Les sondes fluorescentes

Les mesures de la variation du calcium libre sont réalisées grâce à l’utilisation d’une sonde fluorescente qui se lie au calcium libre intracellulaire.

Les deux sondes utilisées ici, à savoir le fura-2 AM et le fura-red AM possèdent un spectre d’excitation différent suivant qu’elles soient ou non liées au calcium. Ainsi, la longueur d’onde d’excitation maximale du fura-2 libre est de 380nm et du fura-2 couplé au calcium de 340nm. Dans les deux cas, le spectre d’émission est maximal à 520nm (figure 2).

Figure 2. Spectre d’absorption et d’émission de la sonde fura-2

Pour la sonde fura-red, la longueur d’onde d’excitation maximale est de 472nm pour la forme libre et de 463nm pour la forme liée. L’émission est maximale à 660nm (figure 3).

Figure 3. Spectre d’absorption et d’émission de la sonde fura-red

3.2.2. Le principe

L’utilisation de deux longueurs d’onde pour la mesure du calcium intracellulaire présente deux avantages.

Tout d’abord, l’utilisation d’un rapport entre les deux valeurs de fluorescence obtenues permet d’éliminer les effets parasites (flash de lumière, diminution de l’intensité d’émission de la sonde …)

De plus, l’utilisation d’un rapport va permettre de déterminer la concentration exacte en calcium intracellulaire à chaque instant grâce à la formule suivante :

où Kd = constante de dissociation de la sonde avec le calcium R = rapport de fluorescence

Rmin = rapport de fluorescence quand [Ca²⁺]i ~ 0nM Rmax = rapport de fluorescence quand [Ca²⁺]i est maximale

FF380 = fluorescence émise lors de l’excitation à 380nm [Ca²⁺]i est maximale FB380 = fluorescence émise lors de l’excitation à 380nm quand [Ca²⁺]i = 0nM

Pour la mesure de fluorescence dans le cas [Ca²⁺]i ~ 0nM, les cellules ont été incubées dans du tampon HEPES en présence de EGTA (1,9gr/l) et stimulées par de l’ionomycine (1µl/1ml). Pour la mesure dans le cas [Ca²⁺]i maximale, les cellules ont été incubées dans du

tampon HEPES en présence de CaCl2 et stimulées par de l’ionomycine. Un exemple de courbe de calibrage (à 340nm et 380nm) est donné ci-dessous (figure 4).

Figure 4. Courbes caractéristiques obtenues pour le calibrage. Les valeurs utilisées sont notées dans la formule.

3.2.3. L’instrumentation

Les mesures de la variation du calcium intracellulaire ont été réalisées sur le système d’enregistrement d’images développé par Till Photonics (Allemagne) couplé à un microscope, un monochromateur et une caméra.

Les mesures se réalisent comme suit : les lamelles portant les cellules vivantes et adhérentes aux lamelles de verre sont placées dans une chambre d’incubation thermostatique, elle-même fixée sur la platine d’un microscope inversé à fluorescence sur un microscope à inversion. Les cellules ont toujours été observées sous objectif à immersion (100x), grossissement également utilisé pour les mesures.

Un monochromateur crée une onde excitatrice à la longueur d’onde désirée (généralement dans l’ultraviolet ou la lumière visible), qui est dirigée vers les cellules grâce à un miroir dichroïque. Par suite de cette excitation, la sonde émet de la lumière qui, après filtrage autour de la longueur d’onde d’émission maximale, est enregistrée par une caméra CCD. Les images ainsi obtenues sont traitées par le logiciel TillVision. Après définition de la zone de mesure par l’utilisateur, le logiciel calcule l’intensité de la lumière émise dans la région définie, pour chaque image prise au cours de la mesure.

Figure 5. Représentation schématique du lien entre chaque composant de la machine de mesure du calcium intracellulaire.

Le logiciel TillVision présente deux avantages. Tout d’abord, il permet le contrôle de l’émission par le contrôle du monochromateur permettant de générer automatiquement les différentes images. De plus, le logiciel affiche et traite, en temps direct, les images reçues de la caméra. Il est donc possible de suivre les mesures à tout instant et de rectifier ou stopper l’expérience en cas de problème.

Figure 6. Données affichées par l’écran de contrôle de TillVision durant les mesures de la variation du calcium intracellulaire. Les traces des graphiques “courbes d’émission de fluorescence” représentent l’évolution de la fluorescence dans les cellules de la zone de mesure prises isolément. L’image de disposition initiale permet de

s’assurer que le plateau ne bouge pas, en comparaison avec les images de “fluorescence instantanée”.

3.3. LA MESURE DE [CA²⁺]I DANS LES HUVEC STIMULÉES PAR LES SÉRINES PROTÉASES

A l’exception des stimulations par du plasma en coagulation, les mesures de l’évolution du [Ca²⁺]i dans les cellules HUVEC ont été réalisées comme décrites ci-après.

Après 2 ou 3 jours de cultures sur lamelles, comme expliqué ci-dessus, les cellules ont été lavées deux fois avec un tampon HEPES, consistant en 150mM de NaCl, 5mM de KCl, 1mM de MgCl2, 10mM de HEPES, 5mM de glucose, 4mM de glutamine, 0,25% d’albumine de sérum bovin (BSA) et de 1,8mM de CaCl2 (pH = 7,4). Les cellules ont ensuite été chargées avec 1µM de fura-2 acetoxymethyl ester (fura-2 AM) dans le tampon HEPES contenant 1% de BSA, durant 30 minutes à 37°C et 5% de CO2. Après le chargement avec la sonde fluorescente, les cellules ont été incubées 15 minutes supplémentaires dans le tampon HEPES afin d’assurer une dé-esterification complète de la sonde.

Les lamelles de verre portant les cellules chargées avec la sonde fluorescente ont été montées sur une chambre chauffée à 37°C et ouverte placée sur un microscope Nikon Diaphot, et incubées dans le tampon HEPES contenant 1% de BSA. Les agonistes ont été ajoutés directement dans la chambre à l’aide d’une pipette, dilués dans un volume de 100µl de tampon HEPES contenant 1% de BSA.

L’évolution de la fluorescence émise par la sonde fura-2 dans les cellules individuelles sélectionnées a été mesurée à 520nm après excitation à 340nm et 380nm, en utilisant le système d’images vidéo Quanticell.

3.4. LA MESURE DE [CA²⁺]I DANS LES HUVEC STIMULÉES PAR DU PLASMA EN COAGULATION

La mesure de l’évolution du calcium intracellulaire dans ce cas est similaire à celle expliquée précédemment, à la différence que le plasma est fluorescent lors d’une excitation à 340nm ou 380nm dans une longueur d’onde proche du filtre d’émission (520nm). Pour cette raison, la sonde utilisée dans ce cas fut le fura-red qui présente des longueurs d’onde d’excitation à 463nm et 472nm pour une émission à 660nm.

Le chargement des cellules fut réalisé d’une manière identique à ce qui a été expliqué pour le fura-2, à une concentration de 5µM en fura-red. Après dé-esterification, les lamelles de verres portant les cellules ont été placées dans la chambre chauffée à 37°C et incubées avec du plasma appauvri en plaquettes, pré-incubé ou non avec de l’hirudine. La coagulation fut déclenchée par l’ajout de facteur tissulaire soluble mélangé au tampon HEPES.

L’évolution de la fluorescence émise par la sonde fura-red dans les cellules individuelles sélectionnées a été mesurée à 660nm après excitation à 463nm et 472nm, en utilisant le système d’images vidéo TillVision.

3.5. LA MESURE DE [CA²⁺]I DANS LES CELLULES SAOS-2 STIMULÉES PAR LES SÉRINES PROTÉASES

Après 2 jours de cultures sur lamelles, les cellules ont été lavées une première fois avec du tampon PBS et deux fois avec un tampon HEPES. Elles ont ensuite été chargées avec 2µM de fura-2 acetoxymethyl ester (fura-2 AM) dans le tampon HEPES durant 25 minutes à 37°C et 5% de CO2. Après le chargement avec la sonde fluorescente, les cellules ont été incubées 15 minutes supplémentaires dans le tampon HEPES afin d’assurer une dé-esterification complète de la sonde.

Les lamelles de verre portant les cellules chargées avec la sonde fluorescente ont été montées sur une chambre chauffée à 37°C, ouverte et placée sur un microscope Olympus IX51 à inversion, et incubées dans le tampon HEPES. Les agonistes ont été ajoutés directement dans la chambre à l’aide d’une pipette, dilués dans un volume de 100µl de tampon HEPES contenant 1% de BSA.

L’évolution de la fluorescence émise par la sonde fura-2 dans les cellules individuelles sélectionnées a été mesurée à 520nm après excitation à 340nm et 380nm, en utilisant le système d’images vidéo TillVision.