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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Bouna Moussa, T. (2005). Interaction des complexes lipides cationiques / ADN avec les composants du plasma (Unpublished doctoral dissertation).
Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/211013/1/ebe4c197-7d17-47f6-9339-f87010fcd305.txt
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DBM 00640
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
FACULTE DES SCIENCES
Structure et Fonction des Membranes Biologiques (S.F.M.B) Centre de Biologie Structurale et de Bio-informatique (C.B.S.B).
Directeur : J. M. Ruysschaert
Interaction des complexes lipides cationiques/ADN _________avec les composants du plasma_________
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences.
Tandia Bouna Moussa.
Juillet - 2005
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
FACULTE DES SCIENCES
Structure et Fonction des Membranes Biologiques (S.F.M.B) Centre de Biologie Structurale et de Bio-informatique (C.B.S.B).
Directeur : J. M. Ruysschaert
Interaction des complexes lipides cationiques/ADN _________avec les composants du plasma_________
Thèse présentée en vue de l’obtention
du grade de Docteur en Sciences.
A l'issue de ce travail, je tiens à remercier :
Le professeur Jean-Marie Ruysschaert pour m'avoir accueilli dans son laboratoire et suivi avec intérêt la réalisation de ma thèse. J'ai pu mener ce travail à son terme grâce à ses judicieux conseils, ses encouragements et sa relecture scrupuleuse du manuscrit "Qu 'est ce que vous faites maintenant" "Vous avez des résultats" "Ou en sommes nous". Merci pour sa disponibilité, merci d'avoir cru en moi.
Abdelatif Elouahabi, pour les nombreuses et fructueuses heures de discussion que nous avons eues ensemble et au cours desquelles ses insondables connaissances scientifiques me furent d'un grand secours, pour ses conseils éclairés, sa rigueur scientifique "Moussa il me faut les contrôles", sa patience et sa disponibilité.
Michel Vandenbranden pour ses précieux conseils, sa disponibilité et ses idées qui ont permis de surmonter des nombreux obstacles rencontrés au cours de ce travail.
Mathias Smeyers pour les nombreuses discussions et échanges scientifiques que nous avons eus ensemble. Sa gentillesse et sa gaieté non périssable ont contribué à instaurer une ambiance de travail agréable et amicale.
Mustapha Ouali pour avoir mis à ma disposition la diC14-amidine indispensable à la réalisation de ce travail
Sajid Babar pour avoir monté de toutes pièces l'ordinateur qui m’a permis de dactylographier ce manuscrit. Je salue amicalement sa disponibilité.
Les membres et ex-membres de SFMB : Erik, Vincent, Vinciane, Fabrice, Françoise, Aziza, Guy, Anne, Fabien, Sebastien, Louis, Vanessa, Suzon, Patrick, Norredine, Anthoula, Najib, Véronique Garin, Paul, Olivier, Pierre, Andréa, Régis, Catherine, Mica, Fredl, Fred2, Adelin, Bénédicte, Frantz, Caroline, Véronique Cabiaux, Christian (je m'excuse si j'ai oublié quelques-uns), pour m'avoir permis de travailler dans une ambiance amicale et de bonne humeur. Vous m'avez toujours aidé quand j'en avais besoin
La fondation David et Alice Van Buuren pour l’aide financière qu 'elle m'a accordée.
Des remerciements particuliers vont à :
Khoumbaré Djibril Diagana, pour sa patience, son soutien et son affection qui m'ont permis de surmonter les moments les plus difficiles.
Françoise Békaert pour son soutien et l’inestimable attention dont j’ai toujours bénéficié, merci de tes conseils et de ton écoute.
Mes parents, qui m'ont initié avec beaucoup de rigueur, les arcanes de la dureté de la vie ce qui m’a toujours permis d’acquérir mon indépendance et d’aller de l’avant.
Maman, merci pour m'avoir toujours soutenu dans les moments difficiles malgré la
distance.
Summary :
Interaction of cationic lipid/DNA complexes with the plasma is a limiting step in the cationic lipid-mediated intravenous gene transfer and expression process. Most of the plasma components that interact with the complex and inhibit its transfection effïciency are still unknown. In the présent work, human plasma proteins and lipoproteins that bind to a cationic lipid/DNA complex were isolated on a sucrose density gradient and identified by 2-D gel electrophoresis. Protein binding did not resuit in complex dissociation or DNA dégradation. The effects of several complex-binding plasma components on the transfection effïciency were studied using lung endothélial cells cultured in vitro. Lipoprotein particles caused a drastic loss of the transfection effïciency of the complex.
Surprisingly, fibrinogen was found to activate the transfection process.
The rôles of these complex-binding plasma components on the complex uptake effïciency were quantitatively assessed using radiolabeled plasmid DNA and qualitatively evaluated using fluorescence microscopy. A good corrélation was found between the effects of the complex-binding plasma components on the transfection and on the cell uptake effïciencies. In contrast to what was generally believed, our data suggest that disruption of the complex does not occur when it is in contact with the plasma and therefore could not be responsible for the loss of transfection activity.
Instead, coating of complexes with plasma components seems to be responsible for reduced uptake by cells, which in tum results in reduced transfection. We hâve compared the binding/uptake and transfection activities of DOTAT and diC14-amidine-containing lipoplexes in the presence and absence of purifïed lipoproteins LDL and HDL.
Binding/uptake of both lipoplexes, by the endothélial cell line MLE, was
inhibited to a similar extend in the presence of lipoproteins. In contrast,
transfection activity of diC14-amidine-containing lipoplexes was almost
completely inhibited (approximately by 95%) whereas approximately
40% of the transfection activity of DOTAP-containing lipoplexes was
preserved in the presence of lipoproteins. Interestingly, the ability of
lipoproteins to inhibit the transfection effïciency of lipoplexes was well
correlated with their ability to undergo lipid mixing with the cationic lipid
bilayer as revealed by FRET (fluorescence reasonnance energy transfer
and DSC (differential scarming calorimetry ). Incubation of lipoplexes
with increased doses of lipoproteins resulted in enhanced lipid mixing
and recuced transfection activity of the lipoplexes in MLE cells. The rôle
of lipid mixing in transfection was further demonstrated using lipid
mixing inhibitor (LysoPC) or activator (DOPE). Incorporation of LysoPC
high transfection efficiency in the presence of lipoproteins. On the other
hand, incorporation of DOPE into DOTAP/DNA lipoplex activated lipid
mixing with the lipoproteins and was shown to be detrimental towards the
transfection activity of this lipoplexes. Taken together, these results
indicate that fusion of lipoplexes with lipoproteins is a limiting factor for
in vivo transfection.
Résumé de la thèse :
Les complexes lipides cationiques/ADN administrés par voie intraveineuse interagissent avec les composants du plasma. Cette interaction constitue une étape limitante pour le processus de transfert du gène rapporteur et son expression dans les cellules. La plupart des composants du plasma qui interagissent avec les complexes et inhibent leur efficacité de transfection sont encore mal connus. Dans le présent travail, les protéines et les lipoprotéines du plasma humain qui se fixent sur les complexes lipides cationiques/ADN sont isolées sur gradient de saccharose et identifiées par électrophorèse sur gel 2-D. La présence de ces protéines ne conduit ni à la dissociation des complexes ni à la dégradation de l’ADN complexé. En outre, l’efficacité de transfection des complexes diC14-amidine/ADN incubés avec quelques protéines du plasma a été testée in vitro sur des cellules endothéliales des poumons de souris (MLE). L’efficacité de transfection des complexes est drastiquement inhibée en présence des lipoprotéines, mais est activée en présence de fibrinogène. L’effet de ces protéines sur l’efficacité de la capture des complexes par les cellules a été estimé quantitativement en utilisant des plasmides radioactifs et évalué qualitativement par la microscopie de fluorescence. Ces expériences font apparaître une évidente corrélation entre la capture par les cellules des complexes incubés en présence des protéines (LDL, HDL et fibrinogène) et leur efficacité de transfection. Toutefois cette explication est insuffisante pour justifier le fait que les complexes diC14-amidine/ADN et DOT AP/ADN incubés en présence du plasma ou des lipoprotéines (LDL/HDL) possèdent des efficacités de transfection différentes. En effet, en présence des lipoprotéines l’efficacité de transfection des complexes diC14- amidine/ADN est inhibée de 95% alors que celle de DOTAP/ADN ne l’est que de 40% alors que l’efficacité de capture des deux complexes par les cellules est la même. Plus intéressant, la capacité des lipoprotéines à inhiber l’efficacité de transfection des complexes peut être corrélée avec leur capacité à induire le mélange des phases lipidiques des LDL/HDL et du complexe comme le montre les expériences de FRET (fluorescence reasonance energy transfer) et DSC (differential scanning calorimetry).
L’implication de mélange lipidique dans la diminution de l’efficacité de
transfection des complexes est confirmée par l’utilisation d’un inhibiteur
(Lysophosphatidylcholine ou LysoPC) et d’un activateur (Dioleylphos-
phatidyléthanolamine ou DOPE) de la fusion lipidique. L’incorporation
de la lyso-PC dans la formulation des complexes diC14-amidine/ADN
abolit complètement le mélange des phases lipidiques et permet
complexes DOTAP/ADN restaure leur capacité de fusion et conduit à la perte du pouvoir transfectant des dits complexes.
En conclusion, ces résultats indiquent que la fusion entre les lipides des
complexes lipides cationiques/ADN et les lipides des particules de
lipoprotéines (LDL/HDL) constitue un facteur limitant du processus de
transfection pour les lipides cationiques.
A. Introduction
I. Les vecteurs de la thérapie génique. 1
1. Les vecteurs viraux. 1
a. Rétrovirus. 2
b. Adénovirus. 3
c. Adénovirus associés (A.A. V). 3
d. Conclusion sur les vecteurs viraux. 4
2. Les vecteurs non viraux. 4
a. Complexe calciumphosphate. 5
b. Electroporation. 5
c. Bombardement par microprojectiles. 6
d. Microinjection. 6
e. Polymères cationiques. 7
/ Liposomes. 7
3. Lipides cationiques. 8
1. Structure des lipides cationiques. 8
a. Domaine hydrophile. 8
b. Le groupe de liaison 9
c. Domaine hydrophobe. 9
2. Organisation moléculaire des lipides cationiques
dans un milieu aqueux. 10
3. Complexe liposomes cationiques/ADN ou lipoplexe. 11
1. Préparation des complexes. 11
a. Préparation des complexes par mélange directe
des composants 11
b. Préparation des complexes en présence du détergent. 11
c. Emulsion monophasique dans un milieu organique aqueux. 12
2. Caractérisation physico-chimiques des complexes. 12
a. Taille des lipides cationiques/ADN. 12
b. Potentiel de charge des lipides cationiques/ADN. 13
a. Modèle du collier "Bead and string model" 13
h. Modèle encapsulation de l’ADN 14
c. Modèle "Spaghetti et boulettes" 14 d. Modèle de type "plasmides adsorbés sur le liposome" 15
e. Modèle multilaméllaires. 15
n. Cheminement intracellulaire des complexes lipides cationiques/
ADN ou lipoplexes. 16
1. Franchissement de la membrane cellulaire. 16
a. Liaison des complexes à la membrane plasmique. 16 b. Capture des complexes par les cellules. 17 bl. Analyses par microscopie électronique. 17
b2. Utilisation des inhibiteurs d’endocytose. 18 2. Echappement des endosomes et dissociation des complexes. 19
3. Entrée dans le noyau. 21
III. Utilisation des lipides cationiques/ADN in vivo et in vitro. 22
1. Transfection in vitro. 22
2. Transfection in vivo. 23
1. Etudes sur modèle animal et applications thérapeutiques. 24 a. Administration des complexes par voie systémique. 24 b. Administration des complexes par aérosol ou instillation
intratrachéale. 26
c. Injection intra-tumorale du complexe. 27 2. Expériences cliniques chez les humains. 28 a. Thérapie génique de la mucoviscidose. 28
b. Thérapie génique du cancer. 28
3. Comportement in vivo des complexes lipides
cationiques/ADN. 29
1. Cinétique de biodistribution des complexes. 29
2. Effet du sérum. 30
a. Effet du sérum sur l’efficacité de capture et de transfection des complexes lipides cationiques/ADN. 30
rv. Les lipoprotéines du plasma. 32
1. Constitution et structure des lipoprotéines. 32
a. Chylomicrons. 32
b. VLDL (Very low density lipoptoteins). 32
c. IDL (Intermediate density lipoproteins). 33
d. LDL (Low density lipoproteins). 33
e. HDL (high density lipoproteins). 33
f. Apolipoprotéines. 33
fj. ApolipoprotéineAl. 34
f
2. Apolipoprotéine B. 34
B. Matériels et méthodes.
I. Matériels. 35
n. Méthodes. 35
1. Préparations de liposomes. 35
2. Préparation de complexes liposomes cationiques/ADN 36 3. Préparation du plasma et purification de lipoprotéines. 36
a. Préparation du plasma. 36
b. Préparation des lipoprotéines. 36
c. Trypsinisation des lipoprotéines. 37
4. Caractérisation physico-chimique de liposomes et les
complexes liposomes cationiques/ADN. 37
a. Mesure de la turbidité. yi
b. Analyse de l’effet du plasma sur l’intégrité du complexe par ultracentrifugation de gradient de saccharose. 37
c. Intégrité du plasmide complexé (migration sur gel
d’agarose). 38
d. Transfert d’énergie de fluorescence (FRET). 38
e. Calorimétrie différentielle (DSC). 39
5. Dosage des protéines. 40
a. Dosage par le Kit-B. C.A. 40
b. Electrophorèse sur gel à deux dimensions ( 2D). 40
b J. Isolement des protéines se flxant sur les complexes. 40
b
2. Identification des protéines par spectrométrie de masse. 42
6. Préparation et marquage des plasmides. 42
c. Dosage de VADN.par absorbance à 260 nm. 43
d. Préparation et modification des plasmides. 43
di. Plasmide utilisé. 43
d
2. Production et purification des plasmides. 43
dj. Transformation des bactéries. 44
d
4. Marquage de l’ADNplasmidique. 44
7. Culture et tests cellulaires. 45
a. Culture des lignées cellulaires. 45
b. Test de transfection. 45
c. Culture des cellules. 46
d. Effet des composants du plasma sur la capture des
complexes par les cellules. 46
e. Microscopie de fiuorescence. 47
f. Administration par voie intraveineuse des complexes diC14-
amidine/ADN. 47
g. Localisation du complexe dans la cellule. 47
h. Etude de la toxicité cellulaire. 48
C. But de travail.
I. But du travail. 49
D. Résultats et discussions:
I. Interaction plasma - complexes de diC14- amidine/ADN. 50 1. Conditions de transfection par les complexes diC14-amidine/
ADN in vivo et in vitro. 50
a. in vivo. 50
b. In vitro. 52
2. Effet inhibiteur du plasma sur l’efficacité de transfection. 54 3. Effet du plasma sur la stabilité des complexes diC14-amidine/
ADN. 55
1. Agrégation des complexes diC14-amidine/ADN en présence
du plasma 56
2. Intégrité des complexes diC14-amidine/ADN en présence
du plasma. 57
a. Séparation sur gradient continu de saccharose 30-2% des
complexes diC14-amidine/ADN incubés avec le plasma. 57
b. Migration sur gel d’agarose des complexes diC14- amidine/
ADN incubés avec le plasma. 61
4. Identification des protéines fixées sur le complexe DiC14
amidine/ADN. 64
5. Effets des protéines et lipoprotéines du plasma sur l’efficacité de transfection et de capture des complexes par les cellules. 67
a. L'efficacité de transfection des cellules en culture par le
complexe diC 14-amidine/ADN. 67
b. L'efficacité de capture des complexes diC14 - amidine/ADN
par les cellules en culture. 68
6. Les LDL et HDL du plasma inhibent l’efficacité de transfection des complexes diC14 - amidine/ADN in vivo. 70 7. Comparaison entre l’inhibition de la capture médiée par
les LDL etHDL et l’efficacité de transfection des complexes
diC14-amidine/ADN et de DOTAP/ADN. 71
H. Interaction lipoprotéines (LDL/HDL) - complexes
lipides cationiques/ADN. 74
1. Fusion entre les complexes et les lipoprotéines du plasma
dépend de la nature des lipides cationiques utilisés. 74 2. Organisation de la phase lipidique après fusion entre les
complexes et les lipoprotéines. 78
3. Séparation sur gradient continu de saccharose 30-2% des complexes diC14-amidine/ADN incubés avec les (LDL/HDL) 80 4. Corrélation entre la capacité des lipoprotéines à fusionner avec
les complexes et l’inhibition de leur activité de transfection. 83 5. La lysophosphatidylcholine inhibe la fusion entre les
complexes diC14 - amidine/ADN et lipoprotéines et protège les lipoplexes de l’inactivation de la transfection
médiée par les lipoprotéines. 84
6. Cinétique de fusion entre les lipoprotéines et la bicouche
des complexes diC14 - amidine/ADN. 86
E. Discussion. 88
H. Annexes (publications).
Abréviations ADN
Amp ARN BEt BSA CAT Chol CFTR CMV CPM Da dATP dCTP dGTP DHS.'et
acide désoxyribonucléique ampicilline
acide ribonucléique bromure d’éthidium albumine bovine sérique
Chloramphenicol acetyl transferase Cholestérol
Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator cytomégalovirus
coups par minute dalton
désoxyadénosine 5’-triphosphate désoxycytidiine 5’-triphosphate désoxyguanosine 5’-triphosphate
E. Coli de génotype sup£'44îl/acU169(â80/acZX.M15)
hsd9^\lrecA\endA\gyrA96thi-\relA\
Dc-Chol DDAB DMRIE DMSO DOPC DOPE DOTAP DOTMA DTT dTTP EDTA EPC GDP GFP GIP HEPES HIV LB
Lipoplexes Lipofection ODN P53 pb, kpb PBS PCR PFA Polyplexes RT-PCR (SCID)-X1
3(N-(N’, N’-dimethylaminoethane)carbamoyl)-cholestérol Dimethyldioctadecylammonium bromide
1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyammonium bromide diméthyl sulfoxyde
dioléoylphosphatidylcholine dioléoylphosphati^léthanolamine dioleoyltrimethylamonium propane
Chlorure de N-(l(2,3-dioléyloxy)propyl)triméthylainmonium.
dithiothréitol
désoxythymidine 5’-triphosphate éthylènediamine acide tétraacétique
phosphatidylcholine d’œuf (egg phosphatidylcholine) guanosine 5’-diphosphate
protéine fluorescente verte (green fluorescent protein) guanosine 5’-triphosphate
N-[2-hydroxyéthyl]piperazine-N [2-éthanesulfonic acid]
Virus de l’immunodéficience acquise Luria Bertani
Complexes liposomes cationiques/ADN.
Transfection via les lipides cationiques/ADN Oligodésoxyribonucléiques.
Protéine oncostqtpresseur.
paire de bases, Idlo paires de bases
solution saline tamponnée au phosphate (phosphate saline buflfer) réaction de polymérisation en chaîne (polymerase chain reaction) Paraformaldéhyde
Complexes polymères cationiques/ADN
reverse transcription puis réaction de polymérisation en chaîne
immunodéficience sévère combinée de type XI (severe combined immunodeficiency)
SDS TBE
sodium dodécyl sulfate
Tris base 50mM Acide borique 50mM EDTA ImM, pH8,3
I. Les vecteurs utilisés en thérapie génique
La thérapie génique consiste à transférer des acides nucléiques (ADN et ARN) dans les cellules "défectueuses", c’est à dire des cellules où les gènes d’intérêt sont manquants ou inefficaces. Le pré-requis pour une thérapie génique est de disposer d’un vecteur capable de transférer de manière efficace le gène "thérapeutique” dans les cellules.
L’ADN est une macromolécule anionique traversant difficilement les membranes cellulaires chargées négativement. Les répulsions électro
statiques limitent donc les contacts de l’ADN avec les membranes cellulaires. D’autre part, l’hydrophobicité de la bicouche lipidique constitue une barrière considérable pour un matériel hydrophile comme l’ADN. Il faut noter que l’ADN pénètre dans certains types cellulaires tels que les cellules musculaires, puisque l’injection intramusculaire de plasmide entraîne une expression du gène rapporteur (Wolf et coll., 1990). Les mécanismes impliqués dans l’entrée de l’ADN dans ces cellules musculaires sont mal connus. Il semble toutefois que ce processus soit peu efficace et limité aux cellules adjacentes à la zone où a été injecté l’ADN (Wolf et coll., 1991).
D’autre part, l’ADN injecté au patient par voie intraveineuse est dégradé par les nucléases plasmatiques. Un moyen de protéger l’ADN de l’action des nucléases et de promouvoir son interaction avec les membranes des cellules est de l’associer à un vecteur. Deux types de vecteurs sont actuellement utilisés en thérapie génique. Les vecteurs viraux, utilisant la capacité des vims à pénétrer dans les cellules hôtes et y injecter leur génome et les vecteurs non-viraux. Actuellement, 38% des essais cliniques sont menés avec des rétrovims, 25% avec des adénovims, 13% avec des vecteurs lipidiques et 9% avec de l’ADN "nu" et les 15% restant en utilisant d’autres techniques de transfection (Kay & Maldini, 2001).
1. Les vecteurs viraux :
Les virus sont d’excellents outils pour introduire du matériel génétique dans
une cellule. Le principe d’utilisation des vecteurs viraux consiste à enlever
certaines séquences du génome viral (non indispensables à la réplication) et
à les remplacer par le gène d’intérêt ou transgène. Les vims recombinants
résultants sont non pathogènes car incompétents en terme de réplication et
peuvent être utilisés pour transfecter les cellules cibles. Cependant plusieurs
inconvénients (immunogénicité, recombinaison, mutation insertionnelle etc)
entourent l’utilisation de ce type de vecteur.
B
piWétoE»' 3 ^ c...
Géni^nKr^
GéBOffle’ii^Éf'
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Figure 1; Les vecteurs rétrovirus. (A) : représentation schématique d’un rétrovirus; (B) :
description d’un génome de rétrovirus (C) : un résumé des principales étapes
impliquées dans la mise au point d’un vecteur rétroviral à savoir la production,
le transfert et l’expression des gènes
a. Les rétrovirus.
Les rétrovirus sont des virus icosaédriques, enveloppés. Leur génome est constitué de deux copies d’ARN simple brin de 7 à 10Kb (figure 1 A). Ils ont été les premiers virus à être utilisés comme vecteurs de gène et sont toujours d'actualité dans le cadre de stratégies ex vivo. Les cellules de l’organe atteint d’un patient sont prélevées et cultivées in vitro. Les vecteurs contenant le gène thérapeutique sont incubés avec les cellules en culture et les cellules traitées sont ensuite réinjectées dans l’organe du même patient.
L’entrée des rétrovirus dans les cellules implique la reconnaissance par un récepteur cellulaire d’une protéine présente sur l’enveloppe virale. Le génome de rétrovirus s’intégre dans le génome de la cellule hôte, si celle-ci est en mitose. La séquence d’intérêt sera donc transmise aux cellules filles descendantes. Le danger de l’intégration est celui d’une intégration mutagène. En effet, l’insertion du transgène s’effectue au hasard dans le génome de la cellule hôte et peut inactiver un gène fonctionnel ou activer des oncogènes et donc rendre la cellule cancéreuse. En pratique, on utilise le rétrovirus murin (Mo-Mulv) rendu irréplicable par délétion des gènes de structures (gag, pol et env) (figure IB). Ces gènes de structure sont remplacés par la séquence d’ADN dont on souhaite obtenir l’expression dans la cellule cible (Crystal, 1995a). Ces rétrovirus défectifs contenant la séquence d’intérêt thérapeutique sont produits in vitro par infection de lignées cellulaires dites "cellules d’encapsidation", qui produisent les protéines structurales virales (cellules trans-complémentantes) (figure IC).
Les vecteurs proprement dits conservent les séquences cis-régulatrices indispensables : les deux LTR (long terminal repeats) pour le contrôle de la transcription, 'E (psi) pour l’encapsulation et PB S (tRNA-Primer-Binding Site) pour la réplication. Seules les séquences d’ARN porteuses d’une séquence 'P seront encapsidées. Ensuite, les cellules cibles sont transfectées soit par le stock viral ainsi produit, soit par la lignée cellulaire elle-même qui produit des rétrovirus in situ.
Pour ne citer que ces quelques applications cliniques, les vecteurs de rétrovirus ont permis d’introduire avec succès le gène humain de l’adénosine désaminase (ADA) (Blaese et coll., 1995 ; Wilson et coll., 1990) et de la glucocérébrosidase (Dunbar et coll., 1998) dans les cellules hémato
poïétiques des patients respectivement atteints de SCID (severe combined
immunodeficiency) et de la maladie de Gaucher. Le gène codant pour le
récepteur de LDL a été introduit avec succès dans les hépatocytes des
patients atteints d’hypercholestérolémie familiale (Grossman et coll., 1994),
ainsi que le gène codant pour la protéine de facteur IX introduit dans les
myoblastes (Dai et coll., 1992). In vivo, le vecteur rétroviral a été utilisé dans
Gène
!■ ■ Séquences réplattîces
ADN viral mociillé
I
ADN recombinant
Particule vir ale
▼
*
Virus (iètectif AE1 dotrl
r^gènonre est détesté
du gérre précoce Et
Géncnte viral recoro^nant à E1
tiêle$té du gétre précoce E1
Transîectron
ignée cellulaire comt^ntentante 293
Figure 2: Production dans une cellule complémentante des vecteurs
d’adénovirus récombinants.
le traitement des maladies cancéreuses qui affectent les poumons, la prostate, le cerveau, les ovaires et la peau (Roth & Cristiano, 1997).
Malheureusement, la plupart des rétrovirus n’infectent pas les cellules quiescentes car leur génome ne traverse pas l’enveloppe nucléaire, ce qui limite leur utilisation à des pathologies impliquant des cellules en division.
On a remédié à cette limitation par l’utilisation des lentivirus (rétrovirus de la famille HIV-1) qui ont la capacité d’infecter les cellules quiescentes. Les lentivirus utilisés in vivo transfèrent efficacement des gènes dans les neurones ou les cellules gliales, conduisant à une expression stable et de longue durée du transgène.
b. Les adénovirus.
Les adénovirus sont des virus à ADN double brin de 35 à 45Kb (Horwitz, 1990), de forme icosaèdrique et non enveloppés. Les adénovirus humains utilisés comme vecteurs sont ceux dont le gène El indispensable à la réplication a été délété et remplacé par la séquence génique thérapeutique.
La production des adénovirus recombinants est effectuée in vitro par transfection de cellules humaines qui possèdent le gène El (Graham et coll.,
1977) (figure 2).
Les adénovirus présentent un certain nombre d’avantages. Ils infectent les cellules en division mais aussi les cellules quiescentes comme les neurones (Legal la salle et coll., 1993) et les hépatocytes (Jaffe et coll., 1992). Les adénovirus ont été utilisé avec succès pour transférer les gènes dans les cellules cardiaques (Kass-Eisler et coll, 1993), tumorales (Brody et coll, 1994 ; Wills et coll, 1994), pulmonaires (Crystal et coll, 1994), etc., et peuvent être produits en quantité significative. Parmi les inconvénients on peut noter que le transgène ne sera pas longtemps transmis à la descendance de la cellule transfectée et celle-ci sera vite diluée au sein d’une vaste majorité de cellules non traitées, diminuant donc la durée de l’effet thérapeutique (Csanad et coll, 2000). Autres problèmes majeurs : le développement d’une grande immunogénicité quand ils sont injectés à forte dose ou lors d’administrations répétées (Yang et coll, 1994a; Kamiya et coll, 2001 ; Yang et coll, 1994c ; Csanad et coll, 2000), la possibilité d’infection par un adénovirus naturel, sans oublier l’induction de fortes réactions inflammatoires.
c. Virus associés aux adénovirus (AA. VJ.
Le développement de transfert de gènes par des virus associés aux
adénovirus (A.A.V) est récent. Les vecteurs d’AAV sont construits par
Génome AAV
Génome Vecteur
Cellule d’empaquetage
ÿ ;''.
gène thérapeutiquè
Figure 3: Le vecteur viral basé sur le système AAV.
substitution des gènes rep et cap par le gène d’intérêt. Le génome recombinant est ensuite empaqueté dans des particules d’AAV par transfection des plasmides "helper" qui vont fournir le "cap" et le "rep" en trans (figure 3). Les souches sauvages de ces virus ont la capacité d’intégrer leur génome en un site spécifique du génome de la cellule hôte (Ali et coll., 1994). Aucune toxicité et aucune réponse inflammatoire importante n’ont été rapportées après administration in vivo de ces virus. Ils infectent les cellules quiescentes mais comme vecteurs, ils se sont révélés être non intégratifs.
Des essais cliniques utilisant ces vecteurs sont en cours pour le traitement de la mucoviscidose (Roth & Cristiano, 1997), de l’hémophilie (Naldini et coll., 1996) et des myopathies (Arya et coll., 1998).
d. Conclusion.
Les vecteurs viraux ont l’avantage de pouvoir infecter naturellement les cellules. Un inconvénient de leur utilisation, outre leur potentiel d’intégration dans le génome des cellules hôte et leur immunogénicité, est la faible taille du gène thérapeutique qu’ils peuvent intégrer : 4,5kb pour les virus associés aux adénovirus, 7,5kb pour les adénovirus, 8 à lOkb dans le cas des vecteurs rétroviraux. D’autre part, les technologies de production de ces virus font intervenir des lignées cellulaires dites d’empaquetage, qui produisent les protéines virales permettant l’assemblage de la particule virale fonctionnelle et le bon déroulement du cycle infectieux. Cette technologie n’exclut pas une éventuelle recombinaison entre l’ADN du virus modifié et le génome de la lignée d’empaquetage, le vims retrouve alors un génotype
"sauvage" potentiellement infectieux et dangereux pour le patient traité (Crystal, 1995b). D’autre part, il est parfois très difficile d’obtenir des titres suffisamment importants en particules virales recombinantes pour pouvoir envisager une utilisation pratique.
2. Les vecteurs non-viraux :
Malgré une efficacité plus faible que celle des vecteurs viraux, les vecteurs
non viraux sont attractifs pour plusieurs raisons : l’absence de contraintes
liées à la taille du gène à transporter, l’élimination du risque de
dissémination, la facilité de production. Ce sont des polymères cationiques
(De-Smedt et coll., 2000) et des protéines (Uherek & Wells, 2000) formant
avec l’ADN des particules appelées polyplexes ou des lipides cationiques
formant avec l’ADN des particules appelées lipoplexes (Pedroso-De-Lima et
coll., 2001).
DOTM*
ONE
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dlCUamidlfwP CH,- ■■■■ :
CH, 14 Dm 2
MetCHji,.,-X-CHjCHjG,
^NCM«3
\ NHICHîU.
• U a; n = 12. X a NH
■ b; n a 14. X = SH
« = 36. X = NH
d;»=m.X*NH
Amidintum derivath/es
OCrChol
SAINT-1 SAINT-2 jSAlNT-*
SAWT-7 SAINT-5 SA1NT4
OMTIM DFTIW DOHM
jWe
Figure 4A: Illustration schématique de la structure de lipides cationiques "monovalents".
Dans ce chapitre, nous nous intéresserons plus particulièrement à l’utilisation des lipides cationiques (figure 4) comme vecteurs de gènes. Les autres techniques de transfection (la co-précipitation avec le phosphate de calcium, l’électroporation, la micro-injection, le bombardement par micro
particules "Biolistics" et l’utilisation de polymères cationiques pour transfecter des cellules eucaryotes) seront brièvement décrites.
a. Complexe calcium-phosphate.
Dés 1973 Graham et Van der Eb (Graham & Van Der Eb, 1973) ont montré que l’addition de chlorure de calcium à une solution tamponnée d’ADN contenant une concentration faible d’ion phosphate provoque la formation d’un précipité ADN-phosphate de calcium. Lorsque ce précipité est ajouté à des cellules en culture, celles-ci incorporent l’ADN. Cette méthode de transfection a été développée et adaptée par divers auteurs (Lewis et coll., 1980 ; Corsaro et coll., 1981 ; Chen & Okayama, 1987). Elle est largement utilisée in vitro du fait de sa simplicité et du faible coût des réactifs utilisés.
De plus, elle est applicable à un grand nombre de lignées cellulaires.
Toutefois, par rapport aux autres méthodes de transfection, elle reste peu efficace et inapplicable in vivo.
b. Electroporation.
En 1982, Zimmerman (Zimmerman & Vienken, 1982) observe que l’application d’un champ électrique de haut voltage induit la fusion de cellules en culture. Par la suite, Neuman montra que des fibroblastes de souris incorporent et expriment de l’ADN exogène sous l’action d’une impulsion électrique (Neuman et coll., 1982). Porter montra que cette technique était applicable à des lignées cellulaires réputées difficiles à transfecter, comme les lymphocytes (Porter et coll., 1984). Techniquement, une suspension de cellules dans un milieu contenant le matériel génétique à incorporer est soumise à une impulsion électrique de haut voltage (2000 à 4000V durant quelques msec). Cette méthode est largement employée car relativement simple à mettre en oeuvre, reproductible et rapide. En plus, elle peut être appliquée à un grand nombre de types cellulaires (procaryotes et eucaryotes) pour des transformations transitoires ou stables. Cette technique peut néanmoins s’avérer cytotoxique selon le type de cellule traité (jusqu’à 75% de mortalité).
5
c. Bombardement par microprojectiles (Biolistics).
Cette méthode, décrite par Klein (Klein et coll., 1987 ; Klein et coll., 1992) consiste à adsorber à la surface des microparticules (généralement des billes d’or ou de tungstène de diamètre compris entre 0.5 et 1.5 pm) l’ADN ou TARN. Ces micro-particules sont ensuite projetées à grande vitesse dans les cellules à transfecter au moyen d’un appareil de propulsion utilisant la poudre ou l’hélium comprimé. Cette technique a été mise au point pour la transformation des cellules végétales (Klein et coll., 1987). Son application à des cellules animales in vitro et in vivo n’a été envisagée que plus tard (Yang et coll., 1990 ; Sandford, 1990 ; Williams et coll., 1991). Toutefois, in vitro, la méthode peut s’avérer efficace pour des cellules difficiles à transfecter par les autres techniques, comme les lignées cellulaires primaires, les oocytes ou les organes en culture. Le taux de survie des cellules ainsi traitées est de 85 à 97% (Klein et coll., 1992). Par cette approche, la peau, le foie et les muscles des souris ont été transfectés (Zimmerman & Vienken, 1982 ; Williams et coll., 1991). Le fonctionnement de ces organes ne semble pas être affecté par le traitement. Cette méthode est difficilement applicable à grande échelle à cause des difficultés inhérentes à son emploi : un matériel coûteux et délicat, les conditions expérimentales difficiles à mettre au point etc.
d. Microinjection.
La technique de micro-injection a été mise au point pour la transplantation
des noyaux des cellules de mammifères (Graessmann, 1970). Par la suite,
elle a été miniaturisée en vue de son application au transfert de matériel
génétique (Graessmann & Graessmann, 1976 ; Graessmann et coll., 1980 ;
Capecchi, 1980), protéique (Bar-Sagi & Feramisco, 1985) et d’autres
substances biologiquement actives. En pratique, un microcapillaire en verre
contenant l’échantillon à transférer est introduit dans la cellule cible à l’aide
d’un micromanipulateur. Le volume souhaité de l’échantillon est ensuite
injecté au moyen d’une seringue reliée au microcapillaire. L’opération est
effectuée sous microscope à contraste de phase. La méthode est efficace. En
effet, chaque cellule traitée intègre le matériel génétique injecté et le système
est peu cytotoxique ; plus de 90% des cellules traitées sont viables (Wang et
coll., 1982). Il est possible de retrouver plus d’un transfectant stable pour
cinq cellules traitées. L’inconvénient de cette technique est qu’elle exige un
appareillage sophistiqué et un grand savoir-faire. En outre, elle ne permet le
traitement que d’un nombre limité de cellules.
e. Les polymères cationiques :
Dès 1987, le diéthylaminoethyl-dextran (DEAE-dextran), la polylysine (PLL) puis les polyethylènimines (PEI) ont été les premiers polymères cationiques utilisés pour le transfert de gènes (Boussif et Coll., 1995 ; Faber et coll., 1975 ; Nathanaël et coll., 1998). Plus récemment, des systèmes utilisant les polyméthacrylates en 1996 et le chitosan en 1998 (Godbey &
Mikos, 2001) ont été développés.
Les propriétés physico-chimiques des polyplexes formés par complexation d’ADN avec ces polymères cationiques sont actuellement largement étudiées. L’efficacité de transfert de gènes par les polyplexes est étroitement liée à leur taille et à la densité de charge superficielle (rapport de charges positives apportées par les polymères et des charges négatives apportées par l’ADN) : (R +/-).
f Les liposomes :
Les lipides dispersés dans un milieu aqueux s’associent spontanément de façon à minimiser les interactions entre les phases aqueuses et les chaînes hydrocarbonées et s’organisent en structures liposomales ou micellaires. Ces structures permettent l’encapsulation de matériel hydrophile ou hydrophobe.
Dans le cas de matériel génétique, l’efficacité d’encapsulation de l’ADN dépend de la longueur de l’ADN et de la technique utilisée pour préparer les liposomes (Hug & Sleight, 1991). Fraley et ses collaborateurs ont démontré qu’une fraction importante des vésicules lipidiques n’incorporent pas l’ADN confirmant ainsi la faible capacité d’encapsulation de l’ADN (Fraley et col., 1980). En plus de cette faible capacité d’encapsulation, le transfert de gène médié par ce type de vecteur est rendu inefficace par la faible liaison des liposomes aux cellules cibles et leur dégradation dans les lysosomes. Le transfert de l’ADN dans les cellules cibles procède via la fusion avec la membrane cellulaire ou par endocytose médiée par des récepteurs (Fujiwara et col., 1996). Afin d’augmenter l’efficacité de transfection des liposomes ayant encapsulé de l’ADN, des ligands ont été insérés dans l’enveloppe des liposomes pour cibler certaines cellules spécifiques ou faciliter leur liaison/flision avec ces cellules. Exemples : les immunoliposomes (incorporation des anticorps dans l’enveloppe liposomiale) (Wang & Huang,
1987 ; Wang & Huang, 1989), les virosomes (incorporation des protéines virales dans l’enveloppe liposomiale) (Kato et col., 1991).
Une des difficultés majeures associées à ces types de vecteurs est leur faible capacité d’encapsulation de matériel génétique. L’utilisation de lipide
7
Variation de l’hydroxyalkyl de la cytofectine
DOTMA R = CH3
DORIE R = H0(CH2)2 DORIE-HP R = H0(CH2)3 DORIE-HB R = H0(CH2)4 DORIE-Hpe R = HO(CH2)5
mm
Figure 5: Influence la tête polaire de lipide cationique DOTMA sur l’activité
de transfection in vivo: MLV = colonnes noires; SUV = colonnes
cationique a permis d’augmenter ce rendement de façon décisive (Berling et coll., 1991 ; Legendre et coll., 1992)
3. Les lipides cationiques.
1. Structure des lipides cationiques :
Les lipides cationiques sont constitués de trois domaines.
a. Domaine hydrophile.
La tête polaire de la plupart des lipides cationiques contient un ou plusieurs groupement amines, mais des groupements amidine, guanidine, cholestérol et pyrimidique ont également été décrits. Dans les expériences de transfection réalisées in vitro. Peigner et ses collaborateurs (Peigner et coll., 1987) ont comparé une série d’analogues structuraux de cationiques (DOTMA) possédant le même domaine hydrophobe (diC18:l). La tête polaire est modifiée à différents niveaux (figure 5). La substitution d’un groupe méthyle par un groupe hydroxyléthyle dans l’amine quaternaire de DOTMA conduit en une augmentation significative de son activité de transfection. Les auteurs pensent que, non seulement, le groupement hydroxyléthyle favorise les interactions électrostatiques entre les têtes polaires des liposomes chargées positivement et les résidus phosphate de l’ADN chargés négativement, mais améliore aussi l’interaction de ces complexes avec la membrane cellulaire (Peigner et coll., 1987). Au niveau de la tête polaire de DOTMA, la substitution d’un ammonium quaternaire monovalent par une chaîne de spermine multivalente (DOSPA, composant résultant) augmente l’activité de transfection in vitro dans plusieurs lignées cellulaires (Lee et coll., 1996). Au niveau de la tête polaire de DMRIE, le remplacement de la fonction alcool par une fonction amine augmente l'activité de transfection dans plusieurs lignées cellulaires (Hawley-Nelson et coll., 1993 ; Wheeler et coll., 1996).
En étudiant une série de lipides cationiques dont le domaine hydrophobe est constitué du cholestérol, et le domaine hydrophile (la tête polaire) de groupements polaires différents, Lee et collaborateurs (Lee et coll., 1996) ont tenté d’établir une corrélation entre la structure et l’activité de transfection. Ils ont constaté qu’in vivo et in vitro, les lipides dont la tête polaire porte une polyspermine ont une activité de transfection plus élevée que le dérivé monovalent correspondant (DC-Chol). Ils ont aussi démontré in vitro que les complexes préparés à partir de lipides cationiques dont la tête polaire porte un groupement polyamine non linéaire et dont le domaine
8
Variation de la chaîne latérale de cytofectine DORI R = C0(CH2)7[ Z ]CH=CH(CH2)7CH3 DORIE R = (CH2)8 [ Z ]CH=(CH2)7CH3 DMRIE R = (CH2) i 3CH3
DPRIE R = (CH2) i 5CH3 DSRIE R = (CH2)17CH3
30000
*000$
issKii
... .. -y.-
IMI wm
Figure 6: Influence du domaine hydrophobe du lipide cationique DMRIE sur l’activité
hydrophobe est constitué de cholestérol (les lipides # 67 et # 53 de la figure 4B) ont une activité de transfection plus élevée que ceux préparés avec les lipides cationiques dont la tête polaire porte le groupement polyamine linéaire et sont constitués par le même domaine hydrophobe (les lipides # 37 et # 48 de la même figure).
b. Le groupe de liaison :
Les groupes chimiques qui ont été utilisés pour lier le domaine hydrophobe et le domaine hydrophile des lipides cationiques sont les esters, éthers, ami des, carbamoyles et l’azote. Ces groupes de liaison déterminent la stabilité chimique et la biodégradabilité des lipides cationiques. Ainsi, le lipide cationique DOTAP dont les chaînes acylés sont liées à la tête hydrophile par une fonction ester est moins stable que le lipide cationique DOTMA dans lequel les deux domaines sont reliés par une fonction éther.
De même, il a été montré que DOTAP (liaison ester) (Leventis & Silvius, 1990) et DC-Chol ( liaison carbamoyle) (Vigneron et coll., 1996) sont plus facilement métabolisés par les cellules et par conséquent potentiellement moins toxiques que DOTMA (liaison d’éther) (Peigner et coll., 1987) ou DD AB (liaison azote) (Rose et coll., 1991). Toutefois, à l’exception de DOTAP aucune étude approfondie quant à la biodégradabilité des lipides cationiques dans la cellule n’est disponible (Leventis & Silvius, 1990).
c. Domaine hydrophobe.
En général, le domaine hydrophobe des lipides cationiques est constitué de deux chaînes hydrocarbonées qui favorisent la formation de liposomes ou de micelles. Le domaine hydrophobe des lipides cationiques peut également être constitué par les cycles du cholestérol. Dans ce cas, la formation de la bicouche lipidique requiert la présence de phospholipides neutres additionnels (Vigneron et coll., 1996 ; Gao & Huang, 1991).
Des modifications intervenant au niveau du domaine hydrophobe modifient l’activité de transfection. En effet, l’activité de transfection médiée par les lipides cationiques varie en fonction de la longueur des chaînes hydrocarbonées et du degré d'insaturation (figure 6). Une augmentation de la longueur des chaînes hydrocarbonées saturées conduit généralement en une diminution de l’activité de transfection in vitro (Peigner et coll., 1994 ; Janiak et coll., 1976).
Balasubramanian et ses collègues ont montré que les lipides possédant des chaînes hydrocarbonées asymétriques transfectent mieux les cellules en culture que leurs analogues symétriques (Balasubramaniam et coll., 1996).
9
Monomères Aggrégats
Assemblement Supra-moléculaire
ié%W-
Micelle
Bicouche
Micelle inversée (hexagonale)
Figure. 7: Influence de la géométrie moléculaire sur la stabilité des phases lipides
L'explication proposée est la capacité qu'ont les premiers, par rapport aux seconds, de pouvoir mieux fusionner ou de déstabiliser efficacement la membrane cellulaire. Toutefois, cette différence n’est pas observée au cours de transfections réalisées in vivo. Lee et collaborateurs ont montré qu ’in vivo les complexes constitués par les lipides cationiques dont la tête porte un groupement multivalent et le domaine hydrophobe est constitué de cholestérol (les lipides # 67 et 53 de la figure 4B) ont une activité de transfection plus élevée que ceux formulés à partir de lipides cationiques portant le même groupement multivalent au niveau de la tête polaire mais dont le domaine hydrophobe est constitué de deux chaînes hydrocarbonées (les lipides # 89, 111, DOGS ou le DOSPA de la même figure) (Lee et colL,
1996).
2. Organisation moléculaire des lipides cationiques dans un milieu aqueux.
Les lipides cationiques sont des molécules synthétiques et amphiphiles qui s’organisent en bicouche (Peigner et col., 1997) ou en micelles (Labat-Moler et col., 1996). Comme les phospholipides, la stmcture formée par les lipides cationiques en solution aqueuse est liée à la répartition des domaines hydrophobes et hydrophiles. Ainsi, la formation d’une bicouche lipidique est favorisée par la forme cylindrique des lipides (l’aire occupée par le domaine hydrophobe est égale ou proche de celle occupée par le domaine hydrophile). En revanche, si l’aire occupée par l’un de ces domaines est différente de l’autre domaine, l’auto-assemblage conduit à des micelles ou des micelles inverses (figure. 7). Quelques lipides cationiques s’organisent en bicouches tandis que d’autres ne peuvent le faire qu’en présence d’un co
lipide comme la DOPE (Gao et Huang, 1995).
Différentes techniques permettent la préparation de liposomes à partir des lipides cationiques y compris l’hydratation de films lipidiques ou injection d’une solution éthanolique des lipides cationiques dans un milieu aqueux. La taille des liposomes est variable (50 à 300 nm) et dépend des lipides cationiques et de la technique de préparation. La sonication peut être utilisé pour obtenir des petites vésicules unilamellaires (SUV) (Peigner et col., 1994 ; Gustafsson et col., 1995). En terme de transfection in vitro, pour une série des lipides cationiques, il a été démontré que les liposomes multilamellaires préparés par agitation mécanique sont plus actifs que les petites vésicules issues de la sonication (Peigner et col., 1994). La sonication des liposomes de DOT AP/Cholestérol suivi de leur extrusion à travers un filtre de polycarbonate a permis d’augmenter leur efficacité de transfection in vivo (Templeton et col., 1997). Bien que la plupart d’expériences de transfection aient été réalisées avec des lipides cationiques assemblés en
10
liposomes, cette structure n’est pas une nécessité absolue. Des lipides cationiques (DOGS, DPPES et guanidium/cholestérol) organisés en micelles transfectent les cellules (Behr et col., 1989 ; Labat-Moler et col., 1996 ; Vigneron et col., 1996).
3. Complexe liposomes cationiques/ADN.
Par interaction électrostatique, les liposomes cationiques se lient à P ADN pour former un complexe. Par conséquent, il n’y a aucune limitation concernant la taille ou la quantité d’ADN. Les complexes présentant un excès de charges positives se lient par interaction électrostatique à la surface des cellules chargées négativement. Par cette nouvelle approche, plusieurs types de cellules ont été transfectés in vivo et in vitro (Gao & Huang, 1996).
Plusieurs méthodes existent pour former les complexes 1. Préparation des complexes:
a. Préparation des complexes par mélange direct des composants
La méthode la plus simple pour préparer les complexes, consiste à mélanger directement des liposomes cationiques préformés avec une solution aqueuse d’ADN. Les complexes se forment par simple interaction électrostatique entre les charges positives des lipides cationiques et les charges négatives de l'ADN. Pour préparer des complexes de manière reproductible, les paramètres de concentration en lipides cationiques par rapport à l’ADN, la température, la force ionique et le pH des tampons utilisés doivent être contrôlés rigoureusement.
b. Préparation des complexes en présence de détergent.
Une autre possibilité consiste à utiliser un détergent (octylglucoside) pour solubiliser les lipides cationiques et l’ADN. Le mélange lipides cationiques/ADN/détergent est dialysé contre un tampon afin d’éliminer le détergent et induire la formation de complexes (Hofland et coll., 1996).
Cette méthode présente quelques avantages pratiques par rapport à la
technique du mélange direct (temps de conservation élevé). L’inconvénient
est la présence du détergent à l’état de traces.
D ia m è tr e (n m )
A B
C
(1) E>
(0 JC
O a>
■O
c
0) —■
û- O
Rapport de charge (-/+)
Figure 8: Diamètre hydrodynamique des complexes DOTAP:DOPE/ADN en fonction du rapport de charge (lipides/ADN +/-) et de la concentration d’ADN (A). Diamètre hydrodynamique des complexes DOTAP:DOPE /ADN en fonction de rapport massique lipides/ADN (B) (Radier et collaborateurs, 1997). Le potentiel de charge des complexe DOTMA;DOPE/ADN en fonction de rapport de charge (lipides/
ADN) (C). (Tomlinson et Roland, 1996).
c. Emulsion monophasique dans un milieu organique aqueux.
Les lipides cationiques et l’ADN sont solubilisés dans un mélange chloroforme/méthanol/eau dans un rapport 1:2:1. L’addition d’eau permet de séparer la solution en deux phases distinctes. Pour un rapport ADN/lipides cationiques égal ou inférieur à 1, plus de 95% d’ADN complexé est transféré dans la phase organique. La phase organique est collectée, évaporée et les complexes sont isolés (Wong et coll., 1996). La capacité de ce type de complexes à transfecter des cellules reste à démontrer.
Les deux dernières techniques sont assez particulières et ne sont guère utilisées. Dans la suite de notre travail, nous nous focaliserons exclusivement sur les propriétés des complexes préparés par mélange des liposomes cationiques préformés et d’ADN en solution aqueuse.
2. Caractérisation physico-chimique des complexes.
Comme mentionné ci-dessus, dans un milieu aqueux, la plupart des lipides cationiques seuls ou combinés à d’autres lipides s’organisent en liposomes.
Ces liposomes ont été largement étudiés en terme de taille, de potentiel de charge et d’agrégation en présence des anions monovalents et polyvalents.
Ces paramètres méritent d’être étudiés car ils jouent un rôle déterminant dans l’interaction des complexes avec les cellules, tissus et organes cibles et permettent d’optimiser les protocoles de transfection.
a. Taille du complexe.
La spectroscopie photonique de corrélation a été utilisée pour déterminer les
diamètres et la distribution de taille des complexes liposomes
cationiques/ADN. La taille moyenne des complexes formés à partir de
l’ADN et des liposomes de DOTMA:DOPE est comprise entre 100 à 200
nm. Elle dépend du rapport de charge lipides/ADN et de la concentration de
l’ADN dans l’échantillon (figure 8A) (Tomlinson & Rolland, 1996). Les
complexes préparés à partir d’ADN et de liposomes de DOTAP:DOPE
montrent un comportement similaire. Plus intéressant, pour un rapport de
charge lipide/ADN qui génère des complexes neutres (5/1 w:w), la taille des
complexes augmente de façon considérable et atteint 1 pm (figure 8B)
(Radier et coll., 1997). Il a été suggéré qu’en absence des répulsions
électrostatiques, les complexes neutres ou proches de la neutralité forment
des gros agrégats. Par microscopie électronique à balayage, Eastman et ses
collaborateurs ont montré que la taille de complexe DMRIE:DOPE/ADN
varie de 200 à 500 nm pour des rapports de charges lipides/ADN de 0.75:1
Figure. 9A: Modèle proposé par Peigner et Ringold pour la formation des complexes lipides cationiques/ADN. (Peigner et Ringold, 1987)
Fig. 9: Images électroniques des complexes DOTMA:DOPE/ADN préparés à des
rapports des charges lipides/ADN (+/-) de 0.6 (B) et 1.5 (C). Aux faibles
rapports, les complexes liposomes/ADN sont visualisés comme des agrégats
(B) tandis qu’à des rapports de charge élevés les liposomes fusionnent pour
former une structure constituée de larges cylindres encapsulant l’ADN (C)
(Gershon et collaborateurs., 1993)
et de 200 à 2000 nm pour les rapports de charge supérieurs à 1.5:1 (Eastman et coll., 1997) Ces données montrent que la taille de complexe varie largement et dépend principalement des rapports lipide/ADN et du lipide cationique utilisé.
b. Potentiel de charge.
Dans le but d’obtenir des informations sur la charge nette présente à la surface des complexes, le potentiel électrostatique des complexes liposomes cationiques/ADN a été étudié par micro-électrophorèse. Les potentiels du complexe DOTMA:DOPE/ADN ont été comparés pour différents rapports de charges lipides/ADN (Tomlinson & Rolland, 1996). L’augmentation du rapport de charge lipides/ADN du complexe provoque un shift de potentiel de charge des valeurs négatives vers les valeurs positives (figure 8C). Les forces électrostatiques répulsives entre complexes possédant un excès de charges positives ou négatives empêchent une agrégation importante et/ou une fusion, conduisant ainsi à la formation des complexes de plus petite taille. Des résultats similaires ont été obtenus par Eastman et ses collaborateurs lorsque des lipides cationiques tels que DMRIE et DOSPA sont utilisés dans un rapport molaire 1:1 (Eastman et coll., 1997).
3. Structure et morphologie des complexes.
Le mode de formation des complexes est un facteur déterminant pour leur activité biologique. Des nombreuses études théoriques et expérimentales ont été menées pour déterminer les paramètres qui affectent leur formation et leur morphologie. A partir de ces études, différents modèles structuraux ont été proposés.
a. Modèle du collier (Peigner et coll, 1987)
Le premier modèle a été proposé par Peigner et collaborateurs dès 1987 (Peigner et coll., 1987), en considérant que les deux composants des complexes interagissent par simple interaction électrostatique (figure 9A).
Par des calculs théoriques, ils ont défini le nombre de liposomes nécessaires
pour neutraliser un ADN plasmidique. Un liposome DOTMA/DOPE (1:1)
de 250 nm de diamètre contient environ 2500 lipides (1250 molécules de
DOTMA), un plasmide de 2.5 Kb contient environ 5000 charges négatives
donc il faut, au minimum, 4 liposomes pour neutraliser toutes les charges
(Peigner & Ringold, 1989). Ce modèle ne considère pas que les charges sont
+ ♦
mmmmmm
*
4■* * */
Fig. 10: Modèle d’interaction liposomes cationiques (DC-CholDOPE)/ADN, montrant la
formation d’aggrégats liposomes/ADN aux temps d’incubation courts et/ou des
rapports ADN/ lipides faibles, et les complexes se formant à des temps d’incubation
longs et/ou à des rapports ADN/lipides élevés et adoptent une structure dite "boulette-
spaghetti" (d’après Sternberg et coll., 1994)
distribuées à l’intérieur et à l’extérieur de la bicouche lipidique et n’est basé sur aucune preuve expérimentale.
b. Modèle de l’encapsulation de l’ADN (Gershon et coll, 1993)
Gershon et collaborateurs (Gershon et coll., 1993), à partir des images obtenues par microscopie électronique, ont proposé un nouveau modèle pour la formation du complexe. A faible rapport de charges lipides cationiques/ADN (+/-), les molécules de liposomes cationiques s’adsorbent à la surface des molécules d’ADN. Progressivement, des agrégats se forment entourant un large segment d’ADN. Une fois qu’une certaine concentration critique est atteinte, l’ADN est encapsulé dans des liposomes de forme ovoïde (figures 9B et C). Le processus d’encapsulation a été démontré par des expériences (de marquage au bromure d’éthidium et de digestion à l’ADNase) (Gershon et coll., 1993). En 1997, à partir des images observées par cryo-microscopie, Templeton et collaborateurs ont démontré qu’au rapport de charge R(+/-) élevé, l’ADN est encapsulé dans les liposomes DOTAP/Chol (Templeton et coll., 1997). Le DOGS forme le même type de structure, mais beaucoup plus condensée (80 - 100 nm de diamètre), avec parfois une agrégation en complexes plus grands (jusqu’à 400 nm) (Pitard et coll, 1997).
c. Modèle ‘spaghetti - boulettes ’ (Sternberg et coll, 1994)
La structure de complexe liposomes cationiques/ADN illustrée dans la figure 10 et proposé par Stermberg et ses collaborateurs est basée sur les images visualisées par microscopie électronique à balayage (Sternberg et coll,
1994):
- A un faible rapport de charges (-/+) et pour un temps d’incubation court, on observe des liposomes libres et des liposomes associés à des filaments d’ADN entourés des bicouches lipidiques.
- A un rapport de charge (-/+) élevé et pour un temps d’incubation long (4
|ig d’ADN par 20 nmoles de DC-Chol incubés 30 min), on observe des structures sphériques entourées d’un faisceau de fibres qui ont partiellement ou complètement fusionné "meatballs with spaghetti" (Sternberg et coll, 1994). Les fibres ont un diamètre approximatif de 6.5 nm, qui correspond à l’épaisseur d’un double brin d’ADN entouré d’une bicouche de lipides cationiques. Ce type de structure a également été proposé pour d’autres lipides cationiques, DDAB/DOPE et DOTAP/DOPE. Il semblerait que la présence de DOPE comme co-lipide soit nécessaire à leur formation (Xu &
Szoka, 1996).
( 1 : 1 )
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CJH 20
Physiological IonieStrength
DOSPA:DOPE (1:1) (+5)
