SIGNAL CALCIUM INDUIT PAR LA THROMBINE

2.1. C

Les mono-couches adhérentes de cellules SaOS-2 ont été cultivées durant deux jours sur des lamelles de verres préalablement à leur utilisation dans les expériences de mesure de calcium intracellulaire.

Lors d’une stimulation par la thrombine, les cellules SaOS-2 répondaient par une

augmentation presque instantanée et momentanée de la [Ca²⁺]i. Ce signal calcique était

caractérisé par une montée brusque suivie d’un retour au niveau basal en deux temps, rapide dans un premier temps, et plus lent par la suite (figure 1). Il est important de noter que dans chaque expérience, toutes les cellules utilisées pour la mesure répondaient à la thrombine.

Figure 1. Courbe représentative de l’augmentation de la [Ca²⁺]i dans les SaOS-2 stimulés par la thrombine (25nM).

Les cellules ont été stimulées par la thrombine à différentes concentrations, ce qui a conduit à deux constatations :

- dans notre système expérimental, 500pM semble être la concentration sous laquelle aucune mobilisation de calcium ne se produit ;

- l’intensité du signal calcique est proportionnel à la concentration en thrombine, pour des doses comprises entre 500pM et 100nM (figure 2 et table 1).

Figure 2. Evolution moyenne de la [Ca²⁺]i dans les SaOS-2 stimulées par des concentrations croissantes en thrombine. Pour la facilité de comparaison, les traces moyennes ont été ramenées à une concentration initiale

fictive de [Ca²⁺]i = 50nM et le temps d’injection recalé à 120 secondes.

Thrombine (nM) Augmentation de la [Ca²⁺]i (nM) N

0,5 50,12 ± 2,8 16 1 59,13 ± 4,8 29 5 108,4 ± 3,3 58 10 109,5 ± 5,3 69 25 166,7 ± 4,9 140 50 187,3 ± 4,9 78 100 217,8 ± 5,9 49

Table 1. Augmentation moyenne de la [Ca²⁺]i dans les cellules de la lignée SaOS-2 stimulées par différentes concentrations en thrombine.

Les expériences dont les résultats sont présentés ci-dessus ne permettant pas de déterminer la concentration maximale de thrombine pour laquelle le signal calcium n’augmenterait plus en intensité, une régression linéaire a été réalisée sur les points de mesure. Elle a permis d’en déduire que 100nM était la concentration maximale de thrombine pour une réponse calcium maximale (figure 3).

Figure 3. Courbe empirique de l’augmentation de la concentration en calcium intracellulaire en fonction de la concentration en thrombine, dans les cellules de la lignée SaOS-2.

2.2. L

PAR-1

Précédemment, il a été démontré que le récepteur PAR-1, aussi dénommé récepteur à

la thrombine, est exprimé dans les cellules de la lignée SaOS-2^[250]. Pour vérifier que nos

cellules exprimaient bien ce récepteur, elles ont été stimulées par TRAP-6, un peptide agoniste spécifique de PAR-1. L’agoniste induit une augmentation transitoire qualitativement

similaire à celle induite par la thrombine, caractérisée par une montée rapide de la [Ca²⁺]_i

suivie d’une diminution plus lente vers le retour (figure 4). Malgré la stimulation par une haute concentration en TRAP-6, (1µM) l’intensité du pic de calcium (94,2 ± 5,9nM) n’atteint pas celui produit par la thrombine, ce qui est en accord avec les données de la littérature qui indiquent que le peptide agoniste a un potentiel d’activation du récepteur PAR-1 beaucoup

Figure 4. Courbe représentative de la mobilisation du calcium intracellulaire dans les SaOS-2 stimulées par le peptide agoniste TRAP-6 (1µM) caractéristique de PAR-1.

Afin de vérifier que le signal calcium induit par la thrombine passe bien par l’activation du récepteur PAR-1, les cellules ont été stimulées par la thrombine et ensuite par TRAP-6. Les cellules SaOS-2 n’ont plus réagi que de façon résiduelle à la seconde stimulation (figure 5) avec une augmentation de calcium intracellulaire quasi nulle (9,1 ± 1,9nM).

Figure 5. Courbe représentative de l’évolution de la [Ca²⁺]i dans les SaOS-2 stimulées par la thrombine (25nM) puis par le peptide agoniste TRAP-6 (1µM).

2.3. R

La thrombine active le récepteur PAR-1 en clivant la queue N-terminale, ce qui requiert que son site protéolytique soit actif. Pour vérifier que les réponses obtenues précédemment étaient bien initiées par la thrombine, son site protéolytique a été bloqué grâce au D-phenylalanyl-L-prolyl-L-arginine-chloromethyl cétone (PPACK). La stimulation des cellules SaOS-2 par un mélange de thrombine et de PPACK n’a donné lieu a aucune mobilisation du calcium intracellulaire, indiquant bien que seule la thrombine était responsable des signaux mesurés dans les expériences précédentes (figure 6).

Figure 6. Evolution de la [Ca²⁺]i dans les cellules de la lignée SaOS-2 stimulées par la thrombine (10nM) pré-incubée avec l’inhibiteur de site actif PPACK (40µg/ml).

2.4. A

PAR-1

Dans le point précédent, il a été montré que le blocage du site actif de la thrombine empêchait toute signalisation. Afin de déterminer l’action temporelle de la thrombine sur le récepteur PAR-1, les cellules ont été stimulées par la thrombine dont l’activité a été très rapidement inhibée par l’ajout de PPACK dans le milieu. Le signal calcium mesuré dans une telle expérience reste identique à celui mesuré dans le cas d’une simple stimulation par la thrombine, indiquant que cette dernière agit par activation ponctuelle et irréversible de son récepteur, lors de son ajout sur les cellules (figure 7).

Figure 7. Courbe représentative de l’évolution de la [Ca²⁺]i dans les SaOS-2 stimulées par la thrombine (10nM) inhibée par un ajout rapide de PPACK (40µg/ml).

De plus, si les cellules sont stimulées par un double ajout de thrombine, la seconde stimulation n’a aucun effet sur les cellules, ce qui indique à nouveau bien l’action unique de la thrombine sur les cellules de la lignée SaOS-2 (figure 8).

Figure 8. Courbe représentative de l’évolution de la [Ca²⁺]i dans les SaOS-2 stimulées deux fois consécutivement par la thrombine (10nM).

2.5. T

PAR-1

L’action de la thrombine étant unique et irréversible, j’ai cherché à déterminer si les cellules pouvaient retrouver une sensibilité à la thrombine et, dans l’affirmative, après combien de temps.

Pour cela, les cellules de la lignée SaOS-2 ont d’abord été stimulées par la thrombine

et la modification de la [Ca²⁺]_i a été enregistrée. Le milieu d’incubation a ensuite été retiré et

ont à nouveau été stimulées par la même concentration en thrombine et l’évolution de la

[Ca²⁺]i a été enregistrée. De telles expériences ont permis de montrer qu’une seconde

stimulation réalisée après 5 minutes induisait une augmentation de la [Ca²⁺]i d’une intensité

limitée à 40% de celle enregistrée lors de la première stimulation. Par contre, après 30 minutes, la seconde stimulation engendrait un signal dont l’intensité était statistiquement identique à celle de la première (figure 9 et table 2).

A

B

Figure 9. Courbe représentative de l’évolution du calcium intracellulaire dans les SaOS-2 stimulées deux fois par la thrombine (10nM), avec lavage et repos des cellules durant (A) 5 minutes ou (B) 30 minutes entre les deux

stimulations.

De façon étonnante, en l’absence de lavage et de remplacement du milieu d’incubation, une nouvelle stimulation avec la thrombine n’induit aucune signalisation calcium dans les cellules (figure 10 et table 2).

A

B

Figure 10. Courbe représentative de l’évolution du calcium intracellulaire dans les SaOS-2 stimulées deux fois par la thrombine (10nM), avec un repos des cellules durant (A) 5 minutes ou (B) 30 minutes entre les deux

stimulations mais sans changement de milieu.