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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Jacoby, M. (2008). Etude des effets d'une invalidation conditionnelle de SHIP2, d'INPP5E et de PIPP chez la souris (Unpublished doctoral dissertation).

Université libre de Bruxelles, Faculté des Sciences – Sciences biologiques, Bruxelles.

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DBM 00706

____________________________ /

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

Faculté des Sciences

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Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire

Faculté de Médecine

Promoteur : Stéphane Schurmans

Etude des effets d’une invalidation conditionnelle de SHIP2, d’INPPSE

et de PIPP chez la souris

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade légal de Docteur en Sciences

Monique Jacoby

Année académique 2007-2008

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

Faculté des Sciences

Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire

Faculté de Médecine

Promoteur : Stéphane Schurmans

Etude des effets d’une invalidation conditionnelle de SHIP2, d’INPPSE

et de PIPP chez la souris

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade légal de Docteur en Sciences

Monique Jacoby

Année académique 2007-2008

Tout d’abord je voudrais remercier Stéphane Schurmans pour m’avoir accueillie dans son laboratoire et pour l’autonomie qu’il m’a laissée dans la réalisation de cette thèse.

Je n’oublierai pas non plus son optimisme et sa disponibilité pour m’aider dans les manips, que ce soit pour les nombreux tests de tolérance au glucose en présence de notre centrifugeuse si discrète, ou encore les innombrables clones de cellules ES repiqués pendant les congés de Noël.

Je remercie également les professeurs Dumont et Vassart pour m’avoir accueillie au sein del’IRIBHM.

Un grand merci à David Pérez-Morga pour la réalisation des expériences de microscopie électronique, son enthousiasme contagieux et sa patience pour m’aider au confocal. Je remercie Serge Schiffmann et Laetita Cuvelier pour leur aide lors des expériences d’hybridation in situ, et Alban de K.erchove et Stéphanie qui m’ont aidée à réaliser le fameux recombineering et m’ont permis de profiter de l’eau bénite et des ondes magiques du Campus Erasme. Merci aussi à Christophe Emeux pour ses conseils.

Je tiens à remercier Dominique Fokan, Isabelle Bar, Bernard Robaye, Annick Brandenburger et Marie-Jeanne Putterie pour leurs conseils, leur soutien technique et leur gentillesse.

Ensuite Je voudrais remercier les membres de mon labo qui ont été d’un grand

soutien par leurs conseils scientifiques et leur bonne humeur. Merci à Eileen qui, toujours

soucieuse de ma zen-attitude, déborde de créativité pour me distraire avec ses films

d’animation. Un grand merci à Stéphanie pour sa gentillesse et pour toutes les manips

qu’elle a réalisées pour moi. Je remercie Valérie (toujours généreuse de son temps pour

m’aider au FACS), Eléonore (pour sa sympathie), Virginie (mon coach histo préféré), Eva,

Serge, Séverine et Yoann.

Je remercie vivement les membres et ex-membres du « café du commerce » pour avoir égayé mes journées avec leur support moral et culinaire: Marianne pour son humour et sa complicité, Selena, pour nos fous rires et tes nombreux coups de main en échange de quelques chocolats, Isa pour son amitié ainsi que ses délicieux muffins. Merci à Charlotte, Céline et Chiat pour leur gentillesse et leur bonne humeur.

Je remercie également Dorothée ainsi que le mystérieux Hakim qui a agrémenté mes journées de poèmes et de blagues.

Merci à Cathy et aussi à Mélanie, qui est toujours prête à collaborer avec moi.

Merci aux souris.

Et pour finir, j’aimerais remercier mes parents et Claude pour leurs encouragements

et leur soutien tout au long de cette thèse.

I INTRODUCTION 1

1.1 Les phosphoinositides 1

1.1.1 Le métabolisme des phosphoinositides 1

1.1.2 Les inositol et phosphatidylinositol 5-phosphatases 1

1.2 SH1P2 3

1.2.1 Expression et spécifîcité de substrat de SH1P2 3 1.2.2 Structure protéique et partenaires d’interaction de SH1P2 3

1.2.3 Rôles de SH1P2 en cellules 3

1.2.3.1 Rôle de SHIP2 dans la sensibilité à l'insuline 4

1.2.3.1.1 Action de l'insuline dans l'organisme 4

1.2.3.1.2 La voie de signalisation de l'insuline 4 1.2.3.1.3 Rôle de SHIP2 dans la voie de signalisation de l'insuline 6 1.2.4 Etude du rôle de SH1P2 chez la souris et chez le rat 7

1.2.5 Le syndrome métabolique 8

1.2.5.1 L’obésité 9

1.2.5.1.1 Facteurs impliqués dans le développement de l’obésité 9 1.2.5.1.2 Action de l’insuline et de la leptine niveau de l’hypothalamus 10 1.2.5.1.3 Rôle potentiel de SHIP2 dans la signalisation de l’insuline et/ou de la

leptine 10

1.2.5.2 Le diabète de type 2 11

1.2.5.2.1 Pathogenèse du diabète de type 2 11

1.2.5.2.2 Rôle potentiel de SHIP2 dans le développement d’une résistance à

l’insuline et du diabète de type 2 12

1.3 INPP5E 13

1.3.1 Structure protéique 13

1.3.2 Spécifîcité de substrat 14

1.3.3 Profil d’expression et localisation subcellulaire d’INPPSE 14

1.3.4 Rôles d’INPPSE en cellules 15

1.3.4.1 « Arborisation » des fibroblastes suite à une surexpression d’INPPSE 15

1.3.4.2 Rôle dans la prolifération cellulaire 15

1.3.4.3 Hydrolyse du Ptdlns(3,5)P2 dans les adipocytes 3T3-L1 16 1.3.4.4 Régulation négative de la phagocytose en réponse à la stimulation du FcyR

dans les macrophages 16

1.3.5 Rôle d’INPPSE dans la prise de nourriture chez le rat 16

1.3.6 Les ciliopathies 17

1.3.6.1 Symptômes et causes des ciliopathies 17

1.3.6.2 Structure du cil 17

1.3.6.3 Formation du cil et transport intraflagellaire 18

1.3.6.4 Rôles du cil 19

1.4 PIPP 21

1.4.1 Structure et spécifîcité de substrat 21

1.4.2 Profil d’expression et localisation subcellulaire 21

1.4.3 Rôle de PIPP dans l’élongation des neurites en réponse au NGF dans les

cellules PC12 21

II BUT DU TRAVAIL 23

III MATÉRIELS ET MÉTHODES 24

111.1 Génération des vecteurs de ciblage par recombineering 24 111.1.1 Criblage radioactif d’une banque de phages X d’ADN génomique de souris24

III. 1.1.1 Sondes 24

III. 1.1.2 Criblage radioactif de la banque génomique 24

III. 1.2 Recombineering 25

III. 1.2.1 Outils pour l’utilisation de la méthode de recombineering 25

III. 1.2.2 Recombineering 26

111.2 Génération des souris 28

111.2.1 Préparation des fibroblastes embryonnaires de souris (PËFs) 28

111.2.2 Electroporation des cellules ES 28

111.2.3 Criblage des cellules ES par PCR « long template » et classique 29 111.2.4 Analyse des clones de cellules ES par Southern Blot 29

111.2.4.1 Digestion de l’ADN 29

111.2.4.2 Electrophorèse et transfert sur membrane de nitrocellulose 30 111.2.4.3 Hybridation de la membrane avec une sonde radioactive 30

111.2.5 Caryotypage des cellules ES 30

111.2.6 Agrégation des cellules ES recombinantes avec des embryons sauvages au

stade morula 31

111.2.6.1 Superovulation et préparation des embryons 31 111.2.6.2 Agrégation des cellules ES avec les embryons et réimplantation dans des

femelles pseudogestantes 31

111.3 Analyse phénotypique 31

111.3.1 Conditions d'élevage et régimes alimentaires des souris 31

111.3.2 Génotypage des souris 32

111.3.3 Induction de la recombinase Cre inductible au tamoxifène 32

111.3.4 Analyse de l’ARN par RT-PCR 32

111.3.5 Analyse de l’expression d’INPP5E par hybridation in situ 33

111.3.5.1 Sonde 33

111.3.5.2 Préparation des coupes et hybridation 33

111.3.6 Mise en évidence du locus coeruleus chez les souris SHIP2 A/A par

hybridation in situ 33

111.3.7 Analyse de l’ARNm des souris PIPP A/A par Northern Blot 33

111.3.8 Détection des protéines par Western Blot 34

111.3.8.1 Extraction protéique à partir de cellules 34 111.3.8.2 Extraction protéique à partir de tissus 34

111.3.8.3 Dosage protéique 34

111.3.8.4 Electrophorèse des protéines et transfert sur membrane de nitrocellulose ou

PVDF 34

111.3.8.5 Immunodétection 35

111.3.9 Analyse des interactions protéiques par co-immunoprécipitation 35 111.3.10 Mesure de l’activité 5-phospatase de SHIP2 et d’INPP5E 35

II1.3.10.1 Immunoprécipitation 36

111.3.11 Tests de tolérance au glucose et à l’insuline 36

111.3.12 Dosage de la leptinémie 37

111.3.13 Coloration du squelette au bleu alcian et au rouge alizarin 37

111.3.14 Histologie 37

111.3.14.1 Fixation des tissus et enrobage en paraffine 37 111.3.14.2 Coloration des coupes histologiques à l'hématoxyline-éosine 37 111.3.14.3 Coloration des coupes de foie au Trichrome de Masson 38 111.3.14.4 Détection du cil primaire et d’INPPSE sur des coupes de rein par

immunohisto fluorescence 38

111.3.15 Immunocytofluorescence 38

111.3.15.1 Détection du cil primaire et d’INPPSE par immunocytofluorescence 38 111.3.15.2 Détection du centrosome par immunocytofluorescence 39 111.3.16 Observation des cils par microscopie électronique 39 111.3.17 Analyse du pourcentage de fibroblastes embryonnaires (PEFs) ciliées après

stimulation par différents agents. 40

111.3.18 Analyse du pourcentage et du nombre de cellules exprimant la GFP par

cytométrie de flux 40

111.3.19 Détection de Phospho-Akt (Ser473) dans les cellules surexprimant 1NPP5E

sauvage ou mutée (MORM) par cytométrie de flux 40

111.3.20 Détection de Phospho-Akt (Ser473) par ELISA après stimulation des PEFs

au PDGF 41

111.3.21 Mesure de la prolifération des PEFs 1NPP5E +/+ et A/A par le protocole

3T3 41

111.3.22 Analyse de la mortalité cellulaire chez les PEFs 1NPP5E +/+ et A/A 41

111.3.23 Analyses statistiques 41

111.3.24 Alignement des séquences d’acides aminés d’INPPSE délétés dans le

syndrome MORM 42

IV RÉSULTATS 43

IV. 1 Génération des vecteurs de ciblage 43

IV.1.1 Structure des vecteurs de ciblage 43

IV.1.2 Génération des vecteurs de ciblage pour SH1P2,1NPP5E et PIPP 44

1V.2 Génération des souris floxées 45

IV.2.1 Electroporation des vecteurs de ciblage dans les cellules ES 45

IV.2.2 Criblage des clones de cellules ES 45

IV.2.2.1 Criblage des clones de cellules ES par PCR 45 IV.2.2.2 Vérification des clones de cellules ES positifs après PCR par Southern Blot46

IV.2.2.3 Caryotypage des clones de cellules ES 46

IV.2.2.4 Séquençage des sites loxP et FRT dans l’ADN des clones de cellules ES

sélectionnés pour la génération des souris 46

IV.2.3 Agrégation des cellules ES recombinantes avec des embryons au stade

morula et obtention des souris 46

IV.3 Analyse du phénotype des souris 47

IV.3.1 SH1P2 47

IV.3.1.1 Vérification de l’invalidation de SH1P2 chez la souris 47 IV.3.1.2 Etude des effets de l’inactivation totale de SHIP2 48 IV.3.1.2.1 Analyse du poids, de la prise de nourriture et de la leptinémie 48

IV.3.1.2.2 Analyse du métabolisme du glucose 49

IV.3.1.3 Etude des effets de l'inactivation spécifique de SH1P2 dans les neurones 50 1V.3.1.3.1 Analyse du poids, de la prise de nourriture et de la leptinémie 51

IV.3.1.3.2 Analyse du métabolisme du glucose 51

IV.3.1.4 Etude des effets d’une inactivation spécifique de SHIP2 dans les cellules P du

pancréas 52

IV.3.1.4.1 Analyse du poids, de la prise de nourriture et de la leptinémie 52

IV.3.1.4.2 Analyse du métabolisme du glucose 53

IV.3.1.5 Etude des effets de l’induction de l’inactivation ubiquitaire de SHIP2 après 6

semaines de régime riche en graisses 53

IV.3.1.5.1 Analyse du poids, de la prise de nourriture et de la leptinémie 54

IV.3.1.5.2 Analyse du métabolisme du glucose 55

IV.3.2 INPP5E 55

IV.3.2.1 Vérification de l’invalidation d'INPP5E chez la souris 55 IV.3.2.2 Analyse des effets de l’inactivation totale d'lNPP5E chez la souris 56

IV.3.2.2.1 Aspect des souris INPP5E A/A 56

IV.3.2.2.2 Analyse histologique 57

IV.3.2.2.3 Analyse du squelette 57

IV.3.2.3 Analyse des effets d'une inactivation partielle d'INPP5E chez les souris

hétérozygotes A/+. 58

IV.3.2.4 Etude de l’expression d'INPP5E chez l’embryon de souris. 58

IV.3.2.4.1 Immunohistochimie 59

IV.3.2.4.2 Hybridation in situ 59

IV.3.2.5 Etude du rôle d'INPP5E dans le cil primaire des fibroblastes embryonnaires

de souris 59

IV.3.2.5.1 Génération de fibroblastes embryonnaires de souris et vérification de

l’expression d'ENPP5E dans ces cellules 60

IV.3.2.5.2 Présence du cil chez les fibroblastes embryonnaires et localisation

subcellulaire d'INPP5E dans ces cellules 60

IV.3.2.5.3 Activation d’Akt en réponse au PDGF 61

IV.3.2.5.4 Prolifération des fibroblastes embryonnaires de souris 61

IV.3.2.5.5 Perte du cil en réponse au sérum 63

IV.3.2.6 Analyse des cils rénaux des embryons invalidés pour INPP5E par

microscopie confocale et électronique 64

IV.3.2.6.1 Pourcentage de cellules ciliées et localisation d'INPP5E dans les tubules

rénaux. 64

IV.3.2.6.2 Etude de la structure et de la morphologie des cils rénaux par

microscopie électronique. 64

IV.3.2.6.3 Analyse des cils primaires des fibroblastes embryonnaires de souris INPP5E A/A et +/+ par microscopie électronique à balayage. 66 IV.3.2.7 Résultats préliminaires sur les effets d’une invalidation totale d'INPP5E chez

la souris adulte. 66

IV.3.2.7.1 Analyse du poids des souris 67

IV.3.2.7.2 Analyse histologique 68

IV.3.2.8 Etude du rôle de la mutation d'INPP5E dans une famille de patients atteints

du syndrome MORM. 69

IV.3.2.8.1 Activité catalytique de la protéine INPP5E mutée 69 IV.3.2.8.2 Localisation subcellulaire des formes sauvages et mutées d'INPP5E après

transfection dans les cellules HEK293 70

IV.3.2.8.3 Activation d’Akt et survie cellulaire 71

IV.3.2.8.4 Etude des effets de la mutation associée au syndrome MORM sur les

interactions d'INPP5E avec deux partenaires protéiques potentiels: p85a et 14-3-372

73

IV. 3.3 PIPP 74

IV. 3.3.1 Vérification de l’invalidation de PIPP chez la souris 74

V DISCUSSION 75

V.l SHIP2 75

V. 1.1 Effets de l’inactivation totale de SHIP2 chez les souris SHIP2 A/A et

comparaison avec le phénotype des souris SHIP2 -/- de Sleeman et al. 75

V. I. I. I Résistance à l’obésité 75

V. 1.1.2 Tolérance au glucose 76

IV. 1.2. Recherche des tissus impliqués dans le phénotype des souris SHIP2 A/A 77

V. 1.1.3 Résistance à l’obésité 77

V. 1.1.4 Tolérance au glucose 80

V. 1.2 Effets de l’induction de l’inactivation de SHIP2 chez des souris adultes

soumises à un régime riche en graisses. 81

V.2 INPP5E 82

V.2.1 Rôle d’INPP5E chez la souris 82

V.2.1.1 Effets de l’invalidation totale d’INPPSE 82

V.2.1.2 Rôle d'INPPSE au niveau du cil primaire 83

V. 2.1.2.1 Localisation subcellulaire d’INPP5E 83

V.2.1.2.2 Stabilité du cil primaire 83

V.2.1.2.3 Morphologie du cil primaire 85

V.2.1.2.4 Signalisations médiées par le cil primaire et prolifération cellulaire 87 V.2.1.2.5 Hypothèse concernant le rôle d’INPP5E au sein du cil primaire 88 V.2.1.3 Effets de l'invalidation conditionnelle d'INPP5E chez la souris adulte 88

V.2.2 Rôle d'INPP5E chez l'humain 90

V.2.2.1 Etude d'une mutation dans le gène d’INPP5E associée au syndrome MORM

chez l'humain 90

V.2.2.1.1 Effets de la mutation MORM sur la fonction d’INPP5E 91 V.2.2.1.2 Causes de la perte de fonction d’lNPP5E suite à la mutation MORM 91 V.2.2.2 Différences entre le phénotype observé chez les souris invalidées pour

INPP5E et les anomalies détectées chez les patients atteints du syndrome MORM. 93 V.2.2.3 Implication potentielle d'INPP5E dans d'autres maladies humaines 96

V.2.2.3.1 Le syndrome de Bardet-Biedl 96

V.2.2.3.2 La délétion subtélomérique 9q34 96

V.2.2.3.3 Le syndrome de Joubert 97

V.3 PIPP 98

VI BIBLIOGRAPHIE 99

VII ARTICLES 115

Résumé

Les phosphoinositides (PI) sont impliqués dans de nombreux processus biologiques cellulaires, tels que la régulation du cytosquelette d'actine, le trafic vésiculaire membranaire et les voies de signalisation médiées par des récepteurs membranaires. Le métabolisme des phosphoinositides est un processus hautement régulé par un ensemble de Pl-kinases et Pl- phosphatases. Des mutations dans ces enzymes sont associées à des maladies tels que le syndrome de Lowe, le diabète de type 2, les désordres bipolaires et le cancer.

SHIP2 (SH2 domain-containing inositol polyphosphate 5-phosphatase type 2) est une PtdIns(3,4,5)P3 5-phosphatase qui est impliquée dans le métabolisme du glucose par son action régulatrice sur la cascade de signalisation de l’insuline, ainsi que dans le contrôle de l’obésité induite par un régime riche en graisses. Au cours de ce travail, nous avons généré des souris permettant une inactivation conditionnelle de cette enzyme. A l’aide de ce nouvel outil nous avons pu confirmer le rôle physiologique de SHIP2 dans le contrôle du métabolisme du glucose, ainsi que l’effet bénéfique de son inactivation sur la prise de poids sous régime riche en graisses. Nos résultats montrent également que l’inactivation spécifique de SH1P2 dans les neurones n’entraîne pas de résistance à l’obésité sous régime riche en graisses, et que son inactivation spécifiquement dans les cellules (3 du pancréas conduit à une légère augmentation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose.

Par ailleurs, nous avons aussi généré des souris invalidées pour deux autres 5-

phosphatases de phosphoinositides dont le rôle in vivo n’était pas encore élucidé: INPP5E

(Inositol polyphosphate 5-phosphatase E) et PIPP (Proline-rich inositol polyphosphate 5-

phosphatase). Alors que les souris invalidées pour PIPP sont viables et ne présentent pas

d’anomalies apparentes, l’invalidation totale d’INPP5E conduit à une mortalité

embryonnaire ou périnatale. Cette mortalité est associée au développement de nombreuses

anomalies caractéristiques de ciliopathies, tels que des kystes rénaux, des anomalies

cérébrales et des défauts squelettiques. Ensembles, nos résultats indiquent qu’INPP5E joue

un rôle dans la stabilité du cil primaire, une organelle émergeant du côté apical de certains

types cellulaires, qui Joue un rôle essentiel dans l’initiation de différentes voies de

signalisation. L’invalidation inductible d’INPP5E chez la souris adulte a conduit au

développement d’un phénotype similaire à celui des modèles murins du syndrome de

Bardet-Biedl (BBS), une ciliopathie humaine caractérisée notamment par la présence d’une

obésité et d’une dystrophie rétinienne. Finalement, nous avons participé à l’étude de

mutations dans le gène INPP5E humain, qui ont été identifiés chez des patients atteints de

ciliopathies comme le syndrome MO RM (Mental Retardation, Truncal Obesity, Retinal

Degeneration and Micropenis) et le syndrome de Joubert.

phosphatidylinositol (Ptdins) est phosphorylé sur les résidus hydroxyl en position D3, D4 et D5 de son anneau inositol pour former les 7 autres phosphoinositides. Les flèches indiquent les possibilités de conversion d’un phosphoinositide vers im autre. Les flèches en pointillé indiquent des réactions qui ont été mises en évidence in vitro, mais dont l’importance dans les cellules vivantes n’est pas claire.

DAG, diacylglycérol.

Introduction

I Introduction

1.1 Les phosphoinositides

1.1.1 Le métabolisme des phosphoinositides

Les phosphoinositides ne représentent qu’une fraction minoritaire des phospholipides membranaires, mais leur métabolisme est très actif et hautement régulé (Pendaries et al, 2003). Parmi les phosphoinositides, le phosphatidylinositol (Ptdlns) est le plus abondant dans les cellules de mammifères (environ 10% de tous les glycérophospholipides cellulaires). Le Ptdlns peut être phosphorylé de manière réversible sur les résidus hydroxyle en position D3, D4 et D5 de son anneau inositol. Les différentes combinaisons de phosphorylation du Ptdlns permettent ainsi la formation des sept autres phosphoinositides (figure 1).

Les différents phosphoinositides sont impliqués dans des processus variés, tels que la régulation du cytosquelette d'actine, le trafic vésiculaire membranaire et les voies de signalisation médiées par des récepteurs membranaires. En effet, de nombreuses protéines possèdent des domaines d’interaction avec les phosphoinositides, ce qui permet aux phosphoinositides de recruter ces protéines à la membrane (Sasaki et al, 2007). De cette façon, la production ou la dégradation d’un phosphoinositide spécifique dans un compartiment cellulaire bien défini régule le recrutement auprès de leur site d’action des protéines liant ce phosphoinositide.

Les enzymes impliquées dans le métabolisme des phosphoinositides peuvent être classées en Ptdlns-kinases et en Ptdins-phosphatases, selon qu’elles catalysent l’ajout ou le retrait d’un phosphate du cycle inositol. Etant donné que les phosphoinositides sont impliqués dans de nombreuses voies de signalisation intracellulaires, des mutations au niveau des Ptdlns-kinases ou Ptdins-phosphatases peuvent perturber ces voies de signalisation et conduire à différentes maladies (tableau 1) (Krauss et Haucke, 2007).

1.1.2 Les inositol et phosphatidylinositol 5-phosphatases

Chez les mammifères, la famille des inositol et phosphatidylinositol 5-phosphatases

comporte actuellement dix enzymes différentes, capables d'hydrolyser le phosphate en

position D5 du cycle inositol des inositides et phosphoinositides. Ces enzymes se

distinguent par la présence de différents motifs protéiques, mais elles présentent une forte

homologie au niveau de leur domaine catalytique d’activité 5-phosphatase. Selon leur

spécificité de substrat, les 5-phosphatases ont été classées en quatre catégories (figure 2)

(De Mattéis et al, 2002):

PI kinases

P1(3)K PllOa-5 PtdIns(4,5)P2 Cancer (P 110a)

PI(3)K-C2a-7 Ptdins (autres?)

Vps34 Ptdins Trouble bipolaire

PI(4)K PI(4)K Ua-3 Ptdins Trouble bipolaire

PI(4)K nia-3 Pdins

PI(5)K PIK-fyve PtdIns(3)P Dystrophie coméenne

mouchetée de François- Neetens

PIP(4)K PIP(4)Ka-Y PtdIns(5)P

P1P(5)K PIP(5)Ka-Y PtdIns(4)P

PI phosphatases

3-phosphatases PTEN1,2 PtdIns(3,4)P2,

PtdIns(3,4,5)P3

Cancer, Maladie de Cowden

MTMl PtdIns(3)P, PtdIns(3,5)P3 Myopathie myotubulaire MTMRl-8 PtdIns(3)P, PtdIns(3,5)P3 Maladie de Charcot-

Marie-Tooth type 4B1 (MTMR2)

4-phosphatases Sac 1-3 PtdIns(4)P

Synaptojanine 1,2 PtdIns(4)P?

Type I,II PtdIns(3,4)P2

5-phosphatases Synaptoj anine 1,2 PtdIns(4,5)P2, et d’autres Trouble bipolaire.

Syndrome de Down

OCRL PtdIns(4,5)P2 Syndrome

oculocérébrorénal de Lowe

SKIP PtdIns(4,5)P2

PIPP PtdIns(3,4,5)P3

SHIPl PtdIns(3,4,5)P3 Leucémie myéloïde,

Maladie de Paget?

SHIP2 PtdIns(3,4,5)P3 Diabète de type II

INPP5E PtdIns(3,4,5)P3

5-phosphatase typeü PtdIns(3,4,5)P3

Tableau 1: Enzymes impliquées dans le métabolisme des phosphoinositides (Krauss et Haucke, 2007).

Vps34, human homologue of yeast Vps34p; MTMl, myotubularin; MTMRl-8, MTMl-related proteins; OCRL, oculocerebrorenal syndrome of Lowe; Pdtins, Phosphatidylinositol; PI, phosphoinositide; PI(3)K, phosphatidylinositol 3- kinase; PI(4)K, phosphatidylinositol 4-kinase; PI(5)K, phosphatidylinositol 5-kinase; PIP(4)K, phosphatidylinositol phosphate 4-kinase; PIP(5)K, phosphatidylinositol phosphate 5-kinase; PIPP, proline-rich inositol polyphosphate 5- phosphatase; PTEN, phosphatase and tensin homologue; SHIPl-2, SH2-containing inositol phosphatases 1 and 2; SKIP, skeletal muscle and kidney enriched phosphatase.

Type 1:

D

Type II: I

I I

I

II

I 1 MM OCRL

I I I I I I II Synaptojanine 1 (synjl)

I I I I II II Synaptojanine 2 (synJ2)

Il 11 1111 ~n PIPP (pibSpa)

I 1 1 Lm sKip (pps)

Type III: I I I I I I I SHIPl (inppSd)

U I I 11 III SHIP2 (inppll)

Type IV: Il 11 I 11 INPP5E (inpp5e)

□

r^—1 domaine 1—ISACl

1—1 domaine riche 1—1 en prolines

r—^ domaine 1—1 SKICH

□

1—1 domaine 1—ICAAX

1—1 domaine 1—ISH2

1—1 domaine 1—ISAM

Figure 2: Comparaison et classification des 5-phosphatases. Les phosphatidylinositol et inositol 5-phosphatases sont classées selon leur spécificité de substrat en 5-phosphatases de type I (substrats hydrosolubles uniquement), type II (substrats hydro- et liposolubles), type III (enzymes à domaine SH2 ayant des substrats hydro- ou liposolubles phosphorylés en position D3 du cycle inositol) et type IV (substrats liposolubles uniquement). Le domaine catalytique d’activité 5-phosphatase est commun à toutes les 5-phosphatases, mais elles diffèrent par la présence d’autres domaines protéiques.

GAP, Guanosine triphosphatase-activating protein; SAM, Stérile alpha motif; SKICH, SKIP carboxyl homology;

SH2, Src homology 2.

invalidées maladies humaines

5-phosphatase de type I Létal

5-phosphatase de type II Anomalies testiculaires

OCRL Pas d’anomalies évidentes Syndrome oculocérébrorénal de Lowe

Synaptojanine 1 Défauts dans la signalisation neuronale et mort périnatale

Trouble bipolaire. Syndrome de Down

Synaptqjanine 2

PIPP

SKIP

SHIPI Hyperplasie et prolifération des cellules myéloïdes, infiltration des poumons, diuée de vie diminuée

Leucémie myéloïde. Maladie de Paget?

SHIP2 Résistance à l’obésité induite par régime riche en graisses,

hypersensibilité à l’insuline

Diabète de type 2, Hypertension

INPP5E

Tableau 2: Rôle des inositol et phosphatidylinositol 5-phosphatses chez la souris et chez Vhumain.

OCRL, oculocerebrorenal syndrome of Lowe; PIPP, proline-rich inositol polyphosphate 5-phosphatase; SHIPl-2, SH2-containing inositol phosphatases 1 and 2; SKIP, skeletal muscle and kidney enriched phosphatase.

Introduction

> La 5-phosphatase de type I, qui hydrolyse uniquement les substrats hydrosolubles Ins(l,4,5)P3 et Ins(l,3,4,5)P4.

> Les 5-phosphatases de type II, qui hydrolysent à la fois des inositol phosphates et des phosphoinositides.

> Les 5-phosphatases de type III, qui ont un domaine SH2 et qui hydrolysent les inositol phosphates et phosphoinositides ayant un phosphate en position D3 du cycle inositol.

> La 5-phosphatase de type IV, qui hydrolyse uniquement des substrats liposolubles.

Le domaine catalytique des 5-phosphatases est caractérisé par deux motifs hautement conservés XGDXN(FA^)R et P(A/S)W(C/T)DRIL, séparés généralement de 20 à 25 acides aminés (Majerus et al, 1999). Ces deux motifs sont essentiels pour la fonction enzymatique des 5-phosphatases, et des mutations ponctuelles au niveau de ces motifs suffisent pour conduire à une diminution importante, voire une abolition totale de l’activité catalytique (Ijun et al, 2003, Wada et al, 2001, Blero et al, 2001, Commun! et al, 1996, Jefferson et al, 1996). Malgré des spécificités de substrat parfois redondantes, ces enzymes jouent des rôles bien spécifiques dans l’organisme et se distinguent notamment par leur distribution tissulaire, leur localisation subcellulaire et leurs partenaires d’interactions protéiques. Dès lors, l’inactivation des différentes 5-phosphatases chez la souris, ainsi que des mutations dans leurs homologues humains conduisent à des maladies très variées (tableau 2).

Alors que dans les cas des gènes SHIPl et SHIP2, les souris invalidées présentent un phénotype qui est en accord avec l’effet de leur mutation chez l’homme, ce n’est pas le cas du gène OCRL. En effet, chez l’humain, des mutations dans le gène OCRL conduisent à la maladie de Lowe, caractérisée par une cataracte congénitale bilatérale, une acidose des tubules rénaux proximaux, un retard mental et un retard de croissance. Par contre, les souris invalidées pour ce gène ne présentent aucun de ces symptômes, malgré im profil d'expression similaire chez les deux espèces (Jânne et al, 1998). Par la suite, l’invalidation conjointe de OCRE et de la 5-phosphatase de type II a montré que l’invalidation d’un seul membre de la famille des 5-phosphatases pouvait être compensée par d’autres 5-phosphatases. En effet, l’invalidation de OCRL ne conduit donc à aucun phénotype apparent chez la souris, et l'inactivation de la 5-phosphatase de type II génère uniquement des anomalies testiculaires. Cependant, l’invalidation simultanée de ces deux enzymes est létale au stade embryonnaire, suggérant que ces deux enzymes pourraient avoir des fonctions redondantes dans certains tissus, ce qui expliquerait la compensation de l’une par l’autre dans les souris invalidées pour un seul de ces deux gènes (Jânne et al, 1998).

2

1 SH2 1 1 catalvtiaue 1 1 PJo-riche 1 ISAM!

A A A

V V? V V

FcyRIIB CAP Arap3

pl30C“ APS Filamine

SHIPl Cbl Shc

Vinexine JIPl

Intersectine 1

Figure 3: Domaines protéiques et partenaires dHnteraction de SHIP2. Le domaine SH2 de SHIP2 interagit avec le motif ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) du récepteur FcyRIIB (Muraille et al, 2000) et avec plSO^^®® (Prasad et al, 2001). Dans les plaquettes sanguines, SHIP2 s’associe à SHIPl via son domaine SH2 (Giuriato et al, 2003).

SHIP2 interagit avec la Vinexine via sa région C-terminale (Patemotte et al, 2005). Le motif

NPXY de SHIP2 joue un rôle dans son interaction avec Shc (Prasad et al, 2002). La

localisation de SHIP2 aux renflements membranaires est médiée par son interaction avec la

filamine (Dyson et al, 2001). SHIP2 interagit avec JIPl (JNK-interacting protein 1) via son

domaine riche en prolines et module l’activation de JNK par le complexe MLK3/JIP1 (Xie et

al, 2008a). Le domaine riche en prolines de SHIP2 interagit également avec Intersectinel (Xie

et al, 2008b). Le domaine SAM de SHIP2 interagit avec le domaine SAM de Arap3

(Raaijmakers et al, 2007). Les domaines de SHIP2 impliqués dans l’interaction avec APS et

Cbl ne sont pas clairement identifiés.

Introduction 1.2 SHIP2

1.2.1 Expression et spécifîcité de substrat de SHIP2

SHIP2 (SH2-domain containing inositol 5-phosphatase de type 2; gène inppll) a été identifié comme étant une 5-phosphatase qui hydrolyse le Ptdlns(3,4,5)P3 produit par la PI3-kinase pour former du PtdIns(3,4)P2 (Pesesse et al, 1998, Ishihara et al, 1999). Il présente une forte homologie avec SHIPl. Alors que SHIPl est essentiellement exprimé au niveau du système hématopoïétique, SHIP2 est exprimé de manière relativement ubiquitaire, notamment au niveau du cerveau, du foie, du cœur et du muscle squelettique (Schurmans et al, 1999).

1.2.2 Structure protéique et partenaires d’interaction de SHIP2

Outre son domaine catalytique d'activité 5-phosphatase, SHIP2 possède plusieurs motifs protéiques qui lui permettent d'interagir avec d'autres protéines (Schurmans et al,

1999) (figure 3):

> Un motif SH2 (Src homology 2), qui permet une interaction avec des résidus tyrosine phosphorylés.

> Une région riche en prolines, pouvant interagir avec des domaines SH3.

> Un motif NPXY, qui peut être reconnu par des domaines PTB (Phospho-tyrosine binding) lorsqu'il est phosphorylé sur tyrosine.

> Un domaine SAM (Sterile-alpha motif), susceptible d'interagir avec d'autres domaines SAM.

Les partenaires d'interaction de SHIP2 comprennent diverses protéines intervenant notamment dans la réponse cellulaire à l'insuline: les protéines CAP (c-Cbl-associated protein) et Cbl (Vandenbroere et al, 2003), les protéines APS (adapter protein with Pleckstrin homology and SH2 domains) (Onnockx et al, 2008), et la protéine Shc (Habib et al, 1998, Gagnon et al, 2003). SHIP2 s'associe également avec plusieurs protéines impliquées dans l'organisation du cytosquelette, tels que pl30^“ (Prasad et al, 2001), Arap3 (Raaijmakers et al, 2007), la filamine (Dyson et al, 2001), et la vinexine (Patemotte et al, 2005). Par ailleurs, SHIP2 s’associe au récepteur FcyRIIB dans les lymphocytes B (Muraille et al, 2000), et une interaction entre SHIPl et SHIP2 a été mise en évidence dans les plaquettes sanguines, où ces deux protéines sont coexprimées (Giuriato et al, 2003).

1.2.3 Rôles de SHIP2 en cellules

Les expériences de surexpression ou d’inhibition de SHIP2 en cellules indiquent que SH1P2 est impliqué dans la régulation du cytosquelette d’actine, l’adhésion et l’étalement cellulaire (Dyson et al, 2001, Prasad et al, 2001, Prasad et al, 2005, Patemotte et al, 2005). Elle joue également un rôle dans la stimulation des cellules du système

3

i

Figure 4: Voie de signalisation de IHnsuline. La liaison de l’insuline à son récepteur conduit

au recrutement des protéines 1RS et à l’activation de la PI3-kinase. Le PI(3,4,5)P3 produit par

la P13-kinase permet le recrutement et l’activation d’Akt et des PKC atypiques (JX, ce qui

conduit à la stimulation de la synthèse de protéines et de glycogène et à la translocation à la

membrane de vésicules contenant GLLfT4. L’activation du complexe CAP-Cbl conduit

également à la translocation à la membrane de vésicules contenant GLUT4. D’autre part, le

récepteur à l’insuline recrute Shc, qui va activer Grb2. L’activation de Grb2 conduit à

l’activation des MAP-kinases suite à l’activation de SOS, Ras, Raf et des MAPKK.

Introduction immunitaire (Muraille et al, 2000, Wang et al, 2004, Leung et al, 2007), le stress oxydatif (Zhang et al, 2007), ainsi que la réponse à des facteurs de croissance, dont le PDGF (Artemenko et al, 2007), le NGF (Aoki et al, 2007), l’EGF (Pesesse et al, 2001) et à l'insuline (Ishihara et al, 1999). Dans le cadre de cette thèse, nous nous intéressons plus particulièrement au rôle de SH1P2 dans la sensibilité à l’insuline.

1.2.3.1 Rôle de SHIP2 dans la sensibilité à l'insuline 1.2.3.1.1 Action de l'insuline dans l'organisme

L'insuline est une hormone qui joue un rôle déterminant dans l'homéostasie énergétique en régulant le métabolisme du glucose et des lipides (Saltiel et Kahn, 2001).

Elle est sécrétée par les cellules P du pancréas en réponse à des signaux hormonaux et à une concentration élevée de nutriments dans le sang. Parmi ces signaux, la glycémie constitue le régulateur principal de la sécrétion d’insuline. Les autres sécrétagogues tels que les acides gras libres, les acides aminés ou encore le peptide GLP-1 (glucagon-like-peptide-1 ) servent de potentiateurs et requièrent le dépassement d’un certain seuil de glycémie avant que leurs effets ne soient enclenchés (Muoio et Newgard, 2008).

Les principaux tissus cibles de l’insuline sont le foie, le tissu adipeux et le muscle squelettique. Au niveau du tissu adipeux et du muscle squelettique, l'insuline stimule la captation du glucose et sa mise en réserve sous forme de lipides ou de glycogène. Au niveau du foie, l’insuline inhibe la synthèse de glucose endogène et d'acides gras et elle stimule la synthèse de glycogène. En dehors des repas, une sécrétion basale et continue d’insuline permet ainsi de moduler la production de glucose endogène par le foie, alors qu’une sécrétion importante stimulée par l’augmentation du taux de glucose dans le sang permet le stockage rapide et massif du glucose exogène suite à un repas.

Par ailleurs, l’insuline agit sur des récepteurs centraux situés au niveau de l'hypothalamus, où elle Joue un rôle dans l’inhibition de la gluconéogenèse hépatique (Obici et al, 2002) et la diminution de la prise alimentaire (Plum et al, 2006). Au niveau des cellules endothéliales des vaisseaux sanguins, l’insuline stimule la synthèse de monoxyde d’azote (NO) et favorise la vasodilatation (Vicent et al, 2003). Finalement, au niveau des cellules P du pancréas, l’insuline semble jouer un rôle dans la sensibilité au glucose et l’augmentation de la masse des cellules P (Otani et al, 2004).

1.2.3.1.2 La voie de signalisation de l'insuline

Au niveau cellulaire, la liaison de l'insuline à son récepteur conduit à une autophosphorylation sur tyrosines de celui-ci, ce qui permet l'activation de différentes voies de signalisation qui médient les effets de l'insuline, dont l'activation de la PI3-kinase, l’activation du complexe CAP-Cbl et des MAP-kinases (figure 4).

4

> Activation de la voie de la PI3-kinase:

Le récepteur à l'insuline recrute et phosphoryle les protéines adaptatrices 1RS (Insulin receptor substrate). Celles- ci vont à leur tour recruter la PI3-Icinase (Phosphatidyl inositol 3-kinase), qui génère du Ptdlns(3,4,5)P3 à partir de son substrat, le Ptdlns(4,5)P2.

Le PtdIns(3,4,5)P3 ainsi formé permet le recrutement à la membrane d’Akt et des PKC (Protein kinase C) atypiques PKC^A,, les rapprochant ainsi de la kinase PDKl (Phosphoinositide-dependant kinase 1) qui les active par phosphorylation.

En aval d’Akt se trouve notamment la GSK3(3 (Glycogène synthase kinase 3P), qui est phosphorylée et inactivée par Akt. Ceci permet de lever l'inhibition exercée par la GSK3P sur la glycogène synthase, et donc de favoriser le stockage du glucose sous forme de glycogène. D'autre part, l'inactivation de la GSK3P conduit à l'activation du facteur de transcription eIF2B conduisant à la synthèse protéique. Akt active également mTOR (Mammalian target of rapamycin), qui stimule la croissance et la prolifération cellulaire via l'activation de la kinase p70*^'‘ et du facteur d'initiation 4E-BP1 (Proud 2006). De plus, Akt phosphoryle des facteurs de transcription, dont ceux de la famille Forkhead (Foxo) impliqués dans l'inhibition de la gluconéogenèse hépatique, la prolifération des cellules P du pancréas ainsi que dans la modulation de l'expression de certains neurotransmetteurs au niveau du cerveau (Nakae et al, 2008).

Les PKC atypiques PKCÇ^^, ainsi que Akt jouent un rôle dans la translocation à la membrane du transporteur de glucose GLUT4 dans le tissu adipeux et le muscle squelettique, permettant ainsi l'entrée de glucose dans ces cellules. Au niveau du foie, les PKCÇ/X, stimulent la glycolyse et la synthèse d'acides gras en activant le facteur de transcription SREBP-1 (Sterol-regulatory element binding protein-1) (Farese et al, 2005)

> Activation du complexe CAP-Cbl:

L'activation du complexe CAP-Cbl est une deuxième voie de signalisation impliquée dans la translocation à la membrane plasmique de GLUT4 en réponse à l’insuline au niveau du tissu adipeux et du muscle squelettique (Saltiel et Kahn, 2001).

Suite à une stimulation par l'insuline, la protéine APS se lie au récepteur à l'insuline activé,

ce qui permet le recrutement des protéines CAP et Cbl (Ahn et al, 2004). Après

phosphorylation de Cbl par le récepteur de l’insuline, le complexe CAP-Cbl est ciblé vers

les radeaux lipidiques où il interagit avec la flotilline. A ce niveau, Cbl recrute le complexe

formé par CrkII (CT 10 regulator of kinase II) et C3G (Crk SH3-binding Guanine

Nucleotide-releasing Protein). Le facteur d’échange nucléotidique C3G va activer la

GTPase TC 10, ce qui entraîne une polymérisation de l’actine favorisant la translocation à la

membrane du transporteur de glucose GLUT4.

Insuline O

i

Figure 5: Rôle de SHIP2 dans la voie de signalisation de IHnsuline. SHIP2 régule négativement l’activation de Akt, de la GSK3P, de la PKO. et la translocation à la membrane de GLUT4 en hydrolysant le PI(3,4,5)P3 formé par la PI3-kinase en réponse à l’insuline.

L’interaction de SHIP2 avec APS diminue le recrutement du complexe CAP-Cbl et augmente

sa propre activité vis-à-vis du PI(3,4,5)P3. En interagissant avec Shc, SHIP2 pourrait diminuer

le recrutement de Grb2 par Shc.

> Activation des MAP-kinases:

L'activation des MAP-kinases (Mitogen-activated protein kinases) en réponse à l'insuline peut se faire via les protéines 1RS, qui s'associent à Grb2 et conduisent au recrutement du facteur d’échange nucléotidique SOS (Son of sevenless). Ce dernier va activer Ras, qui active à son tour la kinase Raf permettant la phosphorylation de la MAP- kinase kinase (MEK). Celle-ci active finalement les MAP-kinases ERKl et ERK2, induisant la synthèse protéique et l'expression de gènes impliqués dans la différenciation ou la prolifération cellulaire. L'activation de cette voie des MAP-kinases se fait également via des protéines de la famille Shc recrutées au niveau du récepteur à l'insuline. Tout comme les protéines 1RS, les protéines Shc peuvent recruter Grb2 et activer de cette manière la voie des MAP-kinases.

1.2.3.1.3 Rôle de SHIP2 dans la voie de signalisation de l'insuline

Des études de surexpression de SHIP2 dans différentes lignées cellulaires, dont les adipocytes 3T3-L1 (Wada et al, 2001), les myotubes L6 (Sasaoka et al, 2001), les cellules CHO-IR (Blero et al, 2001) et les cellules InsEl (Grempler et al, 2007a) ont montré que SH1P2 pouvait réguler négativement la réponse à l’insuline dans ces cellules, d’une part via son activité enzymatique, et d’autre part via des interactions avec certains acteurs de cette voie de signalisation (figure 5).

Ainsi, grâce à son activité PtdIns(3,4,5)P3-phosphatase, SHIP2 régule négativement l'activation des protéines de la voie de signalisation de l'insuline situées en aval du PtdIns(3,4,5)P3. La surexpression d'une protéine SHIP2 sauvage entraîne une diminution de la phosphorylation et de l’activation de Akt, de la GSK3P et une diminution de la synthèse de glycogène. La phosphorylation de la PKCA,, ainsi que la translocation à la membrane de GLUT4 sont également diminuées suite à la surexpression de SHIP2. Par contre, lorsqu’une protéine SHIP2 catalytiquement inactive est surexprimée dans les mêmes cellules, on observe l’effet inverse, à savoir une augmentation de la réponse à l’insuline. L'activité catalytique de SHIP2 est donc essentielle pour la régulation de la cascade de signalisation de l’insuline en aval du PtdIns(3,4,5)P3. D’autre part, le fait que la surexpression d’une protéine SHIP2 aussi bien sauvage que mutée n’a aucun effet sur l’activation des protéines situées en amont du PtdIns(3,4,5)P3, à savoir la phosphorylation du récepteur à l’insuline, la phosphorylation des 1RS et l’activité de la PI3-kinase, confirme que les effets observés sont dûs à l'hydrolyse du PtdIns(3,4,5)P3 par SHIP2.

D'autre part, dans certains types cellulaires, la surexpression de SHIP2 inhibe

l'activation des MAP-kinases en réponse à l'insuline, et ceci indépendamment du fait si son

activité catalytique est intacte ou non (Ishihara et al, 1999, Blero et al, 2001, Sasaoka et al,

2003). L’association de SH1P2 avec la protéine Shc pourrait être responsable de cet effet.

Type de souris Tolérance au glucose

Sécrétion d’insuline en réponse au glucose

Tolérance à l’insuline

Activation de Akt en réponse

l’insuline

Auteurs

Inactivation/Inhibition de SHIP2

Souris invalidées (délétion exons 19-29)

-

Clément et

al, 2001 Souris hétérozygotes

(délétion exons 19-29)

Augmentée Augmentée Augmentée

Clément et

al, 2001 Souris invalidées

(délétion exons 1-18)

Normale Normale Augmentée dans le

muscle squelettique et le foie

Sleeman et al, 2005 Surexpression

transitoire de SH1P2 muté dans le foie des souris diabétiques db/db

Augmentée Diminuée Augmentée Normale dans le tissu adipeux et le muscle squelettique Augmentée dans le foie

Fukui et al, 2005

Surexpression transitoire de SH1P2 muté dans le foie des souris diabétiques KKAy

Augmentée Normale dans le

muscle squelettique Augmentée dans le foie

Grempler et al, 2007

Surexpression de SH1P2

Surexpression Diminuée transitoire de SH1P2

sauvage dans le foie des souris db/+

Augmentée Normale Normale dans le tissu adipeux et le muscle squelettique Diminuée dans le foie

Fukui et al, 2005

Surexpression Diminuée ubiquitaire de SH1P2

Augmentée Diminuée Diminuée dans le tissu adipeux, le muscle squelettique et le foie

Kagawa et al, 2008

Tableau 3: Comparaison des souris ayant soit une inactivation, soit une surexpression de SHIP2

pour différents paramètres traduisant la sensibilité à Finsuline. La tolérance au glucose reflète

l’efficacité de captation du glucose par les tissus périphériques. Elle est analysée en mesurant

révolution de la glycémie après administration de glucose. La tolérance à l’insuline désigne la

diminution de la glycémie suite à l’administration d’ime certaine dose d’insuline.

En effet, SHIP2 pourrait entrer en compétition avec Grb pour la liaison à Shc, ce qui diminuerait le recrutement de Grb2 et donc l'activation des MAP-kinases en aval de Grb2.

Finalement, il a été montré récemment que SHIP2 pouvait réguler négativement l'activation du complexe CAP-Cbl en réponse à l'insuline (Onnockx et al, 2008). En effet, SHIP2 s'associe avec APS et empêche l'interaction de APS avec Cbl en inhibant la phosphorylation sur tyrosine de APS induite par l'insuline. L'interaction avec APS en revanche augmente l'activité 5-phosphatase de SHIP2 vis-à-vis du PtdIns(3,4,5)P3. Cette interaction entre APS et SHIP2 leur confère donc à chacun un potentiel de régulation négative de la voie de l'insuline.

1.2.4 Etude du rôle de SHIP2 chez la souris et chez le rat

Afin d'étudier le rôle de SHIP2 chez la souris, plusieurs modèles de souris transgéniques ou invalidées ont été générés (tableau 3). L'étude de ces souris a permis de montrer que le rôle de SHIP2 dans la sensibilité à l'insuline ne se limite pas aux expériences sur les cellules en culture, mais que SHIP2 joue également un rôle dans la sensibilité à l'insuline in vivo chez la souris. D’autre part, l’inactivation chez la souris a permis de révéler un rôle de SH1P2 dans la prise de poids et l'obésité.

Deux types de souris invalidées pour SHIP2 ont été publiés à ce jour. Les premières souris invalidées pour SHIP2 meurent dans les 3 jours suivant leur naissance dans un contexte d'hypoglycémie sévère (Clément et al, 2001). Chez ces souris, l'expression hépatique des gènes codant pour les enzymes PEPCK (Phosphoenolpyruvate carboxy- kinase) et glucose-6-phosphatase, qui sont impliquées dans la production de glucose, est diminuée. De plus, une augmentation de la sensibilité à l'insuline a été mise en évidence chez les souris hétérozygotes pour SHIP2. Ces résultats indiquent que SH1P2 joue un rôle de régulateur négatif de la réponse à l'insuline chez la souris. Cependant, l'inactivation de SHIP2 chez ces souris provient de la délétion des exons 19 à 29 de SHIP2, ce qui a accidentellement inactivé le gène Phox2a adjacent à SHIP2 (Clément et al, 2004). Phox2a code pour un facteur de transcription neuronal exprimé au cours du développement embryonnaire, et dont l'inactivation est létale chez la souris (Morin et al, 1997). Comme les effets potentiels de l'invalidation de Phox2a sur l'homéostasie glucidique ne sont pas clairs, il est impossible de déterminer quelle part du phénotype de ces souris provient de l'inactivation de SHIP2.

Par la suite, Sleeman et al. ont généré des souris invalidées pour SHIP2 chez

lesquelles les exons 1 à 18 de SHIP2 ont été délétés, ce qui laisse le gène Phox2a intact

(Sleeman et al, 2005). Le phénotype de ces souris diffère de celui des premières souris

ayant une inactivation conjointe de SH1P2 et de Phox2a. En effet, ces souris sont viables et

elles présentent un squelette facial aplati. Sous un régime pauvre en graisses, elles ont une

Introduction tolérance au glucose et à l'insuline normale, malgré qu'une augmentation significative de la phosphorylation de Akt en réponse à l'insuline ait été mise en évidence dans le foie et dans le muscle squelettique. D’autre part, ces souris ont une taille et un poids réduits et présentent une importante diminution de la leptinémie. La leptine est une hormone sécrétée par le tissu adipeux en quantité proportionnelle à la masse adipeuse de l’organisme, et qui a un effet anorexigène au niveau du cerveau. De plus, lorsqu’elles sont soumises à un régime riche en graisses, les souris invalidées pour SHIP2 deviennent moins obèses et moins insulinorésistantes que les souris contrôles.

Plus récemment, Kagawa et al. ont généré des souris transgéniques surexprimant SHIP2 de manière ubiquitaire (Kagawa et al, 2008). Le phénotype de ces souris est en accord avec un rôle de SHIP2 dans la sensibilité à l’insuline et dans la prise de poids. En effet, ces souris ont une tolérance au glucose et à l'insuline réduites et, sous un régime pauvre en graisses, on observe une augmentation de leur poids par rapport aux souris contrôles. Dans le tissu adipeux, le muscle squelettique et le foie, la phosphorylation d’Akt en réponse à l'insuline est diminuée. L'expression de certaines enzymes hépatiques est également altérée (glucose-6-phosphatase, PEPCK et glucokinase), ce qui provoque une diminution de la synthèse de glycogène. Comme la surexpression de SHIP2 n’a pas d’effet sur la structure ou le contenu en insuline des îlots pancréatiques, le résultat observé semble provenir d’un effet de SHIP2 sur la réponse à l’insuline dans les tissus périphériques.

Il est également intéressant de noter que l’inhibition de SHIP2 spécifiquement au niveau du foie, via la surexpression d’une protéine catalytiquement inactive, conduit à une amélioration de la sensibilité à l’insuline dans des modèles murins de diabète de type 2 (Fukui et al, 2005, Grempler et al, 2007b). Dans les lignées de souris diabétiques db/db et KKA^, la tolérance au glucose est significativement améliorée quatre jours après injection d’adénovirus ciblant le foie et codant pour la protéine SHIP2 mutée. Inversement, la surexpression au niveau du foie d’une protéine SHIP2 sauvage diminue la sensibilité à l’insuline des souris sauvages db/+. De plus, l’inactivation de SHIP2 chez le rat diabétique nourri par un régime riche en graisses (High-fat-fed rat) conduit à une augmentation de la sensibilité à l’insuline (Buettner et al, 2007). En effet, l’injection intrapéritonéale d’oligos antisens dirigés contre l’ARNm de SHIP2 diminue l’expression de SHIP2 au niveau du muscle squelettique et du foie, et provoque une augmentation de la tolérance à l’insuline au lendemain de l’injection.

1.2.5 Le syndrome métabolique

Les études du rôle de SHIP2 chez la souris ont montré que SHIP2 jouait un rôle dans l’obésité et l’insulinorésistance, deux caractéristiques du syndrome métabolique chez l’humain. Le syndrome métabolique désigne un ensemble de pathologies métaboliques

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étroitement liées, dont le diabète de type 2, l'hypertension, l'obésité viscérale et la dyslipidémie (Reilly et Rader, 2003).

1.2.5.1 L’obésité

1.2.5.1.1 Facteurs impliqués dans le développement de l’obésité

De nombreux facteurs, génétiques et environnementaux, sont impliqués dans le développement de l’obésité. Celle-ci consiste dans une augmentation de la masse adipeuse, surtout au niveau viscéral, et survient suite à un déséquilibre entre la prise de nourriture et les dépenses énergétiques de l’organisme.

L'augmentation de la disponibilité de nourriture riche en énergie et la diminution d'exercice physique sont des facteurs environnementaux qui favorisent l’obésité.

Cependant, les études de jumeaux mono- et dizygotiques estiment l’héritabilité de l’obésité entre 60 et 70% (O’Rahilly et Farooqi, 2006). D’après les expériences d'invalidation ou de surexpression génique chez la souris, les gènes impliqués dans la régulation du poids peuvent être classés selon leur fonction en quatre catégories (McPherson, 2007):

> La régulation moléculaire de la prise alimentaire au niveau de l'hypothalamus et du tronc cérébral par des signaux provenant notamment du tissu adipeux et du tube digestif

> La régulation de la différenciation des adipocytes et du stockage des graisses.

> La régulation de l'activité physique.

> La thermogenèse basale et postprandiale.

Des polymorphismes associés au développement de l’obésité chez l’humain sont retrouvés

dans des gènes appartenant aux différentes catégories : Le gène de la leptine, impliqué dans

la régulation du comportement alimentaire et des dépenses énergétiques ; le gène PPARy,

qui Joue un rôle dans la différenciation des adipocytes; ainsi que les gènes UCPl-3

(Uncoupling protein 1-3), impliqués dans la régulation de la thermogenèse et des dépenses

énergétiques dans le tissu adipeux et le muscle squelettique. Les rares défauts

monogéniques connus actuellement pour causer une obésité chez l'humain, sont par contre

tous liés à des défauts dans les voies de signalisation hypothalamiques, et ont des effets

profonds sur la satiété et la prise alimentaire. Il s'agit de cinq gènes de la même voie de

signalisation: la leptine, le récepteur de la leptine, la pro-opiomélanocortine (POMC), la

proconvertase 1 (PCI) et le récepteur 4 de la mélanocortine (MCR4). La leptine est sécrétée

par le tissu adipeux et stimule la S5mthèse du neurotransmetteur POMC au niveau du

cerveau. Celui-ci est clivé par PCI pour fonner notamment l’a-MSH (a-melanocyte-

stimulating hormone), qui réduit la prise de nourriture en liant son récepteur MC4R

(Froguel et Boutin, 2001). Ainsi, d'un point de vue génétique, l'obésité est non seulement

POMC n«ijrûr.

Figure 6: Action de l’insuline et de la leptine dans les neurones de l’hypothalamus (Plum et al,

2006). L’activation de la PI3-kinase par l’insuline et la leptine conduit à la phosphorylation et

l’inhibition du facteur de transcription Foxol par Akt. Foxol exerce des effets différents dans les

neurones de type POMC (Pro-opiomelanocortin) et AgRP (Agouti-related protein). Dans les neurones

de type POMC il inhibe l’expression de POMC alors que dans les neurones de type AgRP Foxol

stimule l’expression de AgRP. L’inhibition de Foxol par l’action de l’insuline et de la leptine conduit

donc à l’augmentation de l’expression du neurotransmetteur anorexigène POMC et à la diminution de

l’expression du neurotransmetteur orexigène AgRP. STAT3 est recruté par le récepteur de la leptine

activé et est phosphorylé par les kinases JAKs (Janus kinases), ce qui lui permet de former des

homodimères qui vont respectivement activer l’expression de POMC et diminuer l’expression de

AgRP.

une maladie métabolique, mais souvent plutôt une maladie neuro-comportementale (O'Rahilly et Farooqi, 2006).

Différentes régions cérébrales sont impliquées dans la régulation de l’homéostasie énergétique. Parmi celles-ci, les circuits commençant dans les neurones du noyau arqué de l’hypothalamus sont actuellement le mieux compris au niveau moléculaire. Ces neurones sont informés de l'état nutritionnel de l'organisme par l'intermédiaire d'hormones sécrétées notamment par l'estomac, l'intestin, le pancréas et le tissu adipeux, et jouent un rôle clé dans l’intégration des signaux centraux et périphériques qui régulent l’homéostasie énergétique (Barsh et Schwartz, 2002).

1.2.5.1.2 Action de l’insuline et de la leptine niveau de l’hypothalamus

La leptine, hormone sécrétée principalement par le tissu adipeux, et l’insuline, sécrétée par le pancréas, sont des signaux d’adiposité qui agissent sur l’hypothalamus et jouent un rôle déterminant dans l’inhibition de la prise de nourriture (Schwartz et Porte, 2005). En effet, ces deux hormones ont des taux sanguins proportionnels à la masse adipeuse de l’organisme, et agissent sur leurs récepteurs respectifs qui sont exprimés par au moins deux types de neurones impliqués dans la régulation du comportement alimentaire :

> Les neurones produisant les neurotransmetteurs POMC (pro-opiomelanocortin) et CART (cocaine-and amphetamine-regulated transcript), qui stimulent le catabolisme et réduisent la prise de nourriture.

> Les neurones produisant les neurotransmetteurs NPY (neuropeptide Y) et AgRP (Agouti-related protein), qui sont anaboliques et orexigènes.

Bien que ces deux hormones et leurs récepteurs soient stmcturellement distincts, l’insuline et la leptine produisent des effets similaires dans les neurones du noyau arqué suite à une convergence de leurs voies de signalisation menant à l’activation de la PI3-kinase. En effet, la voie de la PI3-kinase activée par l’insuline et la leptine ainsi que la voie Jak-STAT activée par la leptine conduisent respectivement à une augmentation de l’expression de POMC dans les neurones de type POMC/CART, et à une diminution de l’expression de AgRP dans les neurones de type NPY/AgRP (figure 6). Néanmoins, alors que l’inactivation du récepteur de la leptine chez les souris db/db provoque une obésité sévère (Chen et al, 1996), l’inactivation du récepteur à l’insuline spécifiquement dans les neurones ne conduit qu’au développement d’une obésité modérée (Brüning et al, 2000).

1.2.5.1.3 Rôle potentiel de SHIP2 dans la signalisation de l’insuline et/ou de la leptine

L’inactivation tissu-spécifique du récepteur à l’insuline, ainsi que celle d’IRS-2

dans les neurones conduit à une augmentation de la prise de nourriture et à l’obésité chez

Prethminanily insulta lieficient monitgenw T2DM Muutions in HNF-lo. HNF-ta. HNF-lp. IPF. NEIÎROD-I.

Predominuntly inxitlin reststunt monogenic T2DM Mutations in insulin receptor, PPARy. AKT-2 genes

Figure 7: Causes génétiques du diabète de type 2 (Malecki, 2005). Aux deux extrémités on retrouve les rares cas monogéniques de diabète de type 2 caractérisés par un déficit important en insuline ou une insulinorésistance sévère. Le diabète de type 2 polygénique est formé par un large spectre pathophysiologique, allant d’un défaut essentiellement sécrétoire, en présence d’une résistance à l’insuline minime, voire absente, jusqu’à ime maladie essentiellement insulinorésistante avec im défaut relatif en insuline.

HNF, hépatocyte nuclear factor; IPF, Insulin promoter factor; NEUROD-1, Neurogenic différentiation-1; PPARy, peroxisome proliferator-activated receptor.