SIGNALISATION INDUITE PAR LA GÉNÉRATION IN SITU DES SÉRINES PROTÉASES FACTEUR XA ET THROMBINE

Après avoir montré que le facteur Xa et la thrombine agissaient par des voies différentes, l’étape suivante consistait à se rapprocher des conditions de coagulation en activant les zymogènes facteur X et prothrombine directement sur les cellules.

6.1. M

Dans la cascade de coagulation, le zymogène facteur X est activé par le complexe formé par le facteur tissulaire et le facteur VIIa. Dans le cadre de nos expériences, nous disposions de deux formes différentes de facteur tissulaire : le rhTF (Henogen) et le sTF (Innovin). Il était donc intéressant de connaître la concentration en rhTF nécessaire pour faire coaguler du plasma appauvri en plaquettes (PPP). La mesure du temps de coagulation du PPP par ajout de rhTF a permis de conclure que 100nM représentaient la concentration plateau au-dessus de laquelle il n’était plus possible de diminuer le temps de coagulation (figure 18). Des manipulations antérieures réalisées par l’équipe du professeur Heemskerk avaient déjà permis de déterminer qu’une concentration de 10pM en sTF permettait d’obtenir un temps de coagulation similaire du plasma appauvri en plaquettes (PPP).

Figure 18. Temps de coagulation du PPP par ajout de facteur tissulaire humain recombinant (rhTF) à diverses concentrations.

6.2. A

X

Dans un premier temps, le facteur X a été activé in situ en ajoutant sur les HUVEC un mélange formé de facteur tissulaire recombinant humain (rhTF), de facteur VIIa et de facteur X. En parallèle, des mesures de la génération du facteur Xa à partir du même mélange ont permis de montrer que 91% du zymogène était activé après 30 secondes. D’une façon similaire à ce qui avait été obtenu pour le facteur Xa, ce mélange a induit la formation de pics répétés de calcium intracellulaire, caractérisé par un délai initial (figure 19).

Figure 19. Courbe représentative de l’évolution du calcium intracellulaire dans les HUVEC stimulées, dans un premier temps, par le mélange formé du facteur tissulaire humain recombinant (rhTF, 100nM), du facteur VIIa (FVIIa, 100nM) et du facteur X (FX, 40nM) et, dans un second temps, par le mélangé formé du facteur Va (FVa,

0,1nM) et de la prothrombine (FII, 10nM).

Dans les expériences présentées ci-dessus, le facteur X était ajouté juste avant la mise du mélange sur cellule. L’activation du facteur X est donc en cours avant cet ajout. Afin de se rapprocher au mieux des conditions réelles d’activation du facteur X, les mêmes expériences ont été répétées en réalisant le mélange sur les cellules de la façon suivante : le complexe rhTF-FVIIa a été ajouté sur les cellules, suivi immédiatement du facteur X. Dans ce cas, aucune différence majeure n’a pu être observée par rapport au cas d’une stimulation par un mélange formé juste avant sa mise sur cellules (figure 20).

Figure 20. Courbe représentative de la mobilisation de calcium intracellulaire dans les HUVEC stimulées par divers agonistes, dans l’ordre noté sur la figure : le complexe formé par le facteur tissulaire recombinant humain (rhTF, 100nM) et le facteur VIIa (FVIIa), le facteur X (FX, 40nM), le complexe formé par le facteur Va

(FVa, 0,1nM) et la prothrombine (FII, 10nM) et la thrombine (10nM)

L’activation du facteur X a également été réalisée par l’utilisation du sTF (Innovin) dans le mélange facteur tissulaire – facteur VIIa, en lieu et place du rhTF. Le signal calcium induit par une telle activation était qualitativement proche de celui obtenu lors de l’utilisation du rhTF (figure 21).

Figure 21. Courbe représentative de la [Ca²⁺]i dans les HUVEC simulées, dans un premier temps, par le mélange composé de facteur tissulaire Innovin (sTF, 10pM), de facteur VIIa (FVIIa, 10pM) et de facteur X (FX,

40nM) et, dans un second temps, par le mélange formé de facteur Va (FVa, 0,1nM) et de prothrombine (FII, 10nM).

Une étude de l’amplitude de la mobilisation de calcium intracellulaire entre les différentes stimulations, soit directement par le facteur Xa, soit par son activation in situ, montre que les valeurs restent proches et statistiquement non différentes (table 6).

104 20 14 Agoniste Δ[Ca2+]i (nM) N FXa (40nM) 166,8 ± 9,7 104 rhTF-FVIIa-FXa (100nM-100nM-40nM) 158,8 ± 9,4 20 rhTF-FVIIa-FX (100nM-100nM-40nM) 143,4 ± 26 36 rhTF-FVIIa + FX (100nM-100nM-40nM) 141,2 ± 11,7 19 sTF-FVIIa + FXa (10pM-10pM-40nM) 148,2 ±14,3 14 sTF-FVIIa + FX (10pM-10pM-40nM) 165,0 ± 10,1 28

Table 6. Amplitude de la réponse calcique induite par le facteur Xa dans différentes situations.

Par contre, le délai d’apparition de la réponse calcique lors d’une génération in situ,

soit par le facteur tissulaire recombinant humain, soit par l’Innovin, était légèrement différent : l’Innovin présentait un délai d’apparition plus court (163,1 ± 15,9 secondes) que le facteur tissulaire humain recombinant (199,2 ± 8,0 secondes). Enfin, parallèlement à ce qui a été observé lors d’une stimulation des cellules endothéliales par le facteur Xa isolé, une majorité des cellules (47,67%) répondaient à l’activation du facteur X sous la forme d’oscillations de calcium, alors que 30,26% des cellules répondaient par une augmentation

soutenue, les 22,07% restant ne subissant pas de modifications de la [Ca²⁺]_i.

6.3. A

Les effets de l’activation de la thrombine par le facteur Xa, en présence du co-facteur Va, ont été mesurés lors des expériences présentées dans le point précédent. On constate ainsi qu’un ajout d’un mélange de prothrombine et de facteur Va dans un milieu en présence de facteur tissulaire, de facteur VIIa et de facteur X(a), provoque une seconde augmentation de calcium intracellulaire, plus élevée que celle induite par le facteur Xa, et dans la quasi totalité

des cellules (94,31%) (figures 19, 20 et 21). L’apparition du signal Ca²⁺ nécessite un délai

moyen de 107,8 ± 5,95 secondes et induit une augmentation de la [Ca²⁺]i de 320,1 ± 50,7nM,

à comparer aux valeurs de la stimulation par la thrombine seule ou après une stimulation préalable avec le facteur Xa (table 7).

Agoniste Δ[Ca²⁺]i (nM) N

Thrombine (10nM) 326,5 ± 14,3 25

Thrombine (10nM) après FXa (40nM) 320,1 ± 50,7 49

FVa-prothrombine (0,1nM-10nM) 361,6 ± 19,0 11

Table 7. Amplitude de la réponse calcique induite par la thrombine dans différentes situations.

Parallèlement, des mesures de génération de thrombine ont indiqué que 99% de la prothrombine était convertie en thrombine après 60 secondes de présence dans le mélange.

Les résultats présentés dans ce chapitre montrent donc que les mono-couches de

cellules HUVEC adhérentes répondent au facteur Xa et à la thrombine générés in situ d’une

7. SÉCRÉTIONS DE CYTOKINES INDUITES PAR LE FACTEUR