des expressions plus faibles sont retrouvées dans la trachée (+), le cœur (+), la prostate (+) et les poumons (+).

L’ARNm n’a pu être détecté dans le muscle squelettique, le placenta (quoiqu’il que l’on relève matière à discussion dans différents articles), la rate, le thymus, les testicules, les ovaires, les glandes salivaires, l’aorte et l’estomac[120, 125, 126]

.

D’un point de vue cellulaire, le récepteur est exprimé et fonctionnel dans les cellules endothéliales, en ce compris les HUVEC, et épithéliales, dans les myocytes, les fibroblastes, les cellules immunitaires, les neurones, les cellules gliales, les ostéoblastes et les neutrophiles[119, 120, 125, 127]

. De même, l’ARNm a été détecté dans de nombreuses lignées cellulaires cancéreuses^[104]. Par contre, l’ARNm n’a pas été trouvé dans les leucocytes. De même, le récepteur PAR-2 ne semble pas exprimé dans les plaquettes^[128].

4. P ROTÉASES ET PEPTIDES ACTIVATEURS DES RÉCEPTEURS

PAR

4.1. I

Les récepteurs PAR possèdent tous un acide aminé à résidu basique positionné juste avant la zone de clivage (en partant de la queue N-terminale), en l’occurrence une Arg^[129]. De ce fait, en théorie, toutes les protéases sont susceptibles d’activer les récepteurs PAR. C’est la raison pour laquelle beaucoup d’activateurs sont communs aux récepteurs PAR. Cependant, chaque récepteur PAR est préférentiellement activé par certains types de protéases grâce à la présence de séquences particulières, telle la séquence "hirudine-like" de PAR-1, ou à la présence de co-facteurs permettant de localiser des protéases à la surface cellulaire et de moduler leur activité.

Au cours de ce travail, différents activateurs ou peptides agonistes des récepteurs PAR ont été utilisés, soit pour mesurer une réponse induite par l’activation d’un récepteur PAR, soit pour démontrer le récepteur précis intervenant dans la réponse mesurée. Pour cette raison, il m’a semblé adéquat d’inclure un chapitre reprenant les protéases ou les peptides agonistes des récepteurs d’intérêt.

4.2. L

PAR-1

Différentes protéases ont été étudiées afin de déterminer si elles activent le récepteur PAR-1. Il a ainsi été montré que PAR-1 pouvait être activé par la plasmine et la chimiotrypsine^[110]. Par ailleurs, certaines protéases clivent le récepteur PAR-1 sur des sites autres que Arg⁴¹-Ser⁴², désactivant le récepteur. Ainsi, la cathepsine G, la protéinase 3 et l’élastase humaine leucocytaire clivent le récepteur après le "tethered-ligand", rendant le récepteur inactif (figure 15). Malheureusement, un des "défauts" de ces protéases est qu’elles peuvent également activer d’autres récepteurs PAR, les rendant inaptes à une utilisation comme pur antagoniste[105, 130, 131]

.

Figure 15. Sites de clivage de trois protéases (cathepsine G, protéinase 3, élastase) désactivant le récepteur PAR-1. La position de clivage de la thrombine et le "tethered-ligand" sont également donnés.

L’explication d’un rôle physiologique de désactivation par ces protéases est qu’une partie des récepteurs PAR-1 activés peut être recyclée à la surface cellulaire et non dégradée^{[132, 133]}.

Activation Désactivation

Protéases Références Protéases Références Thrombine

Factor Xa

Protéine C activée Cathepsin G

Matrix metalloprotéase –1 Plasmine

Trypsine Granzyme A

[108]

[134, 135]

[136]

[137]

[138]

[110]

[139]

[140]

Cathepsine G Trypsine Plasmine Chymotrypsine Calpain

Proteinase 3

Elastase leucocyte humaine

[130]

[140]

[141]

[142]

[143]

[144]

[145]

Table 7. Liste des activateurs et "désactivateurs" du récepteur PAR-1