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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Tenoutasse, N. (1961). Les nucléotides acidosolubles et l'action des aminoacides sur le métabolisme de l'adénine chez Saccharomyces cerevisiae (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
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université libre de bruxelles
FACULTE DES SCIENCES Service de Chimie Biologique
5 0, a V. F.D. Roosevelt Bruxelles
LES NUCLEOTIDES
ACIDOSOLUBLES
ET L’ACTION DES
AMINOACIDES SUR
LE METABOLISME
DE L’ADENINE CHEZ
« S ACCH AROM YCES
CERa^lSIAE”
Thèse présentée pour l'obtention du grade de
Docteur en Sciences Chimiques
N. TENOUTASSE
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FACULTE DES SCIENCES Service de Chimie Biologique
LES NUCLEOTIDES
ACIDOSOLUBLES
ET L’ACTION DES
AMINOACIDES SUR
LE METABOLISME
DE L’ADENINE CHEZ
« S ACCH AROM YCES
CEIWISIAE”
Thèse présentée pour l’obtention du grade de
Docteur en Sciences Chimiques
N. TENOUTASSE
Nous tenons à exprimer, en tout premier lieu, notre profonde gratitude à Monsievir le Professeur CHANTRENNE.
Il n’a cessé, au cours de ce travail, de nous prodiguer ses précieux conseils et de nous faire bénéficier de son expérience personnelle tout en nous assurant l’entière liberté dans nos recherches.
Nous aimerions le remercier tout spécialement pour notre formation en Biochimie que nous lui devons entiè
rement .
Notre reconnaissance la plus sincère s’adresse à Monsieur le Professeur BRACHET de nous avoir permis si
obligeamment de faire usage des ressources de son laboratoire.
Nous remercions vivement Monsieur le Professeur
;
AA ADN AN ARN ARN^ ARN^ ARN3 B
AMP, ADP et ATP GMP, GDP et GTP CMP, GDP et GTP UMP, UDP et UTP Nuclé. Particules RNP PC A Pi PP P.S. RNAase La R * S « TCA '^UMP YFA Aminoacide(s). Acide désoxyribonucléique. Acides nucléiques.
Acide ribo nueléique. ARN microsomial. ARN nucléaire. ARN soluble.
Base (purique ou pyrimidique).
Adénosine mono, di et triphosphate. Guanosine mono, di et triphosphate. Cytidine mono, di et triphosphate. Uridine mono, di et triphosphate. Nucléotide(s).
Particules ribonucléoprotéiques (ribosomes). Acide perchlorique. Ortophosphate. Pyrophosphate. Poids sec. La ribonucléase. La radio-activité spécifique. Acide trichloroacétique. Acide pseudouridylique.
Levure Yeast Foam traitée par 1*acriflavine.
PLAN DU TRAVAIL
A) Etude de 1*influence de l’état physiologique sur le pool nucléotidique acidosoluble de la levure (levure en crois sance exponentielle et levure en phase stationnaire), Nous avons étudié notamment la libération de nucléotides dans l’acide perchlorique à froid par des cellules en croissance active et des cellules au repos,
B) Recherche de composés peptides-nucléotides.
Grâce à l’emploi d’un aminoacide radio-actif, nous avons pu mettre en évidence la formation de composés contenant des nucléotides et des acides aminés.
C) Action des précurseurs des protéines sur l’incorporation de 1’adénine-Ô-dans les acides nucléiques de levure.
Au cours de ces recherches, nous nous sommes intéressés au métabolisme de différents types d’ARN cellulaire.
Nous avons établi la distribution de l’ARN cytoplasmique et avons étudié l’incorporation de l’adénine et l’action des AA sur cette incorporation dans les différents AA.
Depuis plusieurs années, on sait que les organismes vivants possèdent un pool nucléotidique analogue à celui des acides aminés. L’intérêt de ces nucléotides libres, qui se trouvent dans les tissus et les microorganismes, réside dans leur double fonction ; ils sont non seulement les éléments de l’édification des acides nucléiques, mais ils interviennent également en tant que coenzymes dans diverses réactions cellu laires indispensables à la vie. En effet, nombreux sont les phénomènes vitaux où les nucléotides jouent un rôle catalytique.
Nous soulignerons surtout que dans les réactions d’oxy- do-réduction et de phosphorylation, qui fournissent de l’énergie pour permettre à l’organisme de synthétiser ses macromolécules, les nucléotides ont des fonctions essentielles. Nous n’insiste rons pas sur les fonctions des nucléotides comme coenzymes, mais nous nous intéresserons surtout à leur participation dans la biosynthèse des macromolécules tels que les acides nucléiques et les protéines.
Différents chercheurs ont montré que ces nucléotides libres sont des précurseurs des acides nucléiques et que leur rôle dans la synthèse des protéines est capital. Nous présen terons dans un chapitre suivant l’état actuel de nos connais sances sur la participation active de ce matériel nucléique
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carence en composés exigés pour les auxotrophes, etc. •••), on trouve également un net changsnent quantitatif et qualitatif dans le pool nucléotidique.
Par exemple SPIEGELMAN et ses collaborateurs (1), qui ont mis en évidence la présence de ce pool nucléotidique dans la levxire, ont trouvé que la capacité de biosynthèse d^enzymes adaptifs chez cet organisme est intimement liée au pool nucléo tidique ,
De même, lorsque l’état physiologique d’une cellule change, oh remarque aussitôt un changement dans les nucléotides libres intracellulaires, La comparaison entre le comportement des nucléotides d’une cellule qui est en croissance active avec les nucléotides de la même cellule au repos indique que ces composés sont les précurseurs des acides nucléiques et partici pent activement*- à l’élaboration des protéines.
En outre, de nombreuses recherches ont mis en évidence la présence des composés dits nucléotides-peptides ; ces compo sés pourraient être des intermédiaires dans la synthèse des protéines. L’étude de ces composés nous aide à déterminer le rôle des acides nucléiques dans la biosynthèse des protéines.
En effet, depuis l’hypothèse de BRACHET (2) et de CASPERSSON (3), selon laquelle les acides nucléiques intervien nent dans la biosynthèse des protéines, de nombreux chercheurs ont essayé de comprendre le mécanisme qui permettrait aux acides nucléiques une telle intervention.
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nucléiques qui imposeraient cette spécifité d*une façon ou d»une autre, lors de leur intervention dans la synthèse des protéines. Actuellement, on ne connaît pas encore ce mécanis me, mais les études sur les différents ARN et leurs fonctions
ont permis de comprendre 1*importance biologique des différents ARN et leur rôle et aussi de suggérer des hypothèses plus préci ses ,
Comme nous 1*avons dit plus haut, 1*étude des nucléo tides libres qui sont des précurseurs des ARN dans un organisme en croissance exponentielle synthétisant d*une façon irréversi ble les protéines est un moyen favorable pour comprendre le métabolisme des acides nucléiques. En utilisant un précurseur radio-actif et en suivant la vitesse de l’incorporation dans les différentes fractions cellulaires, y compris les nucléotides libres, on a également pu montrer que l’ARN cellulaire est méta- boliquement hétérogène. Ces ARN peuvent intervenir dans les étapes diverses de la synthèse des protéines.
Dans l’état actuel de nos connaissances, nous savons que l’ARN dit soluble (ARN ), dont nous étudierons les proprié- tés chimiques et les fonctions biologiques en détail dans un autre chapitre, joue un rôle tout à fait distinct de celui de l’ARN qui se trouve dans les microsomes et de l’ARN nucléaire. Nous avons déjà rappelé qu’il existe un grand nombre de travaux consacrés aux rôles des acides nucléiques dans la biosynthèse des protéines, mais le problème concernant la nécessité éven- tuelle des synthèses protéiniques povir la formation des acides nucléiques n’a été abordé que de façon préliminaire ; et les résultats obtenus sont souvent contradictoires.
En effet, bien qu’on ait réussi à démontrer qu’il y a moyen de bloquer la formation des protéines, sans empêcher la
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(chloromycétine, Ô-azaguanine, etc, divers chercheurs ont mis en évidence une relation obligatoire entre les aminoacides et la synthèse des polynucléotides in vivo.
En plus, 1*ARN synthétisé en l’absence d’une synthèse des protéines présente souvent des anomalies, à savoir : cet ARN est incapable de remplacer l’ARN normal cellulaire dans ses fonctions et l’ARN formé en l’absence de protéines est plus labile vis-à-vis des agents qui dégradent chimiquement ou enzy- matiquement l’ARN. Il ne s’agit pas de discuter les propriétés et les anomalies des ARN formés lorsque la formation des protéi nes est inhibée, mais il existe de nombrexix travaux et hypothè ses qui suggèrent une synthèse concomitante des protéines et de l’ARN. Etant donné les quantités relatives d’ARN et de protéi nes dans une cellule, l’hypothèse selon laquelle on aurait une liaison peptidique entre deux aminoacides chaque fois qu’on a une liaison diester entre deux nucléotides est exclue.
Autrement dit, toute la protéine et l’ARN cellulaire ne sont pas synthétisés simultanément ; le problème devient encore plxis
compliqué en tenant compte que les aminoacides (c’est-à-dire les éléments de l’édification des protéines), pevcvent jouer un rôle dans la synthèse des acides nucléiques qui est indépendante de leur participation dans la formation de liaisons peptidiques. F. GROS et F. GROS (4).
Le fait que les AA sont nécessaires pour la synthèse des acides nucléiques a poussé certains auteurs à imaginer qu’un précurseur commun pourrait donner naissance aux protéines ou/et aux acides nucléiques. MICHELSON (5).
tion des nucléotides dans 1*ARN des microsomes a attiré 1•atten tion de plusieurs chercheurs et surtout celle de HULTIN et
col, (6).
En effet, nés chercheurs ont observé que dans certaines conditions un mélange d^aminoacides stimule l'incorporation des nucléotides dans l'ARN des microsomes.
L'étude de l'action de tous les aminoacides sur l'incor poration d'un précurseur déterminé des acides nucléiques chez un organisme choisi dans les conditions adéquates nous a paru favo rable pour donner des précisions sur la fonction des aminoacides dans la synthèse des acides nucléiques.
CHANTRENNE (7), en étudiant la biosynthèse adaptative des enzymes respiratoires et le métabolisme des acides nucléi ques chez la levure a montré que les purines exogènes peuvent être employées par cet organisme pour synthétiser les acides nucléiques. Nous avons choisi l'adénine-Ô-^^C comme précurseur des acides nucléiques et, dans une partie de ce travail, nous avons étudié l'effet d'un mélange de tous les aminoacides sur l'incorporation de cette base dans les ARN,
Nous croyons qu'en travaillant in vivo dans des condi tions favorables, les conclusions obtenues sont plus significa tives que lorsqu'on vérifie l'effet des aminoacides sur l'incor poration d'un précurseur d'ARN in vitro comme l'a fait HULTIN (6). En effet, on n'est pas encore certain, qu'en désintégrant les
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des aminoacides sur 1*incorporation de l'adénine chez la levure au repos, en absence d'azote et souvent dans des conditions où la croissance est bloquée par une dose suffisante de R.X. ;
mais comme l'a montré CHANTRENNE (7), l'organisme dans ces condi tions est toujours capable de synthétiser les protéines et l'ARN,
Nous avons fait allusion plus haut à l'hétérogénéité des ARN cellulaires et à la différence qui existe métabolique- ment entre ces ARN. De nombreux chercheurs ont déjà montré que
lorsque des précurseurs marqués s'incorporent dans les acides nucléiques, la radio-activité spécifique des ARN de différentes fractions cellulaires est tout à fait différente. Les fractions les plus importantes qui ont été étudiées, surtout dans le foie des mammifères, sont : le noyau, les microsomes et la solution qui surnage après qu'on ait recueilli les microsomes par centri fugation. Le résultat obtenu après incorporation suivie d'un fractionnement est le suivant : on peut dire que souvent l'ARN nucléaire est le plus radio-actif et que l'ARN des microsomes a une radio-activité moins élevée que celle de toutes les autres fractions, tandis que l'ARN^ occupe une place intermédiaire. Mais en ce qui concerne notre travail, sans négliger toutefois le rôle de l'ARN nucléaire, nous nous sommes intéressés aux ARN cytoplasmiques et à leur métabolisme.
Des recherches très récentes ont établi qu'un ARN déter miné, qui se trouve dans le cytoplasme de toutes les cellules,
précautions et des précisions pour le choix des conditions
expérimentales, car les organites cellulaires sont très sensibles, surtout quand ils sont en suspension dans des milieux artificiels, aux conditions physico-chimiques du milieu qui les entoure :
la température, le pH, la force ionique et surtout la concentra tion de certains ions bivalents.
En profitant des résultats obtenus dans ce domaine, nous avons essayé de réaliser nos expériences de fractionnement dans les conditions où les organites sont suffisamment stabilisés pour que le fractionnement soit significatif et reproductible.
Les résultats indirects nous ont aidé à établir la distribution de l’AFlN dans les différentes fractions étudiées et à comparer nos résultats avec ceux des autres chercheurs. Nous avons également essayé, dans une partie de ce travail, de voir si l’état physiologique de l'organisme influence cette distribution. On sait que les quantités relatives d'ARN et de protéines subissent des changements remarquables au cours de la croissance cellulaire. Nous avons tenté de voir si ces change ments étaient propres à une fraction déterminée de l'ARN dans
le cytoplasme ou s'il s'agit d'un processus qui se manifeste dans toutes les fractions.
Pour l'hétérogénéité métabolique des ARN cytoplasmiques, nos conclusions concordent avec les résultats des études simi
laires obtenus par des méthodes différentes et sur d'autres orga nismes.
ô.
Pour comparer un constituant cellulaire chez un organisme dans ces deux états physiologiques, il faut se rendre compte du comportement des cellules dans chaque état. Par exemple, en période de croissance active, la synthèse des constituants cellu laires est un phénomène pratiquement irréversible, tandis que chez l’organisme au repos, la dégradation des macromolécules et leur renouvellement sont plus prononcés. A l'aide des études sur le turnover des macromolécules tels que les protéines et les acides nucléiques, on a tâché d'établir les caractéristiques métaboliques de ces substances dans les conditions déterminées de la croissance.
En interprétant nos travaux, nous nous sommes intéressés aux résultats de ces chercheurs et pour'tirer les conclusions, nous nous sommes rendu compte du comportement des constituants cellulaires dans nos conditions expérimentales.
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B. LES NUCLEOTIDES ACIDOSOLUBLES
L’étude systématique de la composition de différents tissus et microorganismes en nucléotides libres a pu être entre prise grâce à la mièe au point de nouvelles méthodes d’analyse très sensibles pour la séparation de divers nucléotides. Ce sont d’abord les tissus animaux qui ont attiré|1’attention de nombreux chercheurs, principalement POTTER et^col, (8, 9) et SCHMITZ (10).
J, GREGOIRE et ses collaborateurs (11) ont étudié les nucléotides libres des bactéries "MICROCOCCUS LYSODEIKTICUS” en phase stationnaire de croissance et ont mis en évidence la présence de i 5' - AMP et ATP, 5* - UMP et UTP, 5* - GMP et GTP, 5’ - CMP et GTP et de l’acide ionosine - 5' - monophosphate. Ces auteurs ont également trouvé dans 1’extrait acide de cet organisme d’autres adénosine-polyphosphates dont l’homogénéité n’a pu être démontrée de façon certaine. Etant donné l’absence des nucléotides anhydrides mixtes du type uridine diphospho- glucose, ces auteurs ont pensé à un ralentissement des synthèses dans les bactéries en phase stationnaire de croissance, et ils ont suggéré que ces nucléotides pourraient se trouver dans l’organisme en croissance exponentielle,
OKAZAKI et T. OKAZAKI (12) ont également étudié les composés désoxyribosidiques acidosolubles dans ’lLactobacillus acidophilus”, Ils ont choisi une souche de ”Lactobacillus
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active contient plus de ces dérivés que lorsqu'il est au repos. Les auteurs ont observé également une diminution dans ces
composés lors de la synthèse de 1*ADN, ce qui laisse à penser que ces composés interviennent dans la synthèse de 1*ADN.
MANDEL et KIETHI (13) ont trouvé des nucléotides mono, di et tri-phosphate de 1’adénine, de la guanine, de la cytosine, de l'uracile et de 1’hypoxantine dans le cristallin de veau.
Ces auteurs ont observé un changement dans les nucléotides de cet organe d*après les différentes zones de 1*organe et aussi diaprés l^âge des cellules. Ils ajoutent enfin que les cellules jeunes contiennent plus de nucléotides acidosolubles que les cellules anciennes,
NOHARA et OGATA (14) ont étudié ces composés dans la rate pour lexir intérêt dans la biosynthèse des acides nucléiques et le changement subi par ces composés lors d*une irradiation totale du rat par les R.X, Ces chercheurs concluent que la
synthèse des nucléotides n*est pas modifiée par les R.X. ; c*est en effet la synthèse de 1*ADN qui est endommagée.
SIEDIER et SCHWEIGERT (15) attribuent un rôle très impor tant axix ribonucléotides dans le métabolisme de 1*ADN chez
'•Lactobacillus acidophilus R - 26”. L*étude de croissance de ”L, a, R - 26” montre que la quantité des 5* - désoxynucléotides est influencée réversiblement par les ribonucléotides. Par
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En analysant la fraction acidosoluble et les bases des acides nucléiques, on conclut que les ribonucléotides peuvent servir de régulateurs pour contrôler le métabolisme de l’ADN,
FRANZEN et BINKLEY (16) ont étudié les nucléotides acidosolubles chez ”E, coli” en fonction de la croissance, par chromatographie sur échangeur d*ions. Ils ont trouvé que le rapport d»ATP sur ADP et AMP est égal à 100 sur 12 et 2 dans toutes les Conditions de croissance étudiées.
CARTER (17) a également mis en évidence le changement dans les nucléotides de fraction acidosoluble quand le métabo lisme cellulaire est troublé. En effet, cet auteur a observé une nette augmentation de nucléotides libres guanyliques chez
"L. casei” quand on traite cet organisme avec du chloramphénicol.
WŒZUNO et col, (1Ô) ont fait des recherches intéressantes sur les nucléotides acidosolubles dans les thrombocytes de boeuf. Ces chercheurs ont découvert la présence d*au moins 10 nucléotides dans les thrombocytes du sang de boeuf normal. On a aussi analysé les nucléotides des érythrocytes du même sang.
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SVARD (19) a aussi étudié les nucléotides acidosolubles du "Saumon" pendant le développement. Pour trouver le précurseur de la guanine qui apparaît en grande quantité dans la peau du saximon au cours de ses transformations, ce chercheur a fait une étude systématique sur les nucléotides du sang de 1*animal. Les nucléotides sont extraits par PCA 0,6 N et séparés par chromato graphie sur Dowex-I (formiate). Encore une fois, on observe un changement net des nucléotides acidosolubles au cours de la
métamorphose du saumon et ce changement est surtout prononcé pour GTP. La comparaison entre les nucléotides du sang de ce poisson et ceux d’autres tissus montre que dans la période de métamor phose du saumon la teneur d^i, s«ng de ce poisson en GTP est relati vement très élevée.
GILBERT et YEMM (20) ont fait une recherche sur le pool nucléotidique de la levure "Torulopsis utilis" et ont conclu également que ce pool est sujet à changements significatifs en quantité et qualité dans différentes étapes de la croissance. Ces auteurs déduisent que le métabolisme de ces nucléotides est intimement lié à la biosynthèse des acides nucléiques et des protéines. Dans ces recherches, les nucléotides sont extraits par l’éthânol - 60 % - à froid, et après élimination du solvant, ils sont séparés par chromatographie sur éqhangeur d’ions.
On trouve les nucléotides suivants :
AMP, ADP, ATP, UMP, UDP-X. UTP, GMP, GDP, GTP, CMP, IMP, DPN, TNP, FMN.
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Les acidosolubles de ”E. coli" ont été étudiés par 0*DONELL (21), Cet auteur a trouvé dans cet organisme des substances semblables à celles qui ont été trouvées dans les tissus et les autres microorganismes,
D.B. GOLDSTEIN, BROWN et A. GOLDSTEIN (22, 23) ont étudié 1»effet de la carence d^une aminoacide exigé sur les acidosolubles d*un mutant auxotrophe de ”E, coli”. Ces expé riences sont très intéressantes, car nous verrons plus loin que l’absence d’un aminoacide chez un mutant auxotrophe exigeant cet aminoacide inhibe fortement la synthèse de l'ARN, Le mutant est ”E. coli-K^2~^®’^c”. Les rapports des bases pour le pool
nucléotidique entier est : adénine 1, uracii® 0,6, hypoxantine 0,4 et gxianine, cytosine, xantine, chacune environ 0,1, Durant la privation de leucine, l'uracile augmente par rapport au contrôle; ATP, CTP sont également augmentés. Il semble que l’absence de leucine ne change pas la teneur de pool nucléotidique en GTP. Ces autexirs suggèrent que, suite au manque de l’aminoacide
exigé, l’accumulation de dérivés puriques et pyrimidiques est un résultat secondaire du blocage de la synthèse de l’ARN.
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C. LES COMPOSES NUCLEOTIDES-PEPTIDES
L*identification de ces composés et la découverte de leur rôle"dans la cellule vivante sont d’une importance capitale pour la synthèse des protéines ; elles permettraient peut-être de choisir entre les différents mécanismes de la biosynthèse des protéines qu’on considère actuellement comme possibles.
Nous citons ci-dessous quelques travaux consacrés à la recherche et à l’identification de ces composés dans les diffé rents organismes,
BROWN (24) a trouvé et étudié ces composés chez "Streptococcus faecalis”. Les cellules sont précipitées à l’alcool et le précipité ainsi obtenu est soumis à une dialyse. En utilisant l’électrophorèse et la chromatographie sur papier, on a cherché les composés nucléotides-peptides dans le dialysat et la fraction non dialysée. Quand on analyse les composés
peptides-nucléotides qui se trouvent dans la fraction non dialy- sable, on trouve que l’adénine est la seule base détectable après hydrolyse. L’hydrolyse acide complète de ces composés libère
une série d’aminoacides, parmi lesquels Gly, Glu, Asp'I,sont toujours présents et prédominants, La stabilité relative des composés
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KONINGSBERGER (26) et ses collaborateurs ont fait des recherches systématiques sur les composés peptides-nucléotides qui existent dans la levure de boulangerie, A l’aide de la séparation électrophorétique, ils ont mis en évidence plusieurs de ces composés. En outre, d’après la réaction de ces substances avec 1’hydroxylamine, les auteurs pensent qu’il existe dans ces composés des carboxyles activés. Les microsomes préparés à partir de cet organisme réagissent également avec l’hydroxyla mine, mais cette réaction étant très lente au départ, on croit qu’il existe un agent protecteur des groupements carboxyles
activés dans les microsomes. Si on sépare par la chromatographie, l'extrait alcoolique des RNP (microsomes) après la réaction avec 1'hydroxylamine, on obtient des composés nucléotides-peptides qui sont plus homogènes que ceux trouvés dans le dialysat des cellules entières,
KONINGSBERGER croit que les nucléotides-peptides sont les intermédiaires dans la synthèse des protéines. En partant de l’activation des aminoacides par ATP, il donne le schéma suivant poxir la synthèse des protéines :
R
t
1. - E + ATP + R - CHNH2 - COOH ---^ E - AMP CO - CH - NHg + PP
R R
t I
2. - E - AMP COH-CH-NH2 + Nuclé ---^ Nuclé CO - CH - NH2 + E + AMP R
t
3. - Nuclé CO - CH - NH2 —^ Nuclé CO - peptides
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Dans ces équations Nuclé représente des oligo ou des polynucléotides qui sont dans le surnageant. Les composés qu*on trouve, sont vraisemblablement les produits de la réaction 3. En discutant de 1 *inccîrporation des aminoacides et de la biosyn thèse des protéines, nous verrons si ce schéma correspond avec nos connaissances sur la synthèse des protéines.
Il y a beaucoup de travaux consacrés à la recherche de ces composés dans les tissus des animaux et particulièrement dans le foie des mammifères,
D, HAMMOND et col, (2?) ont étudié les peptides associés avec les nucléotides dans un éxtrait de foie de rat ; la méthode
de séparation de ces composés ressemble à celle que nous avons choisie dans nos expériences. On extrait l’homogénatdu foie par Norit, et puis on élue les composés absorbés par un mélange
éthanol, eau, triéthylamine. L’éluant est évaporé à 37® G et on reprend le résidu dans l'eau pour le soumettre à la chromatogra phie sur l'échangeur d'ions (Dowex - 1). En éluant les substan ces qui ont été absorbées sur Dowex- 1, on trouve que souvent les fractions qui absorbent dans l'U.V. (présence des nucléotides) contiennent des aminoacides. Les fractions qui contiennent CMP, ADP, UDP et surtout AMP sont nettement positives à la ninhydrine après l'hydrolyse. Après l'hydrolyse, les aminoacides ont été identifiés par chromatographie sur papier,
WILKEN et HANSEN (2Ô), en utilisant une méthode tout à fait semblable à celle qui vient d'être décrite, ont étudié les nucléotides associés avec les aminoacides ou peptides dans le foie de boeuf. Les auteurs ont observé que les taches dans la chromatographie sur papier qui absorbent dans 1*U,V, coïncident toujours avec celles qui réagissent avec la ninhydrine.
moitié nucléotidique de ces composés ; on a montré aussi que le rlbose est le seul sucre qui se trouve dans ces composés,
SEIFTER et BERKMAN (29) ont fait des recherches sur ces substances et ils ont surtout trouvé que quand on adsorbe ces substances de 1*extrait de foie par Norit et qu’on élue ces■ composés, l’éluant est positif à l’hydroxylamine à température ordinaire aussi bien qu’à des températures plus élevées.
Le rôle métabolique d’un composé peptide-nucléotide et sa composition chimique ont été étudiés en détail par STROMINGER et ITO (30) chez ”S, aureus”. Quand on traite ce micro organisme par certains antibiotiques, on assiste à l’accumulation d’un composé qu’on a identifié comme étant :
UDF - GNAC - Lactyl - (L)-ala - (D) - glu - (L)-lys - (D)ala - (D)-ala.
Lîaccumulation des nucléotides qui portent une chaîne peptidique, suite à l'inhibition de croissance chez les microor ganismes est considérée comme une indication de ce que la synthèse des protéines se ferait par étapes (”Stepwise”). Mais étant donné que l’antibiotique qui fait accumuler ce composé est la pénicilline et que nous savons que cet antibiotique bloque la synthèse des
1Ô.
F. MANDELSTAM (32) et CHANTRENNE (33) ont constaté le ir.ême phénomène ; le 8-azaguanine inhibe la biosynthèse des protéines cytoplasmiques sans influencer celle des peptides de parois cellulaires.
E, HASE et col. (34) ont fait des travaux sur les composés peptides-nucléotides chez ”la levure” et "Chlorella”.
On extrait ces substances par TCA - 10 - et on les sépare par la chromatographie sur Dowex - 1. Ces chercheurs montrent
que les fractions qui absorbent dans rtU.V, sont positives à la ninhydrine ; en plus ils ont montré que le ribose est le seul sucre qui existe dans ces composés.
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D. LA SYNTHESE DES PROTEINES
La formation des chaînes polypeptidiques à partir des aminoacides, dans les conditions compatibles avec la vie, est un phénomène endergonique, Chaque cellule vivante fabrique un nombre défini et constant de protéines parmi les innombrables combinaisons possibles. Le fait que 1'organisme vivant synthé tise exclusivement quelques protéines déterminées prouve qu'il dispose d'un mécanisme de sélection ou d'un système qui impose des structures définies aux polypeptides synthétisés. Il est à noter que la dépense énergétique de cellule, pour imposer l'arran gement particulier d'une protéine, n'est pas négligeable, car elle est du même ordre de grandeur que celle qui est indispensa ble pour la liaison peptidique - CHANTRENNE (35).
Au point de vue énergétique, nous verrons que l'on est certain que c'est le couplage de la synthèse des protéines avec les réactions de phosphorylation qui dirige le système dans le sens de la synthèse,
En ce qui concerne le problème de l'organisation,
quoiqu'on ne possède pas de preuves expérimentales directes tout à fait convaincantes, on croit que c'est dans la relation entre trois raacromolécules ; ARN, ADN et protéine qu'il faut chercher la responsabilité des spécifités biologiques.
Nous verrons la relation entre l'ADN, l'ARN et protéine; ensuite, comme nous l'avons déjà dit, nous étudierons en détail l'incorporation des aminoacides et leur activation, ainsi que le rôle d'un acide nucléique défini dans ce phénomène.
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E. LES ACIDES NUCLEIQUES ET LA SYNTHESE DES PROTEINES
Ce problème est traité dans de nombreuses publications. On peut noter ici un article de CHANTFIENNE (36) (”Annual review of biochemistry")I dans lequel il traite la biosynthèse des protéines en relation avec celles des acides nucléiques.
Au sujet de la relation entre 1*ARN et la biosynthèse de protéines, on trouvera le détail dans les publications de BRACHET, et surtout dans ”Biochemical cytology” (37).
Enfin, ajoutons un excellent chapitre de ”A symposium on the Chemical basis of heredity" par SPIEGELMAN (3Ô) sur le même sujet.
Nous rappellerons dans ce chapitre quelques travaux qui ont un rapport avec nos recherches sur le métabolisme des acides nucléiques et l'incorporation des aminoacides. Les questions qu'il faut envisager sont :
1) Une synthèse simultanée d'ARN est-elle nécessaire pour la synthèse des protéines ?
2) L'intégrité physique de l'ARN cellulaire joue-t-elle un rôle dans la biosynthèse des protéines ?
Nous avons déjà fait allusion à l'hypothèse de BRACHET et CASPERSSON (2), selon laquelle il existe un lien entre la teneur d'un organisme en ARN et la capacité de cet organisme pour fabriquer ses protéines. Les recherches très récentes
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BEN-ISHAI (39) a étudié la relation entre la synthèse d’ARN et celle des protéines chez "E. coli". Cet auteur a trouvé que la quantité de protéines formées est proportionnelle à la quantité d'ARN synthétisé durant la synthèse des protéines et non à l’ARN total qui existe dans la cellule. En étudiant la biosyn thèse adaptative de -galactosidase, il a trouvé que même si 1*ARN préformé est synthétisé en présence de l’inducteur, cet ARN n’a aucun effet sur l’induction de -galactosidase.
Il existe de nombreux travaux qui montrent que l’ARN et même ses produits d’hydrolyse enzymatique stimulent la synthèse des protéines in vitro et in vivo.
NOMURA et col. (40) ont préparé un extrait de ”Bacillus subtilis” qui stimule la synthèse de l’amylase quand on l’ajoute aux cultures de cet organisme. L’analyse de l’extrait montre que la substance active dans la stimulation est l’ARN, et encore, que la digestion de l’extrait par la ribonucléase ne diminue pas son action sur la culture de ”B. subtilis”. Lorsqu’on vérifie la spéci- fité de ce facteur, on trouve qu’il n’est pas tout à fait rempla- qable par l’ARN d’autres sources. Si on compare l’augmentation d’incorporation de glycine- dans les protéines sous l’action de ces extraits, on trouve que l’extrait provenant de "B. subtilis” est plus efficace que l’ARN de levure et ses produits d’hydrolyse par la RNAase, Il est xin fait bien établi que les bactéries en croissance qui synthétisent abondamment des protéines sont plus riches en ARN que les bactéries au repos.
WADE et MORGAN (4I) ont observé que le niveau de l’ARN augmente de 1,3 à 16,5 fois en phase exponentielle de croissance chez une douzaine d’espèces bactériennes essayées.
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NEIDHART et MAGASANIK {k2j, dans un excellent travail consacré au rôle de l’ARN dans la croissance bactérienne, ont étudié très récemment les relations entre l'ARN, l'ADN et les protéines chez "Aerobater aerogenes". MAGASANIK, en suivant la croissance de cet organisme dans des conditions différentes de croissance normale et diauxique, conclut qu'à une température donnée la quantité de l’ARN se trouvant dans un organisme est une fonction directe de croissance ; en changeant les conditions de croissance, le changement se manifeste d’abord dans la synthèse de l'ARN et ensuite dans celle d'autres macromolécules.
Par exemple, quand la vitesse de croissance diminue dans une croissance diauxique, la synthèse de l’ARN est plus profondément touchée que celle des protéines et celle de l’ADN. Les auteurs discutent deux problèmes essentiels :
1) Le rôle de l’ARN dans la synthèse des protéines. 2) Le contrôle métabolique de la biosynthèse de l’ARN.
SALZMAN (42^) a aussi étudié la relation entre la synthèse de l’ARN, de l'ADN et des protéines chez les cellules de mammifères cultivées in vitro (les cellules HELA). Il a
trouvé que l’incorporation des précurseurs radio-actifs dans les différentes macromolécules change d’après la croissance.
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dans la restauration de 1 ’incCi^poration d’aminoacides dans ces préparations.
En employant différentes méthodes, les antibiotiques, des mutants cultivés dans des conditions particulières et des analogues, il y a moyen de dissocier la synthèse de protéines de celle de 1*ARN. De nombreuses substances inhibent presque complètement la biosynthèse des protéines sans influencer profon dément celle des acides nucléiques. Mais il est difficile de vérifier si l'ARN synthétisé dans ces conditions est biologique ment fonctionnel. Malheureusement, on ne connaît pas de méthodes telle que la mesure de l*activité enzymatique pour les protéines, qui soit applicable aux ARN, pour vérifier directement si l’ARN formé dans les conditions anormales, remplace biologiquement l’ARN normal cellulaire,
HAHN et col. (44) ont observé que le chloramphénicol inhibe la synthèse des protéines chez ”E. coli” sans bloquer celle des acides nucléiques, La quantité d’ARN accvimulé en présence du chloramphénicol pendant 3 heures est 3 fois plus importante qu’au départ, mais cet ARN est rejeté par l’organisme quand on enlève l’antibiotique.
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surtout parce que dans ces conditions, le rapport pro-t4j^nes est profondément changé,
BREITMAN et col* (45), en étudiant l’effet du chloram- phénicol sur la synthèse des protéines et celle des acides nucléi ques dans les noyaux isolés de thymus, remarquent que, dans ces conditions, avec des concentrations de chloraraphénicol supérieures
à 3,6 X cet antibiotique inhibe non seulement l’incorpora
tion des AA dans les protéines, mais inhibe également celle de dans les acides nucléiques. Il est curieux que cet anti biotique inhibe la synthèse de l’ARN dans les noyaux isolés ; peut-être existe-t-il dans les noyaux une relation plus directe entre la synthèse des protéines et celle de l’ARN que dans le cytoplasme,
TAKEYAMA, MIURA et ITO {46) ont étudié l’effet de la RNAase et 6-uracilméthylsulfone (6-U) sur l’incorporation de glycine-^^C et d’acide orotique-^^C dans les protéines et l’ARN dans les glandes sericigènes du ver à soie. Ces auteurs ont trouvé qu’en inhibant l’incorporation d’acide orotique par 6-U, l’incorporation de glycine-dans la soie n’est pas inhibée du tout ; ce résultat n’est pas en faveur d’une synthèse simultanée de l'ARN et des protéines. Dans ces conditions, la RNAase inhibe presque complètement la synthèse des fibre§, il semble donc que l’intégrité de l’ARN est exigée pour la synthèse de la soie.
SHEININ et Mc QUILLEN (47) ont pu montrer que la pénicil-i
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synthèse adaptative d’un enzyme prouve que l’antibiotique n’altère pas le métabolisme de l’ARN cytoplasmique, car nous verrons que le phénomène d’induction est intimement lié au métabolisme de l’ARN.
JEENER {1+8) a observé également que la RNAase inhibe la synthèse des protéines de phage chez "Bacillus megaterium”
infecté par un phage. L’auteur constâte que le métabolisme de l’ARN joue un rôle principal dans ce cas, et il trouve que l’effet létal de la RNAase est plus fort si on l’ajoute au début de l’induc tion. Ajoutons encore que JEENER trouve que l’inhibition de la synthèse des protéines par la RNAase est plus prononcée pour les protéines de phage que pour les protéines cellulaires. L’auteur pense que la RNAase modifie la structure de l'ARN qui fonctionne rait comme un "template” dans la synthèse des protéines de phage.
ASTRACHAN et VOLKIN (49) obtiennent des résultats inté ressants en étudiant l’effet du chloramphénicol sur le métabo lisme de l’ARN chez ”E. coli” infecté par T^, Si le chloramphé- nicol (CL) est ajouté avant l’infection, la distribution de P parmi les mononucléotides est différente de celle des bactéries
infectées par T^, mais sans (CL), et ressemble à la distribution
32 ^
de P dans les bactéries non infectées.
Si on ajoute (CL) neul’ minutes après l’infection, la distribution de ^ P ressemble à celle des bactéries infectées. On voit que si les cellules infectées par T2 sont traitées avant ou peu après l’infection par (CL), le turnover de l’ARN et la synthèse de l’ADN sont touchés. Mais l’antibiotique, ajouté après 10 minutes,
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PEABODY et HURWITZ (50) ont étudié la relation entre la synthèse de l’ARN et celle des protéines lors de la biosynthèse adaptative de^-galactosidase chez les sphéroplastes de "E. coli” obtenus par le traitement à la pénicilline. Quand on induit la formation de/3-galactosidase par un inducteur qui n»est pas substrat, le méthyl-p-D-thiogalactopyranoside (TMG), on obtient une synthèse nette de protéine sans avoir une synthèse d*ARN. Mais si l’on induit la synthèse d’enzyme par un inducteur qui est substrat, le lactose, on observe que la synthèse de l’ARN n’est pas complètement inhibée. Les auteurs pensent que dans le cas où (TMG) est inducteur, le système ne dispose pas d’énergie suffisante pour permettre la réalisation de la synthèse de
l’enzyme et celle de l’ARN et c’Ist la synthèse de l’ARN qui est inhibée sélectivement. On voit que l’hypothèse selon laquelle une nouvelle synthèse d’ARN serait indispensable pour la synthèse des protéines n’est pas confirmée par ces résultats.
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CHAKRAVORTY ( 52) a examiné l’effet.des différents antibiotiques et analogues : chloramphénicol, streptomycine,
pénicilline,;parafluorophénylalanine et Ô-azaguanine sur l'incor-poration de P et S dans les acides nucléiques et les protéines de "Azotobacter vinelandii” in vivo et in vitro. Les résultats
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confirment qu’il y a moyen de bloquer l’incorporation de S dans OO les protéines sans toucher profondément à l’incorporation de P dans les acides nucléiques. Par exemple, le chloramphénicol inhibe l’incorporation de dans les protéines de 90 tandis que 1’incorporation de ^ P dans les acides nucléiques est inhibée
-de 9 % seulement,
GORMAN et HALVORSON (53), en étudiant la synthèse des protéines et des ARN, ont conclu qu’on ne peut pas admettre que toute la protéine et tout l’ARN cellulaire soient synthétisés simultanément, mais cependant on ne peut pas exclure l’hypothèse selon laquelle la synthèse des protéines est couplée avec une fraction particulière de l’ARN cellulaire. Ces chercheurs, en suivant le étudiant l’effet de l’héxétidine
(bis-1,3-p-éthylhexyl-5-méthyl-5-aminohexahydropyrimidine) sur ce rapport, ont trouvé que ce dernier est sujet à des variations appréciables. En effet, chez ”Pseudomonas azotogensis”, ce
rapport est augmenté de 2 sous l’influence d’héxétidine,
On observe que l’héxétidine n’a pas d’influence sur le métabo lisme de l’ARN, car l’incorporation de ^^P n’est pas changée par cet agent, mais au contraire, l’incorporation de la phényl- alanine- est augmentée dans les protéines,
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ARONSON et SPIEGELMAN (55) trouvent que l'ARN synthé tisé, quand la formation des protéines est inhibée par le chloramphénicol est un ARN normal. L’antibiotique agirait en bloquant la transformation de l’ARN polymérisé qui est instable en ribonucléoprotéines stables.
HORWITZ, SAUKKONEN et CHARGAFF (56) ont observé que chez un mutant a\ixotrophe de "Escherichia coli uracile””, la synthèse des protéines est bloquée en l’absence d’uracile. Si, au lieu de l’uracile, on donne à ce mutant de la 5~fluorouracile, on
mesure une synthèse nette de protéines par la réaction du biuret. Mais on ne peut pas induire la biosynthèse adaptative de
|3-galactosidase en présence d% la 5-fluorouracile au lieu d’uracile.
T. OKAZAKI et R. OKAZAKI (57) ont trouvé des résultats semblables dans un autre organisme "Lactobacillus acidophilus R-26", ce mutant exige en plus des désoxyribosides, de l’uracile et deâarainoacides. Si on élflnine l’viracile, la synthèse de
l’ARN et celle des protéines sont parallèlement inhibées, mais la formation de l’ADN, loin d’être inhibée, est fortement
stimulée.
BARNER et COHEN (58) ont choisi "Escherichia coli-15-T“-U“” qui est un mutant polyauxotrophe de la thymine et de l’uracile
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nécessaire pour la synthèse des protéines ; l*utilisation de glucose- comme précurseur de ribose en l’absence de l’uracile confirme cette idée. En l’absence de ces deux pyrimidines et en la présence de glucose-^^C, la quantité d’isotope dans la thymidine est négligeable, donc on n’aurait pas de synthèse d’ADN.
LOGAN, FICQ et ERRERA (59), en étudiant l’incorporation de l*adénine-Ô-^^C et de la phénylalanine-2-^^C dans les noyaux du foie de rat, ont trouvé qu’après 1*hépatectomie partielle, le métabolisme des acides nucléiques est restauré plus tôt que celui des protéines. Ces résultats démontrent que la synthèse des
protéines est réglée par le métabolisme des acides nucléiques. Les mêmes auteurs (60) ajoutent qu’en inhibant partiellement la synthèse de l’ARN par l’irradiation des noyaux par R.X., on bloque complètement la synthèse des protéines.
P. FEIGELSON et M. FEIGELSON (61) trouvent qu’en indui sant la biosynthèse de tryptophane peroxydase chez le rat, le méta bolisme de l’ARN est modifié et que, surtout, on a une accéléra tion du turnover de l’ARN dans toutes les fractions. La cinétique de ce processus montre que le changement de turnover des ARN ne précède pas l’induction, il est plutôt le résultat de l’induction. L’augmentation de turnover dans les différentes fractions cellu laires est donnéejCi-dessous :
ARN des mitochond^f&s et des microsoraes : 260 %,ARNg : t54 % \ . ARN nucléique ; 60 Mais l’augmentation de la quantité absolue de l’ARN de ces fractions ne suit pas cet ordre et on a :
l’ARN nucléaire > l’ARN^ = l’ARN des microsomes > ARN mitochondrial,
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synthèse de l’ARN et celle des protéines ne sont pas simultanées dans le foie du rat. En effet, la cinétique de l’incorporation montre que les protéines deviennent plus vite radio-actives que
les acides nucléiques. L’étude du rôle de l’ARN dans la biosyn thèse adaptative des enzymes nous apporte des résultats très intéressants sur la synthèse des protéines en général.
SPIEGELMAN, HALVORSON et BEN-ISHAI (1) montrent que la présence des nucléotides libres, qui sont les précurseurs de l’ARN, dans la levure au repos, est une condition principale qui permet à l’organisme d’être le siège d’une induction enzymatique. L’addition d’analogues puniques et pyrimidiques, ainsi que l’appau vrissement du pool nucléotidique intracellulaire, diminuent sensi blement la capacité de synthétiser le nouvel enzyme .
Les mêmes auteurs observent qu’un mutant ”Escherichia coli" auxotrophe pour l’uracile ou l’adénine ne peut pas synthétiser la A-galactosidase en l’absence de ces bases.
Mais les résultats obtenus en utilisant la 5-hydroxy- uridine sont très cxirieux : comme SLOTNICK et ses col. (63) l’ont montré, cet analogue empêche l’utilisation de l’uracile pour la synthèse de l’ARN. Les''Qjpnçentrations faibles - environ
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un substrat qui, primitivement était incapable de l’attaquer, est plus sensible au métabolisme des ARN que les protéines constitutives normales cellulaires.
Les résultats de CREASER (64) obtenus par l’action de 8-azaguanine ou de 2,6 - diaminopurine sur les synthèses
induites de catalase et de la-galactosidase chez ”Staphylo- coccus aureus” appuient ce concept. L’auteur utilise deux
souches de ”Staphylococcus aureus” ; on peut induire la synthèse de la^-galactosidase dans les deux souches, mais la formation de la catalase est induite dans une souche et constitutive dans l’autre. La Ô-azaguanine inhibe la synthèse induite des enzymes, non seulement si on l’ajoute en même temps que l’inducteur, mais aussi quand la synthèse du nouvel enzyme a atteint n’importe quelle vitesse, tandis que l’analogue n’altère pas la formation de la
catalase et de la glucozymase constitutives. L’auteur croit que la différence réside dans le fait que l’ARN qui est responsable de la spécifité biologique des enzymes adaptatifs est plus
labile que l’ARN qui sert comme template (model) pour les enzymes constitutifs.
Cette interprétation n’est pas confirmée par d’autre système, car CHANTRENNE (65) montre que la Ô-azaguanine inhibe la synthèse de pénicillinase chez ”Bacilus cereus" de la même façon quand l’enzyme est constitutif ou adaptatif.
En outre, GROS et SPIEGELMAN (66) trouvent que la
formation de^-galactosidase Constitutive est aussi bien inhibée que la synthèse adaptative de ^-galactosidase chez ”Escherichia coli” par 5-hydroxyuridine.
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utilisé les protoplastes de "Bacillus megaterium".
WEIBULL (67) a préparé les protoplastes de ”Bacillus megaterixxm” en traitant cet organisme par lysozyme ; depuis, on
a montré que ces protoplastes conservent la capacité de synthé tiser des macromolécules pourvu que le milieu qui les entoure soit adéquat pour leur stabilité, surtout au point de vue pres sion osmotique. Ces protoplastes peuvent même synthétiser les enzymes adaptatifs.
WI|tME et ses collaborateurs (6B) montrent que les protoplastes de "Bacillus subtilis" peuvent synthétiser de l’arabinokinase en présence de l'arabinose dans les conditions favorables où les particules conservent leur intégrité.
LANDMAN et SPIEGELMAN (69) ont souligné également la capacité des protoplastes de ”Bacillus megaterium” de synthétiser après induction la rt-galactosidase.
SPIEGELMAN (3Ô) a montré par deux méthodes la nécessité de l*intégrité physique de l’ARN dans la synthèse enzymatique. Si l*on traite les protoplastes de ”B. megaterixim” par la RNAase, on voit qu*en dégradant environ 35 io de 1*ARN du système la
synthèse induite de ^-galactosidase est complètement inhibée. En outre, l*auteur a réussi à enlever 1*ARN des protoplastes par le choc osmotique dans les conditions attentivement contrôlées ; les chocs osmotiques qui ne modifient pas le rapport
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Par cet aperçu bibliographique, on peut se rendre compte que les résultats expérimentaux sont souvent contradic toires et il est difficile de se faire une idée exacte sur la nature du lien entre la synthèse des protéines et celle de
l’ARN, Néanmoins, on peut noter quelques concepts plus ou moins confirmés par la majorité des résultats expérimentaux exposés ci-dessus :
a - La relation entre la synthèse des protéines et celle de l’ARN n’est pas simple, il existe à l’état actuel de nos connaissances des données pour et contre la synthèse conco mitante de deux macromolécules,
b - On connaît de nombreux Cà,s où la synthèse des protéines est inhibée, tandis que la synthèse de l'ARN continue, mais le phénomène contraire se rencontre rarement,
c - Les résultats obtenus par l’action des analogues sur les enzymes adaptatifs et constitutifs et sur les protéines cellulaires en général montrent que l’ARN n’intervient pas dans la synthèse de toutes les protéines d’une façon iden tique .
d - Les conclusions obtenues en étudiant l’effet de RNAase sur la synthèse protéinique, ainsi que les résultats des expé riences sur les cellules brisées et les protoplastes, prou vent que ”dans la cellule vivante, l’intégrité de l’ARN est indispensable au maintien des synthèses protéiniques” - BRACHET (70) .
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F. ACTIVATION DES AMINOACIDES ET LE ROLE DE L»ARN^ O
En général, le processus de la synthèse en système
vivant fait appel à l'intervention de deux sortes de groupements : a) les groupements activés ;
b) les groupements de transfert.
Etant donné le caractère endergonique des synthèses dans l'organisme, l'activation est l'étape initiale de toutes les biosynthèses. Comme il en a été question plus haut, la réalisation des liaisons peptidiques n’échappe guère à cette règle. Il y a presque vingt ans que LIPMANN (71) pensait à une intervention de l'ATP comme apport énergétique dans ce processus. Il croyait que l’ATP donnait ADP et que le groupe ment phosphate terminal de l’ATP serait attaché au carboxyle d'aminoacide à l'aide d'une liaison phosphoanhydride et, en vertu de ce couplage, les carboxyles des aminoacides devien draient actifs. Ce mode d'activation est resté longtemps l'unique moyen d'activer les groupements, mais les progrès réalisés par la biochimie durant ces dernières années nous ont montré qu'il existe une autre modalité d'activation dans laquelle
les produits de clivage de l’ATP sont AMP et PP.
35
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t » t Nuclé-O-P-O-P-P-i^ t ■’T Nuclé-O-P û X t P-0 (I) I » O-P-P-0 (II) Nuclé-O-P-O-P-lP t ILes chercheurs se sont aperqu que c'était d'après le Processus I que se réalisait 1'"activation des aminoacides. Les travaux des chercheurs, surtout pendant les cinq dernières années, ont éclairci le mécanisme enzymatique de cette activa tion. Les investigateurs sont parvenus à séparer les enzymes responsables de l'activation des aminoacides. Les pionniers des recherches sur l'incorporation des AA et sur leurs activa tions sont :
HOAQUND, ZAMECNIK, STEPHENSON, KELLER, ALLEN, HECHT, BERG, NOVELLI^ etc. ... Il n'est pas possible de citer ici tous les travaux parus concernant l'activation des aminoacides ainsi que d'autres étapes après l'activation jusqu'à l'incorporation dans les protéines. Nous verrons dans les pages suivantes que l'aminoacide ,^^près être activé par ATP forme une liaison avec un ARN particulier qu'on appelle ARN soluble (ARN^). Nous étudierons en détail les groupements de l'ARN responsables des
O
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I, Gomment décèle-t-on les carboxyles activés ?
Au point de vue analytique, on dispose de deux moyens de déceler les groupements carboxyles activés :
a) la formation d^hydroxamate : on profite de 1*affinité de l^hydroxylamine avec les aminoacides quand ces derniers sont activés à l’aide de l’ATP, d’après la réaction suivante
0 0
n n
R-CH-NH2-C- + NH2OH ---> R-CH-NH2-C-NHOH 0
b) Echange de pyrophosphate minéral (PP) d’après la réaction :
" E
R-CH-NH^-C- + AP/-CO-CH-NH0R + ^^p^^p 0
A cause de la réversibilité de la deuxième réaction, on assiste à un échange entre le PP et l’ATP.
Le dosage de l’hydroxamate formé et la détermination du pourcentage d’échange de (mesure de radio-activité) servent non seulement à déceler les groupements activés, mais aussi à mesurer l’activité des enzymes qui interviennent dans 1’activation.
Il est à noter que les résultats obtenus par ces deux méthodes ne sont pas identiques et qu’il y a des aminoacides qui répondent positivement à une réaction et pas à l’autre, NOVELLI (73). On peut partager à ce point de vue les amino acides en trois catégories :
a) ceux qui forment uniquement de 1*AA-hydroxamate ; b) ceux qui ne favorisent que l’échange de PP ;
37
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Il, Les enzymes d*activation.
Ce sont surtout les travaux sur l*homogénat et les préparations in vitro qui ont conduit les chercheurs à trouver ces enzymes.
HOAGLAND, KELLER, ZAMECNIK (74) ont mis en évidence la présence de ces enzymes dans lé foie des mammifères. Les enzymes en question catalysent la réaction suivante :
S
AA + ATP ".. AA-AMP + PP ( 1 )
AA-AMP, aminoacide-adénylate ne réagit qu*avec les solutions concentrées de 1'hydroxylamine, fait qui a conduit les auteurs
(74) à admettre que 1’AA-AMP serait masqué par 1*enzyme et que la réaction (1) serait plutôt ;
AA + ATP + E --- E-AA-AMP + PP (2)
La formation d*AA-AMP a été montrée par différentes méthodes, HOAGLAND, ZAMECNIK, SHARON, LIPMANN, STULBERG et BOYER (75) l’ont démontrée dîune façon très nette en utilisant le trypto- phane marqué par 0, lors de la formation du tryptophane hydroxamate par l’ATP et l’enzyme qui active cet aminoacide. Ces expériences ainsi que les études ultérieures de BOYER et STULBERG (76) sur la réaction ;
0
E "
ATP + R-COOH + NHgOH —AMP + PP + R-C-NH-OH
nous ont fourni des preuves directes de la présence de l’AA-AMP 1 â
Si dans cette réaction l’AA est marqué à 1’ 0, l’analyse des produits de réactions montre que l’AMP contient une grande
Les auteurs concluent donc que la seule interprétation possible serait l’existence d’un composé ayant les liaisons :
1 d
-G- 0-P- entre le phosphate de l’ATP et l’hydroxyle de l'AA.
Récemment WONG et MOLDAVE (77) ont montré qu’un composé tel -que E-AA-AMP est l’intermédiaire véritable dans l’activation des aminoacides et leur incorporation dans les protéines.
Un autre groupe de chercheurs, KARASEK et col. (7^), ont préparé par synthèse directe try-AMP ; ils ajoutent ce composé à un
système qui contient l’enzyme activant le tryptophane, ATP, Mg"'"'' et tryp- ^C. Après incubation, on sépare par ionophorèse à
pH 4,5 le try-AMP qu’on avait ajouté comme entraîneur. L’expé rience montre qu’une grande partie de la radio-activité migre avec le try-AMP, c’est-à-dire qu’on a la formation du try-AMP dans ces conditions. Les enzymes activant les aminoacides ont été trouvés d’abord dans les homogénats des organes des animaux. Dans la suite, on a pu montrer que ces enzymes existent chez les microorganismes et les plantes. Un des premiers enzymes qu’on a
obtenu à l’état relativement pvir est celui qui est responsable de l’activation du tryptophane ; c’est celui que LIPMANN, KONINGSBERGER et DAVIER (79) ont trouvé dans le pancréas du boeuf. L’enzyme activant la tyrosine a été également obtenu à partir de différentes sources - KONINGSBERGER et col. (SG). Plus tard, on a montré que l’extrait de pancréas du pigeon contient les enzymes qui activent tous les aminoacides.
BERG (Si) a mis en évidence la présence des enzymes activant les aminoacides dans ”la levure”.
MAGER et LIPMANN (Ô2) ont trouvé que ces enzymes
existent aussi chez ”Tetrahymena”. De nombreux travaux montrent la présence de ces enzymes chez les bactéries - DE MOSS et
39
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CLARK, JR. (Ô5). Il est à noter que les enzymes dont il vient d’être question plus haut activent presque toujours les formes L des aminoacides.
Le fait qu'on ne trouve pas toujours dans les préparations les enzymes qui activent tous les aminoacides ne doit pas faire croire que ces organismes ne contiennent que des enzymes dont l’activité est décelable dans les préparations. En effet :
1. -11 est probable, comme l’a fait remarquer NOVELLI (73), que les enzymes responsables de l’activation de certains aminoacides, étant plus fragiles que les autres, ont été détruits au cours des préparations.
2. - Quand on mesure l’activité enzymatique par l’échange du PP radio-actif avec l’ATP, il est possible que l’enzyme est déjà saturé avec l'aminoacide qui l’active et que l’addition de l’aminoacide exogène ne stimule plus l’échange.
3. - En outre, l’activation ne se fait pas d’après le mode I d’activation, c’est-à-dire que le PP n’est plus un produit de clivage de l’ATP dans l’activation.
CORMIER et NOVELLI (86) ont trouvé un enzyme chez ”Photobacterium fischeri” qui active la glycine d’après la réaction suivante :
E + glycine + ATP ^ E - glycyl phosphate + ADP
On peut Bietsurer l'activité de cet enzyme par la réaction de la glycine activée avec 1’hydroxylamine.
III. Enzymes pH 3 et ARN soluble (ARN^)
40
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En étudiant l’activation enzymatique des aminoacides, LIPMANN et MAGER (Ô2) ont montré que l’activation est plus
fortement renversée par un mélange de (PP + AI®P) que par le PP. Nous avons déjà dit que pour former 1’hydroxamate, dans ces conditions, il faut des solutions concentrées d’hydroxylamine, ce qui prouve encore que l’aminoacide activé par les enzymes est masqué d’une façon ou l’autre. Ces résultats, et surtout l’effet de la RNAase s\ir l’incorporation des aminoacides dans les homogénats, ainsi que d’autres conclusions, ont conduit les chercheurs à démontrer que l’aminoacide, après être activé sous la forme d’AA-AMP, est transféré sur un ARN spécifique dont nous étudierons les propriétés.
Cet ARN qui accepte les aminoacides s’appelle ARN soluble (ARNg), ARN actif ou bien ARN de transfert. Nous le présente rons désormais comme ARN .
s
Nous pouvons donc écrire la réaction d’activation des amino acides comme suit :
E + ATP + AA --- ^ E - AA - AMP + PP E - AA - AMP + ARN_ --- ^ AA - ARN_ + E + AMP
s --- s
E + ATP + AA + ARN. --- ^ AA - ARN. + E + AMP + PP s --- s
Les différents chercheurs, et en particulier les
Américains, en travaillant sur l’incorporation des aminoacides IL,
- ^C dans les protéines des homogénats, ont observé que tous les enzymes qui activent les aminoacides restent dans le surna geant quand on sépare les microsomes à un pH voisin de 7 par centrifugation à 106,000 g pendant 90 minutes.
Après l’enlèvement des microsomes, si on abaisse le pH vers 5, on obtient un précipité qui contient pratiquement tous les enzymes activateurs ainsi que tout l’ARN. qui était dans le
41
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siirnageant. Ce précipité est dit "précipité d*enzymes-5" et nous le représenterons par "Enzymes-5" (en discutant du fraction nement cellulaire, nous parlerons en détail de ces opérations). L’ ”Enzymes-5” contient principalement deux fractions : une fraction protéinique, qui comprend les enzymes activateurs des aminoacides et une fraction ribonucléique : l’ARN_.
On peut séparer ces deux fractions de différentes façons ; si on traite 1’ "Enzymes-5" par la RNAase, on obtient uniquement la fraction protéinique. Le traitement par les enzymes protéo lytiques (trypsine) laisse intacte la fraction nucléique.
Enfin, avec'le phénol, on obtient les deux fractions séparément. Il existe de nombreux travaux consacrés à l’étude de ces deux fractions séparées sur l’activation des aminoacides. Les résul tats sont toutefois contradictoires.
NOHARA et OGATA (Ô?) ont préparé 1’ ’’Ehzymes-5" d’après la méthode de HtiAGLAND et ses collaborateurs, à partir du foie de lapin et ont étudié 1’action des différents agents sur la formation des AA-hydroxamate ces enzymes. Ils trouvent que :
1) Les agents tels que p-chloromercuribenzoate, monoiodacetate et azide n’inhibent pas la formation de 1’AA-hydroxamate par ’’Enzymes-5".
2) "Enzymes-5" prétraité à la RNAase est moins actif que le
témoin Jion traité à la RNAase pour la formation de l’AA-hydro- xamates, Ge« auteurs constatent d'après ces résultats que les groupements SH n'interviennent pas dans l’activation des amino acides, tandis que l’ARN joue un rôle principal.
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Mais dans un travail antérieur, HOLLEY et PROCK (89) avaient trouvé que 1*enlèvement de l’ARN^ inhibe fortement l’activité enzymatique de 1’ ”Enzymes-5” (activation de l'ala nine mesurée par échange de PP avec l'ATP) et qu’en combinant *: les deux fractions, on obtient complètement l’activité enzymati que .
A l’heure actuelle, il ne fait pas de doute que l’ARN^ n’intervient pas dans l’étape initiale de la synthèse des
protéines (activation de groupe carboxyle) ; c’est le stade suivant qui fait appel à l’ARN^ comme facteur de transfert. Nous examinerons les données bibliographiques sur la liaison de I’ARNk avec les aminoacides, mais avant cela, nous croyons utile de représenter le chemin parcouru par un aminoacide pour être incorporé par une liaison peptidique dans les protéines.
ZAMECNIK, STEPHENSON et HECHT (90) résument en quatre étapes les réactions qui conduisent un AA à l’état libre dans une protéine :
I - Activation :
AA + ATP + E. --- ^ AAAMP - E^ + PP 1 •"c--- I
II, Liaison avec 1’ARN, AA^AMP - E^ + ARNg
E,
III. Formation des peptides ;
AA - ARN + E- + AMP ® ' - Détermi-^\nation de AA - ARNg + P.RNP GTP Peptides - P. RNP séquence.
IV. Apparition des protéines complètes :
Peptides - P.RNP + les lipoprotéines de membrane reticulo E
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.
Dans le schéma ci-dessus, l’existence des deux premières réactions est appuyée par les résultats expérimentaux et on a séparé les enzymes responsables, mais on connaît peu de choses sur les deux dernières étapes, surtout sur le mécanisme qui imposerait la séquence définie de chaque protéine.
On € montré que pour activer chaque aminoacide, il existe un enzyme spécifique - BERG et OFENGAND (91). En outre, ces chercheurs ont constaté que l’activation d’un aminoacide et son transfert sur l’ARN accepteur sont catalysés par un seul enzyme. En purifiant l’enzyme qui active la méthionine 200 fois, on voit que l’activité de cet enzyme pour incorporer la méthio nine activée dans l’ARN^ est aussi augmentée de 200 fois.
Cela prouve que dans le chemin de l’incorporation d’un amino acide dans les protéines, que nous avons représentées plus haut, les enzymes E^ ^2 mêmes.
On remarque que l’activation et ensuite le transfert des aminoacides sur l’ARN rappelle l’activation et le transfert de l’acétate sur CoA ; dans ces deux cas, les enzymes d’activa tion catalys^;n.t également le transfert des groupements activés sur les groupements de transfert.
Nous avons déjà rappelé que la majorité des résultats expérimentaux sur l’incorporation des aminoacides dans les protéines et le rôle de 1’ ”Enzymes-5” sont obtenus lors de
44 •
HOAGLAND, ZAMECNIK et STEPHENSON (92) ont étudié ce système pour déterminer les intermédiaires de cette incorpora tion, Quand on prépare 1’ "Enzymes-5” de l'homogénat du foie, on constate que 1' "Enzymes-5" devient fortement radio-actif en présence de L^^Leucine-et ATP. Ces auteurs ainsi que OGATA et NOHARA (93) ont démontré que c’est la fraction ribonucléique d^ "Enzymes-5" qui est toujours fortement chargée par
l'amino-1/l
acide- ^C. Si on incube 1’ "Enzymes-5" dont l’ARN est chargé
1/l ^
d*aminoacide- avec les microsomes en présence de GTP> on remarque que 1 'aminoacide- '^C passe dans les protéines des microsomes et disparaît dans l'ARN^. En administrant l’AA-**^C
in vivo au rat et en séparant 1’ "Enzymes-5" et les microsomes du foie de l’animal sacrifié, peu de temps après l’injection de 1’aminoacide, on trouve que 1 ”’Enzyraes-5" devient plus rapide ment radio-actif que les protéines microsomiales. Si on extrait de cette préparation le ’’^^C-AA-ARN^", l’incubation de ce dernier avec les microsomes non marqués en présence de GTP provoque un transfert d’AA-^^C dans les microsomes.
Dans un autre travail, HOAGLAND, STEPHENSON, SCOTT, HECHT et ZAMECNIK (94) démontrent que l'incorporation de
1/l
