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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
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M03043
Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire
Directeur de Thèse : Pr. G. Vassart Co-promoteur: Dr. F. Miot
B-campusErasme
(Duojçl et (Duox2, oj^cfases impCiquées cfans (a génération du perojçyde cf fiydrogène thyroïdien : ^tude de Ceur
rô[e pfiysioCogique et de ùi réguCation de Ceur activité
Thèse présentée en vue de l'obtention du titre de Docteur en Sciences Biomédicales
Rigutto Sabrina
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté de Médecine
Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire
Directeur de Thèse : Pr. G. Vassart Co-promoteur: Dr. F. Miot
ULB-campus Erasme^
,è.uedesSdenœsdelaSa
Œ)uo?(l et (0x107(2, 9\(A(DT0-( oTçydases impCiquées dans [a génération duperoTçyde d’hydrogène thyroïdien : "Etade de (eur
rôCe physioéogique et de [a régulation de leur activité
Thèse présentée en vue de l'obtention du titre de Docteur en Sciences Biomédicales
Rigutto Sabrina Année académique 2009-2010
Composition du jury
Faculté de Médecine, ULB;
Magali Waelbroeck (présidente) Jean-Jacques Body
Michal Svoboda Christophe Emeux
Gilbert Vassart (secrétaire, promoteur) Françoise Miot (co-promoteur)
Experts Etrangers
Corinne Dupuy
Institut Gustave Roussy Villejuif, France
Chantal Daumerie
Cliniques universitaires Saint-Luc Bruxelles, Belgique
Titre de le thèse annexe
Etude de l’implication des microRNAs dans le développement et la différenciation de la thyroïde par l’utilisation de souris invalidées de façon tissu spécifique pour l’enzyme Dicer.
^sutné de Ca thèse annejçe
TITRE: Etude de l’implication des microRNAs dans le développement et la différenciation de la thyroïde par l’utilisation de souris invalidées de façon tissu spécifique pour l’enzyme Dicer
La thyroïde est formée de cellules folliculaires (thyrocytes) produisant les hormones thyroïdiennes et de cellules C à l'origine de la synthèse de calcitonine, une molécule hypocalcémiante. Ces deux types cellulaires ont une origine embryonnaire différente. Les thyrocytes sont formés à partir d'une ébauche thyroïdienne centrale qui se développe à partir de l'endoderme du plancher pharyngé. Les cellules C proviennent des corps ultimobranchiaux, une paire latérale émanant des quatrièmes poches pharyngées. Le développement de la glande thyroïde chez l'homme et la souris se déroule en plusieurs étapes. Il démarre avec l'épaississement de l'endoderme du plancher pharyngé suite à la prolifération cellulaire de cellules destinées à devenir des cellules thyroïdiennes. Ces dernières co-expriment quatre facteurs de transcription: TiTF-1, Foxel, Pax8 et Hhex. Ces cellules forment un bourgeon thyroïdien qui va migrer ventro-caudalement, proliférer et acquérir progressivement une forme bilobée. Lorsqu'il atteint sa position définitive, il fusionne avec les corps ultimobranchiaux. C'est à ce moment que démarre la folliculogenèse. Les gènes spécifiques de la thyroïde sont exprimés et la synthèse de hormones thyroïdiennes peut avoir lieu.
L'inactivation d'un des quatre gènes exprimés précocement par les cellules du bourgeon thyroïdien induit un défaut de développement ou de migration de la glande.
Les microRNAs (miRNA) sont de petits ARNs non codants de 19 à 25 nucléotides modulant l'expression de certains ARN messagers (ARNm) codant pour des protéines. Dans la majorité de cas, cette régulation se fait par une répression de la traduction suite à un appariement imparfait du miRNA avec la partie 3'UTR de l'ARNm cible. Dans une moindre mesure, les miRNAs peuvent également induire une dégradation des ARNm. L'expression d'environ 30%
des gènes serait régulée par des miRNAs. Actuellement, prés de 500 miRNAs ont été identifiés chez l'homme et chez la souris. Un miRNA seul est capable de moduler l'expression de nombreux gènes différents. Les miRNAs endogènes sont obtenus à partir d'ARNs non codants ou d'introns d'ARNs codants. La RNAse III Dicer est une des protéines intervenant dans la maturation du miRNA. Les souris homozygote Dicer'^' meurent vers E7.5. Par contre, l'invalidation tissu-spécifique de l'enzyme permet l'obtention de souris viables. Ces dernières ont permis d'étudier l'implication des miRNAs dans le développement de nombreux tissus différents.
Le but de ce travail est d'analyser l'implication des miRNAs dans les différentes étapes du développement de la glande thyroïde suite à l'invalidation de Dicer. Ces animaux sont obtenus par croisement de souris exprimant le gène de la Cre recombinase dans l'exon 3 du gène Pax8 (qui s’exprime dans la thyroïde, mais aussi dans le rein et une région du cerveau) avec des souris présentant des sites LoxP de part et d'autre du gène Dicer. Ceci permettra l'expression de la Cre recombinase et l'excision de Dicer dans l’ébauche thyroïdienne à E8.5. La limitation de l'expression des miRNAs se fera donc à partir du stade le plus précoce de la thyroïde. Le dével^pement, la migration et la différenciation de la thyroïde des animaux Pax8-Cre\
Dicer seront comparés à ceux de souris sauvages.
^merciements
Je voudrais tout d'abord remercier ks (professeurs ÇiCbert ‘Vassart et Jacques fE. (Dumont pour [eur accueiCau sein de C'I(SJ(BPCM. C^s cinq années se sont dérouCées à une vitesse incroyable et je suis vraiment ravie de (es avoir passées dans cet institut réunissant de nombreuse groupes et de
nombreu^isujets de recberefie différents et passionnants.
Toute ma reconnaissance va à Prançoise !Miot pour son accueiC dans Ce "groupe Duoy^'. Ses encouragements, son soutien, son énergie et sa bonne humeur de tous Ces jours m'ont permis de parvenir au bout de ce travaiC Je n'ai jamais regretté d'avoir intégré cette équipe et c'est avec un pincement au cœur que je m'en vais vers d'autres horizons.
IMerci également à Xavier De De^n pour Ces nombreuses connaissances en biologie moléculaire qu'il m'a transmises. Son avis et ses conseils se sont toujours révélés très préciewç. Je ne pense pas que sans lui mon travail aurait suivi la même orientation.
Je remercie Ce Dr. (BernardCorvikin pour son avis eypert et critique sur mon travail
Merci à Chantal Degraef pour son aide technique précieuse et à (Bernadette (BoumonvUCe pour (a préparation des cultures primaires de thyroïde.
Merci à tous Ces doctorants qui se sont succédés dans notre laboratoire et que j'ai eu Ce plaisir de côtoyer : Dantong Wang, Milutin MiCenhovic, Jing Lin, Agnès (Bumiat, Xatacha Driessens, lelham Haddad, Soethin Wrsteyhe et en particulier, Candice JCoste, l'autre moitié du
"duo blonde" dont Ce calme et l'amitié m'ont été d'un réel soutien depuis son arrivée.
Merci aiv<ipersonnes de ma promotion. Ces '(Bimés 2004", pour leur soutien et leur amitié.
!Nbus avons partagé ensemble de nombreux^ moments pénibles et stressants comme Ces eygmens et Ce concours p(RJA mais surtout, nous avons connu beaucoup de moments drôles et heureuy^Cors de nos pauses de midi, de nos sorties restos, des pendaisons de crémaillère,...
Je remercie ma belle famille et mes amis d'être là pour me faire penser à autre chose qu'au labo.
‘Finalement, merci à mes parents et mon compagnon, Michaël, pour leurs encouragements et leur amour mais aussi pour avoir eu la patience de me supporter dans des moments où je n'étais pas toujours facile à vivre à cause de Cafatigiie et du stress. Merci d'être toujours la pour moi.
l^aSCe cCes matières
^sumé...4
Abréviations...6
I. Introduction...7
1. ÇénéraCités ...7
2. Syntdèse et sécrétion les Hormones thyroïdiennes...8
2.1. L'IODURE... 8
2.2. Lathyroglobulineetlathyroperoxydase... 9
2.3. Lesystèmegénérateurd’H202... 10
2.4. Hypothyroïdiescongénitalesavecdéfautd'organificationdel'iodure...11
2.5. Fonctionsdeshormonesthyroïdiennes... 12
3. ^guûition du métahoCisme thyroïdien ...12
3.1. La TSH ET SON RÉCEPTEUR ... 12
3.2. RÉGULATION DE LA PRODUCTION D'H202 DANS LA THYROÏDE ... 13
4. LafamiCCe des !Nyi(IXPdC oyydoses...13
4.1. DeNoxIÀNOxS... 13
4.1.1. gp91'”'“/N0X2 ... 14
4.1.2. Noxl ... 16
4.1.3. Nox3 ...17
4.1.4. NOX4 ...18
4.1.5. NOX5 ...18
4.2. DUOXI ETDuox2... 19
4.2.1. CLONAGE, STRUCTURE, LOCALISATION ...19
4.2.2. RÉGULATION DE L'EXPRESSION DES ARN MESSAGERS ET DES PROTÉINES DUOX DANS LA THYROÏDE 20 4.2.3. Défautsd'organificationdel'iodureliésauxgènesDUOX... 21
4.2.4. Les PROTÉINES DUOX EXPRIMÉES en DEHORS delathyroïde ...22
4.2.4.1. Rôle des protéines Duox dans les voies respiratoires ...23
4.2.4.2. Rôle des protéines Duox dans le système digestif...24
4.2.4.3. Duox dans C. elegans...24
4.2.4.4. Rôle de Duox dans la fertilisation...25
4.2.5. DUOXAl ET DUOXA2: FACTEURS DE MATURATION RESPECTIFS DE DUOXl ET DUOX2 ... 25
IL Mét/iocCes expérimentales...28
1. Construction des vecteurs d'e^qiression des sI^fKfls...28
2. ‘Extraction d'JLIC^et ...28
3. Cultures ceCCuCaires...29
4. Quantification des transcrits des ‘Duoy^dans Ces (PCCh3 et Ca thyroïde de rat ...29
5. Constructions des plasmides codant pour tes protéines <Duo2C...30
6. Lfansfections ceCCuCaires...31
7. Mesure de Coproduction dLC202...31
8. Cytométrie defCux(EJ4CS)...32
9. (Détection des protéines par‘Western (BCbt... 33
10. Immunoprécipitations... 33
11. Captation diode...34
1
12. Mutagenèse dirigée...34
13. (Production de Centivirus...35
14. PfiospfioryCations des (Duo^a...36
14.1. Parincorporationdephosphoreradioactifinvivo...36
14.2. Parincorporationdephosphoreradioactifinvitro... 36
14.3. Parspectrométriedemasse...37
III. (But du travaiC...38
IV (R^suCtats...39
1. InHiôition de C'ej(pression des protéines Œ)uox.dans (a lignée de tHyrocytes de rat PCCC3 par Ca méthode des siKJiyis...39
1.1. ConstructionsdesvecteursplasmidiquescodantpourlessiRNAs...39
1.1.1. Principe... 39
1.1.2. Sélection DES siRNAs ... 40
1.2. ValidationdessiRNAsparco-expressionavecprotéinesles Duoxencellules CHO... 40
1.3. TransfectiontransitoiredessiRNAsdanslalignée PCCl3... 41
1.3.1. Mesuredelaproductiond'H202 des PCCl3 transfectéestransitoirement...41
1.3.2. Analysedel'expressiondes ARN messagersde Duox 1 et Duox2 par RT-PCR dansles PCCl3 transfectéestransitoirement... 41
1.4. TransfectionstabledessiRNAsdanslalignée PCCl3...42
1.4.1. Productiond'H202 parles PCCl3 exprimantunsiRNA contre Duox...42
1.4.2. Expressiondesprotéines Duoxdanslesclonesde PCCl3 exprimantunsiRNA dirigé CONTRE Duox... 43
1.4.3. Expressiondestranscritsdes Duoxdanslesclonesde PCCl3 exprimantunsiRNA DIRIGÉ CONTRE Duox ...43
1.4.4. Analyse DE LA FONCTION THYROÏDIENNE DANS LES PCCl3 EXPRIMANT LE SIRNA Dl-65 ... 44
1.5. Analysedel'expressionrelativedestranscritsde Duoxl et Duox2 danslalignéede PCCl3 etdansdutissudethyroïdederat... 45
1.5.1. Comparaisondel'expressionde Duoxl et Duox2 dansdeslignéesdethyrocytesderat ET DANS DU TISSU DE THYROÏDE DE RAT PAR RT-PCR...45
1.5.2. Comparaisondel'expressionde Duoxl et Duox2 dansdeslignéesdethyrocytesderat ET dansdutissu DE THYROÏDE DE RAT PAR SOUS-CLONAGE ... 46
1.6. Ré-expressionde Duoxl parl'utilisationdelentivirusdanslesclonesde PCCl3 INVALIDÉS... 47
1.7. ProductiondelentivirusexprimantunsiRNA...48
1.7.1. ValidationdessiRNAsparco-transfectionen CHO... 49
1.7.2. Productiondelentivirus...49
1.7.3. Estimationdu MOI nécessairepourinfecterdesthyrocyteshumainsenculture primaire... 50
2. ^tude de Ca régulation des protéines <Duoj(^en système hétérologue...51
2.1. Reconstitutiond'unsystèmegénérateurd'H202 encellules Cos-7...51
2.2. Utilisationdeprotéines Duoxprésentantunépitope HA en NH2-terminal...51
2.3. L'ACTIVITÉ DE LA PROTÉINE DUOX DÉPEND DE SON ACTIVATEUR HOMOLOGUE ...52
2.4. RÉGULATION DE LA PRODUCTION D'H202 EN RÉPONSE À DIFFÉRENTS AGENTS... 53
2.5. Activationdes Duoxparlecalcium... 53
2.6. Régulation de l’activité enzymatique des protéines Duox par la voie de l’AMP cyclique...55
2.6.1...Analyse de la régulation de l’activité enzymatique des protéines Duox par un ANALOGUE DE L’AMPC ...55
2.6.2. Analyse de la régulation de l’activité enzymatique des protéines Duox par sur expression DE lasous-unité CATALYTIQUE a DE LA PKA... 55
2.7. Régulation de l’activité enzymatique des protéines Duox par la voie des PHOSPHATIDYLINOSITOLS ACTIVANT LA PKC...56
2.8. Activitédesprotéines Duoxexpriméesdanslalignéecellulaire HTori...56
3. T.tuxCe de Ca phosphorylation des protéines (Duoy^en système hétéroCogue...58
3.1. Recherchedesitespotentiellementphosphorylésparla PKA...58
3.1.1. Recherchedephosphorylationsparutilisationd’unanticorpsspécifique... 58
3.1.2. Recherchedephosphorylationsparincorporationdephosphoreradioactif...59
3.1.3. Recherche DE PEPTIDES phosphoryles DANS Duoxl parspectrometriedemasse... 59
3.2. Etudedesmutationsdanslessitesde Duoxl théoriquementphosphorylesparla PKA .60 3.2.1. Analysedel’activitéenzymatiquedessimplesmutants Duoxl...60
3.2.2. Analyse DE LA phosphorylation DES simples MUTANTS Duoxl... 60
3.2.3. Analyse DE L’ACTIVITE ENZYMATIQUE DU double MUTANT Duoxl ... 61
3.2.4. Analyse DE LA PHOSPHORYLATION DU DOUBLE MUTANT Duoxl ...61
3.3. Recherchedesitespotentiellementphosphorylésparla PKC... 61
3.3.1. Recherchedephosphorylationsparutilisationd’unanticorpsspécifique...61
3.3.2. Recherchedephosphorylatiqnsparincorporationdephosphoreradioactif... 62
3.3.3. Phosphorylationinvitrode Duox2 parla PKC... 62
3.4. Etudedesmutationsdanslessitesde Duox2 théoriquementphosphorylesparla PKC . 63 3.4.1. Analysedel’activitéenzymatiquedessimplesmutants Duox2... 63
3.4.2. Analysedelaphosphorylationdessimplesmutants Duox2... 64
3.4.2.1. Par utilisation de l’anticorps anti-sérines phosphorylées par la PKC...64
3.4.2.2. Par phosphorylation in vitro ...64
4. ‘Etude de Ca production de peroxyde d Hydrogène de tüyrocytes Humains en cuCture primaire...65
4.1. REGULATION DE L’EXPRESSION DES PROTEINES DUOX EN REPONSE A LA TSH... 65
4.2. REGULATION DE LA PRODUCTION D’H202 PAR L'IONOMYCINE ET LE PMA ...65
4.3. REGULATION DE LA PRODUCTION D'H202 PAR LE PMA ... 66
4.4. Phosphorylationdesproteines Duox...66
4.4.1. Par UTILISATION D’UN ANTICORPS ...66
4.4.2. Parincorporationdephosphoreradioactif...66
4.5. ExpressiondelaproteineNOXAI... 67
V (Discussion...68
1. Le système générateur d'HzOz des ECCi3...69
2. ^guCation de ['activité de protéines Duoiaen ceduHes Cos-7...72
2.1. REGULATION PAR LE CALCIUM...73
2.2. Régulationparphosphorylationsdépendantesdela PKA... 74
2.3. Régulationparphosphorylationsdépendantesdela PKC...75
2.4. Productionde ROS parlesproteines Duox: H2O2 ou Oz"'?...78
3. ^guCation de ['activité des protéines Duojc dans des cuàures primaires de tHyroïde Humaine...79
4. ConcHusions ...81
(Références...84
Jlnnejçes
3
Résumé
La thyroïde capte et concentre l’iodure afin de produire les hormones thyroïdiennes T3 et T4. L’iodure est capté au pôle basolatéral du thyrocyte par le symporteur Na'^/L (NIS) et transporté jusqu'au pôle apical de la cellule où il est oxydé par la thyroperoxydase (TPO). La forme oxydée de l’iodure se lie à des résidus tyrosyls de la thyroglobuline (Tg), contenue dans la thyroïde, qui couplés donneront naissance à la T3 et la T4. L’iodation et le couplage sont possibles grâce à la thyroperoxydase et à la présence d’un système générateur d’H202. Celui- ci est composé des protéines à sept hélices transmembranaires Duoxl et Duox2 présentant 83% de similitude de séquence entre elles et possédant deux motifs EF-hand ainsi qu’un site de liaison au FAD et quatre sites de liaison au NADPH. Dans la thyroïde humaine, l’ARN messager de Duox2 est plus exprimé que celui de Duoxl. Jusqu'il y a peu de temps, nous n'avions à notre disposition aucun anticorps spécifique de l’une ou l’autre des Duox. Il n'était donc pas possible de déterminer si cette différence d’expression se retrouve au niveau protéique. Les PCC13 sont une lignée de thyrocytes de rat possédant un système générateur d’H202 fonctionnel. Contrairement aux cultures primaires de thyrocytes humains, ces cellules peuvent être transfectées facilement. L’introduction de siRNAs spécifiques de Duoxl ou Duox2 de rat, via des vecteurs plasmidiques, a permis de démontrer que le peroxyde d’hydrogène produit par les PCC13 est principalement généré par Duoxl. En effet, l’inhibition de l’expression de Duoxl est directement corrélée à la diminution de production d’H202.
Cette inhibition n’interfère pas avec d’autres fonctions de la cellule thyroïdierme puisque les cellules invalidées pour Duoxl sont toujours capables de capter l’iodure. De plus, la réintroduction de l’expression de Duoxl par transduction lentivirale permet de restaurer la production de peroxyde d’hydrogène.
Faute d’une maturation correcte des protéines Duox à la membrane plasmique, il a longtemps été impossible de reconstituer un système générateur d’H202 actif par transfection de Duoxl et/ou Duox2 en système hétérologue. En 2006, les protéines activatrices des protéines Duoxl et Duox2, respectivement appelées DuoxAl et DuoxA2, ont été identifiées.
Leur co-expression avec les enzymes Duox permet à ces dernières de migrer à la membrane et d’être actives. La distribution tissulaire des protéines DuoxA est parallèle à celle des Duox.
La découverte des protéines activatrices a permis d’étudier spécifiquement la régulation de l’activité de Duoxl et de Duox2. La production d’H202 de Duoxl est positivement régulée par la voie de l’AMPc via des phosphorylations par la protéine kinase A (PKA). La génération d’H202 de Duox2 est sous le contrôle de la voie des phosphatidylinositols-Ca^"^
conduisant à l’activation de la protéine kinase C (PKC). L’activation de Duox2 est également corrélée à une modification de l’état de phosphorylation de la protéine. Dans les thyrocytes humains, le récepteur de la TSH est couplé aux protéines Gs et Gq/u. La TSH liée à son récepteur est donc capable d’activer la voie de l’AMPc et la voie des phosphatidylinositols- Ca^"^. Dans les thyrocytes humains en culture primaire, l’activation de la PKA et de la PKC mène également à une augmentation de la phosphorylation des protéines Duox.
En conclusion : 1) Duoxl est majoritairement responsable de la production d’H202 dans la lignée de thyrocytes de rat PCC13 ; 2) l’activité de Duoxl humain co-exprimé avec son activateur en cellules Cos-7 est régulée positivement par la voie de l’AMPc via des phosphorylations par la PKA ; 3) l’activité de Duox2 humain co-exprimé avec son activateur en cellules Cos-7 est stimulée par la voie des phosphatidylinositols-Ca^"^ via des phosphorylations par la PKC ; 4) les thyrocytes humains expriment les deux protéines Duox.
La production d’H202 est augmentée suite à l’activation de la voie de l’AMPc et de la voie
des phosphatidylinositoIs-Ca^"^. Les protéines Duox sont phosphorylées au niveau basal et cette phosphorylation est augmentée suite à l’activation de la PKA ou de la PKC.
5
JLSréviations
2-fflDA 2-iodohexanal NADPH Nicotinamide adenine
6-MB-cAMP N^-Monobutyryladenosine-3', dinucleotide phosphate 5'-cyclic monophosphate NIP Numb interacting protein
aa acide aminé NIS Na^/I' symporter
ADN Acide désoxyribonucléique NOX NADPH oxidase
ADNc ADN complémentaire NOXAl NOX activator 1
AIT Apical lodide Transporter NOXOl NOX organizer 1
AMP Adénosine monophosphate nt nucléotide
AMPc AMP cyclique PAF Picric acid-formaldehyde
Anti-PPKA anti-substrat de la PKA pb paire de base
RXX(pS/pT) PBS phosphate buffered saline
Anti-PPKC anti-substrat de la PKC PCR Polymerase chain reaction (R/K)XS(Hyd)(R/K) PIP2 Phosphatidylinositol-4,5-
ARN Acide ribonucléique bisphosphate
ARNm ARN messager PKA Protéine kinase A
ATP Adénosine triphosphate PKAc Sous-unité catalytique a de la
BSA Bovine sérum albumine PKA
DAG Diacylglycérol PKC Protéine kinase C
DIT Diiodotyrosine PLC Phospholipase C
DNAse Désoxyribonucléase PMA Phorbol 12-myristate 13-
dNTP 2'-déoxynucléotide 5'- acétate
triphosphate PRR Prolin rich région
DPI Diphenyliodonium PtdIns(3,4)P2 Phosphatidylinositol-3,4-
DTT Dithiothréitol bisphosphate
Duox Dual oxidase PX Phox homology
DuoxA Duox activator RE Réticulum endoplamic
EDTA Acide éthylènediamine tétra RISC RNA-inducing silencing
acétique complex
EFPl EF binding protein 1 RNAse Ribonucléase
EGTA Ethylene glycol tetra-acetic ROS Reactive oxygen species
acid Rpm Rotation par minute
FACS Fluorescent activated cell RT-PCR Reverse transcription-PCR
sorter RXR 9-cis retinoic acid receptor
FAD Flavine adenine dinucleotide SDS Sodium dodecyl sulfate
FBS Foetal bovine sérum SH3 Src homology 3
FITC Fluorescein isothiocyanate shRNA Small hairpin RNA
HA Hémagglutinine siRNA Small interfering RNA
HRP Horse radish peroxidase SOD Superoxyde dismutase
r cation iodinium T3 3-3’-5 tri-iodothyronine
IP3 Inositol 1,4,5-triphosphate T4 Thyroxine ou 3-3’-5-5’
kb Kilobase tétraiodothyronine
kDa Kilodalton TBG Thyroxin binding globulin
KO Knock-out TBPA Thyroxin binding prealbumin
KRH Krebs-Ringer Hepes Tg Thyroglobuline
LDL Low density lipoprotein TPO Thyroperoxydase
LPO Lactoperoxydase TRH Thyrotropin releasing hormone
miRNA MicroRNA TSH Thyrotropin stimulating
MIT Monoiodotyrosine hormone
MOI Multiplicity of infection Udx-1 Urchin dual oxidase-1
X-I composé iodé
Cô Q
Introduction
LJ J
Glande thyroïde
Figure 1-1 ; Représentation et localisation de la glande thyroïde.
Figure 1-2 : Coupe histologique d’une thyroïde de souris. Le follicule thyroïdien est majoritairement formé de thyrocytes (1) entourant la colloïde (2).
I. Introduction
1. ÇénéraCités
Chez l'homme, la thyroïde est une glande située dans la région cervicale sous-hyoïdienne et pesant 10 à 20 grammes. Elle est composée de deux lobes reliés par un isthme et entourés par une capsule conjonctive (Figure 1-1) (Avisse et al, 2001). Son unité fonctioimelle est le follicule. Ce dernier est formé d’une monocouche de cellules formant un sphère creuse qui délimite un espace riche en protéines, la colloïde, contenant principalement de la thyroglobuline (Tg) (Figure 1-2). Le follicule est composé majoritairement de thyrocytes, cellules polarisées ayant pour rôle de concentrer l’iodure afin de permettre la formation des hormones thyroïdiennes. 11 contient également des cellules C, représentant moins de 0,1% du parenchyme thyroïdien, responsables de la production de la calcitonine, une hormone hypocalcémiante et hypophosphorémiante (Conte-Devoix et al, 2001). Le pôle baso-latéral de ces cellules est en contact avec les vaisseaux sanguins et le tissu conjonctif tandis que le pôle apical est en contact direct avec la colloïde.
Le métabolisme thyroïdien est sous le contrôle de la thyrotropine hypophysaire (TSH) et de son récepteur. La production de TSH est elle-même régulée par la TRH (Thyrotropin Releasing Hormone) produite par l’hypothalamus. Finalement, les hormones thyroïdiennes T3 (3-3’-5 tri-iodothyronine) et T4 (thyroxine ou 3-3’-5-5’ tétraiodothyronine) limitent la production de TSH et de TRH par un système de boucle rétroactive (Figure 1-3). De cette façon, le niveau d’hormone dans le sang reste plus ou moins constant. Libérées dans la circulation sanguine, les hormones thyroïdiennes sont transportées par des protéines plasmatiques. Ces dernières sont principalement la thyroxin binding globulin (TBG), mais aussi la thyroxin binding prealbumin (TBPA) ou transthyrétine, l’albumine et certaines lipoprotéines. Les fractions libres de T3 et T4 dans la circulation représentent respectivement environ 0,3% et 0,02% de la quantité totale d’hormones. La thyroïde produit majoritairement de la T4 alors que l’hormone biologiquement active est la T3. Cette dernière est obtenue par désiodation de la T4 par des désiodinases spécifiques dans les tissus périphériques cibles de l’hormone.
Les hormones thyroïdiennes sont des molécules amphiphiles. Le mécanisme exact permettant l'entrée des hormones dans la cellule n'a pas encore été déterminé. Les récepteurs à
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ExtraceUular milieu
Cytoplasm
Figure 1-4; Représentation schématique du symporteur Na^/I‘ NIS (De La Vieja et al, 2000).
l’hormone T3 sont des récepteurs nucléaires possédant une grande affinité pour l’ADN, même en absence de T3. Ils peuvent former des homodimères ou des hétérodimères avec des récepteurs de la famille des RXR (9-cis retinoic acid receptor). En absence d'hormones thyroïdiennes, les récepteurs fixés à l'ADN lient des co-répresseurs réprimant la transcription du gène. En présence d’hormones thyroïdiennes, un changement conformationnel des récepteurs induit le détachement des co-répresseurs et la liaison de protéines co-activatrices.
La machinerie cellulaire permettant l'expression des gènes peut alors être recrutée (Torresani et al, 2001). De cette manière, les hormones thyroïdiennes contrôlent de nombreuses fonctions comme le développement du système nerveux central, le métabolisme et la croissance.
2. Synthèse et sécrétion des Hormones thyroïdiennes
La synthèse des hormones thyroïdiennes nécessite la présence de quatre éléments à l'interface de la membrane apicale et de la colloïde: l’iodure, la thyroglobuline, la thyroperoxydase (TPO) et un système générateur d’H202-
2.1. L’iodure
Le thyrocyte est une cellule polarisée capable de concentrer l’iodure. Cette particularité est essentielle puisque l’iodure est un oligoélément rare. L’organisme en contient 15 à 20 milligrammes dont la quasi-totalité est concentrée dans la thyroïde. Les apports journaliers recommandés sont de 150 microgrammes par jour pour un adulte.
L’iodure est capté au niveau baso-latérale du thyrocyte par le symporteur Na^/F (NIS) (Caillou et al, 1998). Il s’agit d’une protéine fortement glycosylée possédant treize domaines transmembranaires (Figure 1-4) et dont l'ADN a été cloné à partir d’une lignée de thyrocytes de rat (Dai et al, 1996; Levy et al, 1998). La protéine de rat est composée de 618 acides aminés et la protéine humaine de 643 acides aminés. NIS permet l’entrée concomitante dans la cellule de 2 Na”*^ et 1 F. Cet influx est rendu possible par la formation d’un gradient de concentration de sodium par la pompe NaVK^ ATPase. Le transport de l’iodure peut être bloqué par le perchlorate (C104‘), inhibitem du NIS, ou par l’ouabaïne, inhibiteur de la pompe NaVK^ ATPase. Le transporteur responsable du transport passif de l’iodure au niveau apical du thyrocyte n’est pas déterminé avec certitude. Il pourrait s’agir de la pendrine (Sheffield et al, 1996) ou du AIT (Apical lodide Transporter) (Rodriguez et al, 2002; Lacroix et al, 2004).
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Dans la colloïde, l’iodure est en contact direct avec la Tg. En présence d’H202, la thyroperoxydase, insérée dans la membrane apicale, oxyde l’iodure qui peut alors se greffer aux résidus t3n’osyls de la Tg afin de donner naissance aux monoiodotyrosines (MIT) et diiodotyrosines (DIT). Une seconde oxydation par la TPO permet le couplage des MIT et des DIT afin de former les triiodothyronines et tétraiodothyronines (Figure 1-5). La Tg ainsi iodée est endocytée par micro- ou macropinocytose puis protéolysée afin de libérer les hormones thyroïdiennes T3 et T4 dans la circulation (Figure 1-6).
En excès, l’iodure est capable d’inhiber sa propre organification. Ce phénomène a été baptisé "effet Wolff-Chaikoff, du nom des scientifiques qui l'ont mis en évidence (Wolff et al, 1949). Il est transitoire et disparaît après une période d'adaptation d'environ 48 heures. Il fait intervenir un composé iodé (X-I) provenant de l’oxydation de l’iodure qui pourrait être un lipide iodé, le 2-iodohexadécanal (2-IHDA) (Ohayon, 1994 et al; Panneels et al, 1996). Le mécanisme d’action à l’origine de cette inhibition n’est pas encore clairement établi.
L’utilisation d’antithyroïdiens bloquant la TPO interfère avec l’effet inhibiteur de l’iodure (Van Sande et al, 1973).
2.2. Lathyroglobulineetlathyroperoxydase
La colloïde est composée à 95% de thyroglobuline (Figure 1-6). Il s’agit d’une glycoprotéine formée par un homodimère de deux sous-unités faisant chacune 330 kDa (Figure 1-7). Chaque sous-unité possède 20 sites de N-glycosylation (Malthiery et al, 1987).
La Tg possède 132 résidus tyrosines dont seulement 25 à 30 peuvent être iodés. Lors du couplage des MIT et des DIT, certains sites sont spécifiquement accepteurs ou donneurs (van de Graaf et al, 2001). La Tg portant les hormones thyroïdiennes est endocytée et protéolysée afin de libérer la T3 et la T4. La TSH, via l’activation de la voie de l’AMP cyclique (AMPc), régule positivement l’expression de la Tg (Gérard et al, 1989) et la sécrétion des hormones thyroïdiennes (Corvilain et al, 1994).
La thyroperoxydase, une hémoprotéine de 933 acides aminés située à la membrane apicale du thyrocyte, est l’enzyme catalysant l'oxydation de l'iodure et le couplage des MIT et des DIT. Elle contient un segment transmembranaire et sa partie NH2-terminale baignant dans la colloïde présente 42% de similitude avec la myéloperoxydase. Cette extrémité contient également 5 sites potentiels de N-glycosylation (Libert et al, 1987) ainsi que l'hème lié de façon covalente à l'apoprotéine (Fayadat et al, 1999). La TPO est spécifiquement exprimée
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Figure 1-7: Représentation schématique du dimère de thyroglobuline (van de Graaf et al, 2001).
dans la thyroïde. Son expression est régulée positivement par la TSH et la voie de TAMPc (Van Heuverswyn et al, 1985; Gérard et al, 1989). Les défauts génétiques de la TPO constituent la première cause d’hypothyroïdie congénitale avec défaut d’organification (Bikker et al, 1997).
Le composé 1 est la forme active de la TPO. Il est obtenu suite à l'oxydation par l'H202 de la TPO au niveau du fer de Thème ainsi qu'au niveau d'un des atomes du noyau porphyrique.
Le composé I peut alors oxydé Tiodure en cation iodinium (I^) ou en radical I* permettant Tiodation de la Tg (Virion et al, 1981).
TPO + H2O2 --- ► composé I + H2O
Compose I + T --- ► TPO + T f + Tg-Tyr' --- ► Tg-MIT ou
Composé I + r --- ► Composé II + I*
Composé II + Tg-Tyr --- ► TPO + Tg-Tyr*
I* + Tg-Tyr* --- ► Tg-MIT
Le compose I peut s'isomériser spontanément suite au transfert d'un électron de Tapoprotéine vers le noyau porphyrique. Ce composé n'induit pas Tiodation de la Tg mais catalyse la réaction de couplage par oxydation monovalente du DIT receveur et du MIT ou du DIT donneur (Virion et al, 1985). Certaines données suggèrent que le composé I pourrait également intervenir dans la réaction de couplage qui s'effectuerait à la suite directe de la réaction d'iodation (Taurog et al, 1996).
2.3. Lesystèmegénérateurd’H^O?
En présence d’H202, la TPO catalyse l’oxydation de Tiodure et sa liaison à la Tg (Nunez et al, 1982) (Figure 1-5). L’activité du système générateur d’H202 est régulée positivement par la TSH (Corvilain et al, 1994) et par le calcium (Deme et al, 1985). Les enzymes responsables de la production de peroxyde d’hydrogène, étape limitante de la formation des hormones thyroïdiennes, appartiennent à la famille des NADPH oxydases. Elles sont au nombre de deux
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et ont été baptisées Duoxl et Duox2 (Dual Oxidase) (Dupuy et al, 1999; De Deken et al, 2000). La formation d’H202 est directement liée à la synthèse de NADPH (nicotinamide adénine dinucleotide phosphate) par la voie des pentoses phosphates (Corvilain et al, 1991).
L’effet du Ca^"^ semble être le fruit d’une levée d’inhibition pouvant être la conséquence d’un changement de conformation de l’enzyme ou de la séparation avec un partenaire inhibiteur (Dupuy et al, 1988, Dupuy et al, 1992). Contrairement aux autres NADPH oxydases, les Duox du thyrocyte produisent directement de l’H202 et non pas des anions superoxydes (Dupuy et al, 1989; Dupuy et al, 1991).
NADPH+ 02 + H^ NADPH oxydase^ NADP^ + H2O2
Les différentes caractéristiques des protéines Duox, isolées et identifiées dans notre laboratoire et par le groupe de C. Dupuy, seront décrites plus en détails dans le chapitre relatif aux NADPH oxydases.
Le peroxyde d’hydrogène est capable de traverser les membranes plasmiques et de provoquer divers dégâts oxydatifs à des protéines, des lipides ou des acides nucléiques. Pour se protéger, la cellule thyroïdienne a mis en œuvre des mécanismes de protection mettant en jeu la catalase et la glutathion peroxydase (Ekholm et al, 1997; Song et al, 2007).
2.4. Hypothyroïdiescongénitales avecdéfautd’organificationdel’iodure Un nouveau-né sur 4.000 naît avec une hypothyroïdie congénitale. Environ 15% de ces cas sont causés par des défauts de l’hormonogenèse. Les hypothyroïdies congénitales avec défaut d’organification de l’iodure sont caractérisées par la présence d’un goitre. Le plus souvent, elles sont causées par des anomalies quantitatives ou qualitatives de la TPO, produites par des mutations dans son gène, mais certaines de ces hypothyroïdies sont également le résultat d’un défaut de production de peroxyde d’hydrogène. Le diagnostic d’ime hypothyroïdie avec défaut d’organification se fait par le test de décharge au perchlorate (CIO4') (Nunez et al, 1982). Le patient reçoit, dans un premier temps, un traceur d’iodure radioactif ( 1), puis, après quelques heures, du perchlorate de potassium. En situation normale, l’iodure est rapidement organifié par la TPO et retenu par la Tg. En cas de défaut d’organification, le traceur n'est pas retenu dans la thyroïde, signe qu’il n’a pas été fixé à la Tg. Une autre caractéristique du déficit d’iodation est une augmentation de la concentration de la Tg circulante (Meideros-Neto et al, 2001).
Figure 1-8 ; Représentation schématique d'un récepteur aux hormones glycoprotéiques (Van Durme et al, 2006).
2.5. Fonctionsdeshormonesthyroïdiennes
Les hormones thyroïdiennes régulent le développement, la croissance mais aussi la différenciation des différents tissus. Elles interviennent également dans le maintien de l’homéothermie et diminuent les taux sanguins de LDL (low density lipoprotein) et de cholestérol en favorisant leur dégradation par activation de la synthèse d’enzymes lipogéniques. Par modification de la glycogénolyse et de la gluconéogénèse, elles augmentent la synthèse de glucose. Les hormones thyroïdiennes interviennent aussi au niveau de la synthèse et de la dégradation des protéines. Néanmoins, l’effet sur le catabolisme semble être prédominant. Finalement, elles ont un rôle prépondérant sur le développement du système nerveux central. En cas d’hypothyroïdie détectée à la naissance, un traitement approprié par de la T4 permet de réverser le déficit hormonal (De Nayer et al, 2001).
3. ^é^uCation cCu métaSoCisme thyroïdien
3.1. LaTSH etsonrécepteur
La TSH est une hormone glycoprotéique, tout comme la LH (Lutropin Hormone), la FSH (Follicule-Stimulating Hormone) et la hCG (ChorioGonatropin hormone). Ces hormones sont des hétérodimères formés d’une sous-unité a, commune aux quatre complexes protéiques, et d’une sous-unité P, spécifique de l'hormone. Le récepteur de la TSH est un récepteur à sept hélices transmembranaires couplé aux protéines G (Parmentier et al, 1989). La partie NHa- terminale extracellulaire responsable de la reconnaissance de la TSH est un long domaine peptidique de 394 acides aminés (Figure 1-8).
Chez l’homme, le récepteur de la TSH est couplé aux protéines Gs et Gq/n (Laurent et al, 1987 ; Allgeier et al, 1994). La protéine Gs active l’adénylate cyclase qui produit de F AMP cyclique (AMPc). Ce dernier active la protéine kinase A (PKA). Cette voie de signalisation augmente la sécrétion des hormones thyroïdiennes ainsi que la prolifération des thyrocytes (Van Sande et al, 1983; Roger et al, 1988). La protéine Gq/n active la phospholipase C (PLC) qui clive le PIP2 (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate), conduisant à la formation d'IP3 (inositol-1,4,5-trisphosphate) et de diacylglycérol (DAG). Par sa liaison à son récepteur, l’IPa permet l’augmentation de la concentration en calcium intracellulaire par la libération des stocks de Ca^^ du réticulum endoplasmique, tandis que le DAG est un activateur de la
Figure 1-9 ; Représentation schématique des deux voies de signalisation activées par la TSH et son récepteur.
protéine kinase C (PKC). Cette seconde voie de signalisation augmente l’organification de l’iodure et la synthèse des hormones thyroïdiennes. Les concentrations de TSH activant la voie de l’AMPc ou la voie de la PLC dans les tranches de thyroïdes humaines sont différentes.
La TSH à 1 mU/ml active la génération d'AMPc par l'adénylate cyclase tandis qu'il faut 10 mU/ml de TSH pour stimuler de manière maximale la production d'IPs (Corvilain et al, 1994) (Figure 1-9).
3.2. Régulationdelaproductiond’H^O? danslathyroïde
La régulation de la production de peroxyde d’hydrogène a été étudiée à partir de tranches de thyroïdes humaines et de thyrocytes humains en culture primaire. Elle est augmentée par l’ionomycine, agent augmentant la concentration intracellulaire de calcium, le PMA, activateur de la PKC, et la TSH 10 mU/ml. Inversement, la TSH 1 mU/ml, la forskoline, activateur de l’adénylate cyclase, et le dibutyryl-cAMP, un analogue de l’AMPc, diminuent la génération d’H202 dans les tranches de thyroïdes humaines mais favorisent la sécrétion des hormones thyroïdiennes (Corvilain et al, 1994; Raspé et al, 1991). Ces différentes molécules n'ont pas des effets identiques sur les tranches de thyroïde ou les thyrocytes en culture primaire de toutes les différentes espèces animales étudiées. En effet, la stimulation aiguë des tranches de thyroïdes de chien par la forskoline ou la TSH 1 mU/ml induit une augmentation de la génération d’H202 (Corvilain et al, 1991; Raspe et al, 1991). La TSH 1 mU/ml augmente également la production de peroxyde d’hydrogène dans les tranches de thyroïdes de porc, tandis que la forskoline n’a pas d’effet marqué lors de stimulation aiguë de ce système (Corvilain et al, 2000). La stimulation, pendant plusieurs jours, par de la TSH 1 mU/ml de cultures primaires de thyroïdes de chien ou de porc augmente la production d'H202. Cette augmentation est inhibée lorsque les cellules sont incubées en présence d'un inhibiteur de la synthèse protéique, suggérant que la stimulation de la génération de peroxyde d'hydrogène induite par la TSH passe par une activation de l'expression protéique d'un composant du système générateur d'H202 (Raspe et al, 1995; Carvalho et al, 1996; Wang, thèse de doctorat).
4. La famiCCe des oxyc^ases
4.1. De Noxl À Nox5
La famille des NADPH oxydases (Nox) regroupe différentes enzymes capables de produire des espèces dérivées de l’oxygène (ROS) dans des conditions physiologiques. Elles catalysent
Figure 1-10; Schéma général du transport des électrons par les NADPH oxydases.
