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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

De Rache, A. (2012). Caractérisation électrochimique et spectroscopique de sondes aptamères quadruplexes impliquées dans la détection de la thrombine (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des Sciences – Chimie, Bruxelles.

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D 03932 ^ té Libre de Bruxelles

Faculté des Sciences

Service de Chimie Analytique et Chimie des Interfaces

Caractérisation électrochimique et spectroscopique de sondes aptamères quadruplexes impliquées

dans la détection de la thrombine

Thèse de doctorat présentée par

Aurore De Rache

En vue de l'obtention du grade académique de Docteur en Sciences

Novembre 2012 Univers!te Li are de

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Promoteur : Prof. C. Buess-Herman

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Université Libre de Bruxelles

Faculté des Sciences

Service de Chimie Analytique et Chimie des Interfaces

Caractérisation électrochimique et spectroscopique de sondes aptamères quadruplexes impliquées

dans la détection de la thrombine

Thèse de doctorat présentée par

Aurore De Rache

En vue de l'obtention du grade académique de Docteur en Sciences

Promoteur : Prof. C. Buess-Herman Novembre 2012

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A Papy, pour les études que tu n'as pas pu faire.

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Remerciements

Tout d'abord, je tiens à remercier chaleureusement Madame le Professeur Claudine Buess-Herman pour m'avoir accueillie au sein du laboratoire de Chimie Analytique et Chimie des Interfaces pour y réaliser mes travaux. Son ouverture d'esprit et l'immense liberté scientifique qu'elle m'a accordée ont grandement contribué à ce que je mène à bien cette thèse de doctorat.

J'exprime aussi ma reconnaissance aux Professeurs Michaela Vorhckovâ et Emil Palecek pour leur accueil toujours chaleureux lors de mes séjours à l'Insitut de Biophysique de Brnô ainsi qu'au Dr. Wolfgang Fritzsche pour m'avoir conviée à travailler quelques jours à l'Institut für Photonische Technologien de Jena.

Je souhaite également remercier vivement le Professeur François Reniers pour son soutien et pour l'expérience inoubliable que constitue l'enseignement des séminaires et laboratoires associés au cours de Chimie Générale.

Mes remerciements sincères vont aussi au Dr. Iva Kejnovska, qui a souvent travaillé tard lors de mes visites et qui m'a beaucoup appris, et au Dr. Veronika Ostatna avec qui j'ai eu beaucoup de plaisir à travailler à Bruxelles et à Brnô. De même, je remercie Jacqueline Jatschka pour sa collaboration à Jena.

Pour le soutien financier à ma participation à des congrès, je souhaite ardemment remercier le FNRS et les Fonds De Brouckere-Solvay et Agathon De Potter, et également le WBI pour le financement de mes séjours à Brnô et le COST MP0802 pour celui de mon séjour à Jena.

Qu'ils aient été là avant moi, de passage ou qu'ils soient là aujourd'hui, je remercie du fond du cœur tous les collègues que j'ai côtoyé au CHANI : Alexis, Alp, Andrea, Antoine, Anne, Belgin, Bernard, Caro, Caroline G., Cathy, Corinne, Delphine, Denis, Diane, Eléonore, Emile, Eric, François D., François V., Fred D., Fred H., Gaétan, Greg, Hanae, Khalid, Issa, Jennifer, Julie, Karim, Lara, Léo, Madalina, Marc, Mehdi, Moussa, Nabila, Nico C., Nico VDC,

Perrine, Pierre, Rodrigue, Sami, Sammy, Stéphanie C., Stéphanie V., Thierry et Zdenka.

Merci aussi à Julie et Sandhya, nos secrétaires, pour leur aide administrative. Je remercie aussi particulièrement Eric et Philippe pour leur soutien logistique et technique.

A tous les membres des autres laboratoires qui ont pris des nouvelles du déroulement de ma thèse et/ou qui m'ont encouragée, un tout grand merci et une dédicace particulière à Laurence, Thomas, Jonathan, Alice, Benoît, J-F, Matthieu et Fabien.

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Enseigner en Chimie Générale n'aurait pas eu toute sa saveur sans Yannick et Thierry - les collègues devenus chefs - sans Pauline - l'ange gardien discret -, sans Nico et Delphine - ces anciens auprès de qui j'ai beaucoup appris -, sans Jennifer - de passage -, ni bien sûr sans Epiphanie, Clément, Angélique et Nicolas - avec qui j'ai partagé la majorité du chemin.

Je n'en oublie pas pour autant Jean-Christophe alias l'organisation incarnée, Michel Carleer et Michel Godefroid qui ont aidé l'équipe pendant longtemps. Le coup de main des chargés d'exercices, Michel Van krieken, Bernard, Damia, Frédéric et Nora, et des élèves assistants, Allison, Camille, Deniz, Pauline, Sébastien et Thomas, a toujours été providentiel. Malgré la nostalgie de penser aux « anciens », je suis contente de pouvoir remercier aussi l'équipe actuelle : Caro, Céline, Laureline, Gaétan et Yannick, pour les coups de main en fin de rédaction et pour la qualité de la relève I Bien entendu, ma gratitude va également à Lidija, Françoise, Anne et Tanguy.

Comme l'enseignement, c'est aussi et surtout les étudiants, je voudrais remercier tous les étudiants qui à un moment où l'autre ont attisé mon envie de les aider à comprendre des concepts pas toujours faciles. Vous accompagner de semaine en semaine m'a parfois aidée à garder le cap.

En dehors du contexte purement universitaire, il y a aussi ceux qui sont toujours là. A Maman, Papy, Mamy et Cécile, un tout grand merci pour votre fierté sans borne, elle m'a aidée à faire toujours un pas de plus dans les jours difficiles. Valérie et Audrey, je ne vous remercierai jamais assez pour vos encouragements. Christian et Christiane, merci pour ces mots et ces regards qui font réaliser la valeur du travail accompli. Betty, tes gentilles tapes sur les épaules fatiguées donneraient du courage à n'importe qui. Et Sandrine, une amitié comme la tienne n'a pas son pareil pour aider à naviguer entre les obstacles de toute nature.

Enfin, Thomas, ton soutien scientifique et personnel a fait toute la différence I

Aurore.

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Résumé

Les biosenseurs basés sur des aptamères quadruplexes comme celui de la thrombine (TBA) recourent souvent à l'élongation de l'aptamère. La flexibilité accrue de l'aptamère- sonde facilite la reconnaissance de la cible et améliore donc sa détection. Or le reploiement des structures quadruplexes est influencé notamment par l'ajout de nucléotides à leur extrémité. Du fait de l'importance de la structure de la sonde pour la reconnaissance, nous avons dans un premier temps comparé le type de reploiement adopté par 2 séquences allongées, GTAGGT-TBA et TTTTTT-TBA, à celui de TBA et ce en présence de différents cations (Ba^^ Ca^^ Mg^^ Na^ NH4^ Rb^ et Sr^"^). La stabilité thermique de ces structures a aussi été étudiée. Nous avons montré qu'alors que TBA se reploie toujours en un quadruplexe anti-parallèle, les séquences allongées peuvent également adopter une conformation parallèle. Les différences entre les résultats obtenus avec les deux séquences allongées indiquent que, contrairement à ce qui se fait dans la littérature, le choix de ces nucléotides devrait être effectué en fonction de la structure adoptée par la sonde allongée dans les conditions d'interaction envisagées.

La deuxième partie du travail a porté sur l'interaction entre les aptamères et le [Ru(NH3)6]^^ fréquemment utilisé pour quantifier des sondes ADN immobilisées. Nos mesures mettent en évidence un comportement électrochimique inédit pour le [Ru(NH3)e]^^ en interaction avec les aptamères. La notion de [Ru(NH3)6]^^ « confiné » a été introduite pour distinguer cette interaction du cas purement électrostatique bien connu. La stœchiométrie d'interaction entre le [Ru(NH3)6]^^ confiné et la partie quadruplexe des séquences d'aptamère a été évaluée à 2 complexes métalliques par quadruplexe et confirmée, en solution, par dichroïsme circulaire (CD). Ces mesures montrent aussi que ce marqueur redox déstabilise la structure quadruplexe anti-parallèle de TBA et que pour les séquences GTA GGT-TBA et TTTTTT-TBA, il stabilise des structures quadruplexes parallèles.

Dans le cas des séquences allongées, l'interconversion entre les structures parallèles et anti-parallèles a été suivie par CD lors d'une compétition ionique entre les cations [Ru(NH3)e]^" et K".

Sur base des différentes interactions mises en évidence entre le [Ru(NH3)6]^* et les aptamères, diverses pistes de détection de la thrombine ont été explorées. Les conditions d'immobilisation des sondes ont été optimisées sur base des dimensions de la thrombine.

La détection de cette protéine cible a été réalisée avec succès d'une part en exploitant l'interaction purement électrostatique du [Ru(NH3)6]^^ et d'autre part grâce à la formation de [Ru(NH3)6]^'^ confiné.

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Table des matières

CHAPITRE I : INTRODUCTION 1

1 Les biosenseurs électrochimiques 1

2 Présentation du système étudié 7

2.1 La thrombine 7

2.2 Les aptamères 9

2.2.1 Sélection des aptamères 9

2.3 L'aptamère de la thrombine 11

3 Reconnaissance moléculaire via une sonde ADN 13

3.1 La charpente d'un brin d'ADN 13

3.2 Les interactions entre les bases 17

3.3 Les duplexes 19

3.3.1 Duplexes et reconnaissance par hybridation 20

3.4 Les triplexes 22

3.4.1 Triplexes et reconnaissance de duplexes 24

3.5 Les quadruplexes 25

3.5.1 Quadruplexes et reconnaissance de protéines : les aptamères 29 3.5.2 Détection électrochimique de protéines basée sur des aptamères ADN quadruplexes 33

4 But du travail 39

CHAPITRE II : TECHNIQUES ET RÉACTIFS 41

1 Techniques 41

1.1 Electrochimie 41

1.1.1 Généralités 41

1.1.2 Appareillage 43

1.1.3 Voltampérométries 45

1.1.3.1 Voltampérométrie cyclique 45

1.1.3.2 Voltampérométrie impulsionnelle différentielle 47

1.1.3.3 Voltampérométrie alternative 49

1.1.3.4 Voltampérométrie hydrodynamique 50

1.1.4 Chronocoulométrie 51

1.2 5pectroscopie 52

1.2.1 5pectroscopie d'absorption UV 52

1.2.1.1 Généralités 52

1.2.1.2 Appareillage 53

1.2.2 Dichroïsme circulaire 53

1.2.2.1 Principes généraux 53

1.2.2.2 Cas de l'ADN quadruplexe 54

1.2.2.3 Appareillage 55

1.3 Outils bioinformatiques 56

2 Réactifs 57

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CHAPITRE III : RÉSULTATS ET DISCUSSION 59

1 Influence de l'élongation de l'aptamère sur sa structure 59

1.1 Présence de cations potassium 60

1.2 Présence d'autres cations mono- et bivalents 62

1.3 Analyse du caractère quadruplexe et de la stabilité thermique 69

2 Interactions entre l'aptamère et le [RuCNHajg]^^ 81

2.1 Interactions à l'électrode modifiée 82

2.1.1 Immobilisation des sondes 82

2.1.2 Désorption réductive de la monocouche auto-assemblée 83

2.1.3 Interaction électrostatique et recouvrement en aptamère 85

2.1.4 Confinement du [Ru(NH3)6]^"^ 96

2.1.4.1 Formation d'une espèce confinée 96

2.1.4.2 Détermination de la concentration superficielle en l'espèce confinée 100 2.1.4.3 Détermination de la constante cinétique de transfert d'électron 102

2.1.4.4 Influence de l'élongation de la séquence 104

2.1.4.5 Origine de l'interaction 107

2.2 Interactions en solution 115

2.2.1 Etude électrochimique 115

2.2.1.1 Titrage du [Ru(NH3)6]^* par l'ADN 116

2.2.1.2 Titrage de l'ADN par le [Ru(NH3)6]^^ 133

2.2.1.3 Discussion et comparaison avec l'interaction à l'électrode modifiée 138

2.2.2 Caractérisation spectroscopique de l'interaction 139

2.3 Influence de la compétition ionique sur l'interaction 145

3 Détection électrochimique de la thrombine via le [Ru(NH³)⁶]^* 149

3.1 Choix des conditions d'interaction 149

3.2 Choix de la séquence immobilisée 150

3.3 Choix des conditions d'immobilisation et optimisation du recouvrement en aptamère 151

3.4 Détection de la thrombine 155

3.4.1 Détection via l'espèce confinée 155

3.4.1.1 Ajout de thrombine sur l'espèce confinée 155

3.4.1.2 Interaction avec la thrombine avant le confinement 157

3.4.2 Détection en absence d'espèce confinée 158

3.4.2.1 Détection ne tenant pas compte d'un éventuel confinement 161

CHAPITRE IV : CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 163

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 167

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Chapitre I ; Introduction

Chapitre I : Introduction

1 Les biosenseurs électrochitniques

Un biosenseur est un dispositif qui transforme une information biochimique, généralement la concentration d'un analyte, en signal analytique Il intègre un système de reconnaissance qui repose sur un mécanisme biochimique et un transducteur physicochimique La notion d'élément de reconnaissance se veut vaste et peut faire référence aussi bien à des organisations complexes telles que des tissus, des cellules, des organites cellulaires, etc. qu'à des biomolécules comme des enzymes, des anticorps, des acides nucléiques, etc.

La mise en oeuvre du processus biochimique associé au système de reconnaissance génère une information physique ou chimique que le transducteur convertit alors en signal analytique mesurable. Ce transducteur peut être de différents types, notamment électrochimique, optique, piézoélectrique ou thermique. Le rôle du transducteur est exclusivement d'assurer le transfert du signal qui provient de ce système et ce quel que soit le type de transduction.

Les biosenseurs dits électrochimiques s'appuient sur un transducteur électrochimique plus couramment dénommé électrode. Ils ne requièrent aucune étape de transformation du signal mesuré en signal électrique ce qui les rend particulièrement avantageux en termes d'instrumentation. Combinée à cet aspect, leur petite dimension en fait des méthodes de diagnostic portatives et à faible coût. Leur rapidité et sensibilité de mesure contribuent également à expliquer l'intérêt marqué pour les biosenseurs électrochimiques dans des domaines comme le diagnostic médical, la sécurité alimentaire, etc.

1

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Chapitre I Mntroduction

L'élément de reconnaissance a pour rôle de conférer au biosenseur sa sélectivité vis-à- vis de l'analyte d'intérêt. Selon son type, il fonctionnera, par exemple, sur un principe catalytique ou d'affinité.

Dans un biosenseur basé sur un principe catalytique, un catalyseur biochimique - généralement une enzyme, un organite cellulaire, une cellule ou un tissu - est incorporé dans le dispositif de reconnaissance. Il catalyse de manière hautement sélective la transformation d'un ou plusieurs substrats en un ou plusieurs produits. La méthode de détection repose habituellement sur la mesure, directe ou indirecte, de la concentration de l'un ou l'autre des substrats ou produits.

Un biosenseur d'affinité repose sur la reconnaissance moléculaire cible-sonde, laquelle dépend à la fois de la structure de la sonde et de celle de la cible. La détection de l'analyte cible découle de son interaction avec une sonde immobilisée. L'interaction spécifique entre l'analyte cible et le matériel biologique produit un changement physicochimique détecté par le transducteur, lequel fournit alors un signal proportionnel à la quantité (concentration) de l'analyte.

L'étude fondamentale réalisée dans ce travail s'inscrit dans le cadre des biosenseurs électrochimiques d'affinité. Pour ceux-ci, plusieurs stratégies courantes pour obtenir un signal proportionnel à la concentration de la cible peuvent être distinguées :

Les méthodes qui recourent au marquage de la cible par une espèce électroactive.

Dans celles-ci, une chimie de marquage est réalisée sur l'échantillon à analyser en vue de fixer un marqueur redox sur la cible. L'interaction entre la cible et sa sonde peut alors être mise en évidence, comme l'illustre la Figure 1-1, par le transfert d'électron entre le marqueur redox accroché à la cible et l'électrode.

électrode

Figure 1-1

Principe d'un biosenseur électrochimique où la cible est marquée par une espèce électroactive.

2

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Chapitre I : Introduction

Les méthodes qui nécessitent le marquage de la sonde, généralement par un groupement redox. La détection de la cible grâce à des sondes marquées repose habituellement sur un changement d'organisation de l'interface induit par l'interaction sonde-cible. Celui-ci favorise ou inhibe le transfert électronique entre le marqueur et l'électrode. Une variation du signal électrochimique par rapport à celui détecté avant l'interaction est alors mesurée. Ce principe est schématisé à la Figure 1-2 pour le cas d'un transfert d'électron favorisé par l'interaction, dit

« signal-ON ».

Figure 1-2

Principe d'un biosenseur électrochimique à sonde marquée pour lequel le transfert électronique est favorisé après reconnaissance.

Les biosenseurs « signal-ON » permettent d'observer une augmentation du signal mesuré. Toutefois, de nombreuses stratégies reposent plutôt sur l'inhibition du transfert d'électron après reconnaissance, tel que représenté à la Figure 1-3. Le dispositif est alors qualifié de « signal-OFF » du fait de la baisse du signal mesuré.

marqueur redox

+ cible

--- ►

marqueur redox

sonde

cible e-

électrode

Figure 1-3

Principe d'un biosenseur électrochimique à sonde marquée pour lequei le transfert électronique est inhibé après reconnaissance.

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Chapitre I lintroduction

Les méthodes qui utilisent une couche électroactive située sous la sonde. Dans ces stratégies, une altération de la perméabilité de l'interface vis-à-vis des ions est exploitée. La Figure 1-4 présente le principe de ces méthodes. En absence de la cible, l'arrangement des sondes limite l'approche des ions depuis le cœur de phase. La difficulté à compenser les charges inhibe le transfert électronique entre la couche redox et l'électrode. Lorsque la cible est présente, l'accessibilité aux ions augmente et les processus redox impliquant la couche électroactive sont favorisés ce qui conduit à une augmentation du signal mesuré.

ions

+ cible sonde

sonde

couche redox

cible

^ ions

î

électrode J électrode

I e-

Figure 1-4

Principe d'un biosenseur électrochimique utilisant une modification de comportement d'une couche redox située sous la sonde.

Les méthodes basées sur la différence de réponse électrochimique d'un marqueur redox présent en solution enregistrée avant et après la reconnaissance cible-sonde.

Ces stratégies tirent avantage de l'influence de la reconnaissance cible-sonde, soit sur l'accessibilité du marqueur à l'électrode soit sur l'interaction du marqueur avec les espèces présentes à l'interface {sonde ou complexe cible-sonde). La Figure 1-5 illustre le principe de ces méthodes.

marqueur

électrode

marqueur redox

cible

sonde

électrode

Figure 1-5

Principe d'un biosenseur électrochimique basé sur la réponse d'un marqueur redox en solution.

4

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Les méthodes exemptes de tout type de marqueur qui exploitent généralement soit l'électroactivité intrinsèque des cibles, soit une modification des propriétés interfaciales (typiquement de la capacité de la double couche induite par l'interaction de la cible avec la sonde immobilisée.

Le présent travail s'inscrit dans le cadre de la détection électrochimique d'une protéine cible, la thrombine, grâce à son affinité pour une sonde aptamère d'ADN. La stratégie recourant à un marqueur redox présent en solution sera privilégiée. Le système étudié est décrit à la section suivante.

5

(18)

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2 Présentation du système étudié

2.1 La thrombine

L'hémorragie et la thrombose sont les issues cliniques ultimes de dysfonctionnements dans l'hémostase, à savoir dans l'ensemble des phénomènes physiologiques qui permettent d'interrompre un saignement. Sérine protéase de la famille des chymotrypsines, la thrombine constitue une protéine essentielle au processus de coagulation sanguine chez les vertébrés et est donc impliquée dans ces dysfonctionnements

La thrombine possède deux rôles importants et opposés. Son premier rôle, pro

coagulant, induit la conversion du fibrinogène en caillots de fibrine insolubles et s'accompagne d'un rétrocontrôle positif qui favorise la production de thrombine à partir de son précurseur, la prothrombine. Son second rôle, anticoagulant, implique la protéine C et déclenche une cascade réactionnelle limitant la conversion de la prothrombine en thrombine. En plus de ces rôles primaires dans la coagulation, la thrombine possède une variété d'effets importants dans de nombreuses signalétiques cellulaires en se liant à ses récepteurs. La thrombine exploite l'allostérie induite par la liaison des cations Na^ pour accomplir ses différentes fonctions. Cette allostérie régule l'ensemble de ses interactions.

La Figure 1-6 représente la structure de la thrombine. Les dimensions approximatives de cette glycoprotéine de forme ellipsoïdale sont de 45x45x50Â^®' Deux chaînes polypeptidiques reliées par un pont disulfure composent cette macromolécule de 37,4 kDa Selon les sources, son pH isoélectrique est rapporté entre 7,0 et 7,6 ou plutôt vers 9

Figure 1-6

Structure de la thrombine en absence de Na* (2AFQ)

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La chaîne principale porte les épitopes fonctionnels de l'enzyme et assure le reploiement de la triade catalytique - histidine, aspartate, sérine - des sérines protéases (Figure 1-7).

Figure 1-7

Triade catalytique associée à l'activité protéase de la thrombine.

Cette triade catalytique est située entre les sites de fixation du fibrinogène et de l'héparine dont les localisations au sein de la thrombine sont représentées à la Figure 1-8.

site de fixation du fibrinogène

site de fixation de l'héparine

Figure 1-8

Localisation des sites de fixation du fibrinogène et de l'héparine au sein de la thrombine.

8

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2.2 Les aptamèfes

Les aptamères sont des séquences d'ARN ou d'ADN, généralement simple brin, capables de se lier à des molécules cibles avec une affinité élevée. Leur sélection, réalisée in vitro selon un principe combinatoire, repose sur cette affinité importante envers la cible et sera décrite à la section suivante.

Des aptamères ont été identifiés pour une large variété de cibles, naturelles ou synthétiques, s'étendant des petites molécules organiques, jusqu'aux larges biomolécules comme les protéines en passant entre autres par les acides aminés et les peptides

En ce qui concerne la sélectivité et l'efficacité de la reconnaissance de leur cible, les aptamères sont souvent considérés comme l'équivalent des anti-corps sous la forme d'acides nucléiques. Pour certaines applications, comme les biosenseurs, les aptamères peuvent même constituer une alternative attractive aux anti-corps. En effet, leur sélection réalisée in vitro garantit leur stabilité dans les conditions de l'application envisagée, et ouvre la possibilité de les synthétiser automatiquement et à haut rendement, rendant leur production plus économique et moins contraignante que celle, in vivo, des anti-corps. Dans le cas de cibles protéiques, les aptamères peuvent être sélectionnés pour reconnaître spécifiquement le domaine fonctionnel et discriminer les protéines mutantes des sauvages.

2.2.1 Sélection des aptamères

La procédure de sélection des aptamères la plus courante est basée sur un procédé itératif schématisé à la Figure 1-9. Elle porte le nom de SELEX pour « Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment » et comporte plusieurs étapes détaillées ci-après pour la sélection d'aptamères ADN : la préparation de la bibliothèque de séquences, la sélection, l'amplification, l'isolement et l'identification. Les étapes de sélection et d'amplification sont réitérées en boucle jusqu'à ce que plus aucune amélioration ne soit observée en termes d'affinité du groupe de séquences pour la cible.

La préparation de la bibliothèque

Des procédures chimiques automatisées génèrent une bibliothèque aléatoire de séquences d'ADN qui peut comprendre jusqu'à 10^^ séquences, ce qui engendre une importante diversité de conformations

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(22)

Chapitre I introduction

bibliothèque d'oilgonucléob'des

1. préparation

début d'un nouveau cycle

système de séparation

M ,

3. amplification

oligonucléotides de faible affinité

V

-s 2. sélection

r»

oligonucléotides d'affinité élevée

Figure 1-9

Représentation schématique de la méthode SELEX.

La sélection

Cette étape vise à séparer les molécules présentant une affinité adéquate pour la cible d'intérêt. Les séquences d'ADN issues de l'étape précédente (l'étape 1 au premier cycle ou l'étape 3 aux itérations suivantes) sont incubées en présence de la cible. Les molécules de faible affinité pour la cible restent majoritairement libres en solution tandis que celles qui possèdent une affinité élevée se lient à la cible. Les séquences non-liées sont écartées, souvent par chromatographie d'affinité. Les molécules liées à la cible, dont les aptamères, sont ensuite détachées de la cible par une modification des conditions de la solution. Seules ces dernières molécules sont utilisées pour les étapes ultérieures.

L'amplification

Les séquences sélectionnées et purifiées sont amplifiées enzymatiquement pour générer une nouvelle bibliothèque de molécules, substantiellement enrichie en séquences possédant une affinité importante pour la cible. La nouvelle bibliothèque est alors utilisée pour initier l'étape de sélection suivante (étape 2).

L'isolement et l'identification

Le procédé itératif est arrêté lorsque plus aucun enrichissement n'est observé. Les molécules d'aptamères individuelles sont alors isolées. Leur séquence nucléotidique est identifiée et leurs propriétés étudiées. En particulier, l'affinité, la spécificité et l'inhibition de la cible sont mesurées par des techniques biophysiques et biochimiques.

10

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Une méthode alternative de sélection d'aptamères a été proposée en 2006 Elle ne requiert pas d'étape d'amplification mais implique, à la place, une succession d'étapes de séparation efficaces basées sur le procédé NECEEM pour « non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures ». Elle permet d'évaluer, en solution, à chaque étape de séparation, l'affinité des séquences de la bibliothèque pour la cible. Seuls les oligonucléotides présentant une affinité importante sont séquencés.

2.3 L’aptamère de la thrombine

L'aptamère sélectionné en 1992 pour son affinité pour cette protéine a été le premier aptamère sous forme d'ADN simple brin La bibliothèque sur laquelle le processus de sélection a été appliqué comportait ~10^^ oligonucléotides de 60 bases de long. Après 50 cycles de sélection, le séquençage des clones isolés a mis en évidence la présence d'une région très conservée de 14 à 17 bases : GGN TGG N2-5 GGN TGG (où N représente un nucléotide non-conservé) et une séquence consensus de 15 bases : GGtTGG NgGGtTGG.

L'interaction des différents clones avec la thrombine entraîne l'inhibition de la conversion du fibrinogène en caillots de fibrine. Toutefois, la séquence 15-mer GGTTGG TGTGGTTGG seule induit une inhibition encore plus forte de cette activité de la thrombine. Dès lors, la qualification « aptamère de la thrombine » (TBA pour « Thrombin Binding Aptamer » en anglais) est généralement associée à cette séquence en particulier, qui fait d'ailleurs l'objet de notre étude.

Il est intéressant de noter que d'autres aptamères de la thrombine ont été générés par la suite, notamment un 29-mer qui interagit avec le site de fixation de l'héparine ou encore un analogue de TBA contenant un résidu LNA (Locked Nucleic Acid)

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3 Reconnaissance moléculake via une sonde ADN

Notre travail se focalise sur le cas des biosenseurs qui utilisent des sondes d'acide désoxyribonucléique (ADN). Le développement de ces biosenseurs fait l'objet d'une recherche abondante

Différents types de structures peuvent être adoptés par l'ADN. Leur description, leur intérêt en termes de reconnaissance moléculaire et leur exploitation dans des biosenseurs électrochimiques d'affinité font l'objet de cette section.

Pour faciliter la description des structures tridimensionnelles de l'ADN, la composition d'un brin et les interactions possibles entre ses bases seront préalablement détaillées.

3.1 La charpente d’un brin d’ADN

Le squelette d'un brin d'ADN est constitué d'une succession de y0-D-2-désoxyriboses reliés entre eux par des liaisons phosphodiester entre le carbone 3' du premier et le carbone 5' du suivant. La Figure 1-10 représente la structure du y5-D-2-désoxyribose ainsi que la numérotation de ses carbones.

HO' H

Figure 1-10

Structure chimique du p-D-2-désoxyribose.

Au sein d'un nucléoside, le carbone 1' du y5-D-2-désoxyribose est substitué par une base azotée. Quatre bases azotées différentes sont présentes dans l'ADN. Il s'agit des purines adénine (A) et guanine (G) et des pyrimidines cytosine (C) et thymine (T). Les structures des quatre nucléosides sont dessinées à la Figure 1-11.

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Chapitre I :lntroduction

Figure 1-11

Structures chimiques de la désoxyadénosine, la désoxyguanosine, désoxycytidine et désoxythymidine.

La séquence d'un brin d'ADN correspond à la succession de ses nucléotides. Chaque nucléotide est composé d'un nucléoside et d'un groupement phosphate. Comme les nucléotides ne diffèrent entre eux que par les bases azotées, la séquence est notée comme une succession de lettres A, C, G et T. Par convention, les séquences sont toujours écrites de l'extrémité 5'-phosphate à l'extrémité 3'-OH. La Figure 1-12 représente une portion d'ADN correspondant à la séquence AGCT ; les liaisons N-glycosidiques entre la base et le désoxyribose sont colorées en bleu tandis que les liaisons phosphodiester sont en rouge.

Les extrémités 5'-phosphate et 3'-OH sont indiquées par des flèches.

extrémité 5'

i

OH

î

extrémité 3'

A

G

C

T

14

Figure 1-12

Représentation d'une portion d'ADN correspondant à la notation AGCT. Les liaisons N-glycosidiques entre la base et le désoxyribose sont colorées en bleu tandis que les liaisons phosphodiester sont en rouge.

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Outre la diversité chimique conférée par la succession des bases, l'ADN peut adopter différentes structures tridimensionnelles, ou conformations. Son important polymorphisme découle des nombreux degrés de libertés présents au sein d'un brin.

La liaison N-glycosidique entre la base et le désoxyribose est caractérisée par un angle dièdre x défini comme 04'-Cl'-N9-C4 pour les purines et 04'-Cl'-Nl-C2 pour les pyrimidines. Parmi les différentes valeurs possibles de cet angle, certaines correspondent à des minima énergétiques. Deux des conformations les plus couramment observées dans les structures d'ADN sont appelées syn (0° < x < 90°) et anti (-60° < % < 180°) et sont représentées à la Figure 1-13 selon la projection de Newman. La Figure 1-14 montre un exemple de chacune des orientations pour une guanosine monophosphate. Les valeurs prises par cet angle influencent le reploiement de l'ADN et la stabilité des structures formées.

0°

Figure 1-13

Projection de Newman des angles dièdres x correspondant aux appellations « syn » et « anti ».

ANTI

X = +43°

SYN

Figure 1-14

Orientation « anti » (à gauche) et « syn » (à droite) de la liaison N-glycosidique d'une désoxyguanosine monophosphate.

L'angle dièdre x est représenté en mauve dans les deux cas.

Les atomes d'H ne sont pas représentés, de même que l'atome d'O Impliqué dans la liaison avec le nucléotide suivant.

15

(28)

Les pentoses, non-planaires, possèdent aussi différentes conformations énergétiquement stables qui influencent la structure générale des brins. Parmi elles, les plus courantes sont dénommées C2'-endo et C3'-endo et représentées à la Figure 1-15.

Cx-endo Cy-endo

Figure 1-15

Configuration C2'-endo et C3'-endo du désoxyribose, ies atomes d'H et le groupement OH lié au C2' ne sont pas représentés

Le squelette sucre-phosphate comporte six atomes entre deux nucléotides. Dès lors, six angles dièdres {a, P, y, ô, s, Q peuvent être définis. Bien que les valeurs de ceux-ci soient interdépendantes et que certains angles (a, p, y, Q n'adoptent que des orientations énergétiquement favorables proches de -60, 60 ou 180°, le squelette sucre-phosphate contribue lui aussi à la grande variété conformationnelle des brins d'ADN.

Si un brin d'ADN peut être décrit par sa séquence et les différents paramètres évoqués ci-dessus, les facteurs qui influencent sa structure sont nombreux. La répulsion entre ses groupements phosphate fait de l'ADN un polyélectrolyte dont le reploiement est influencé par la nature et la concentration des cations présents dans les solutions qui l'entourent. De plus, les interactions non-covalentes entre les bases azotées jouent aussi un rôle prépondérant dans le reploiement des brins. Ceci vaut tant lorsqu'un simple brin se replie sur lui-même que lorsque la structure formée implique plusieurs brins.

16

(29)

3.2 Les interactions entre les bases

L'établissement de liaisons hydrogène constitue le principal mode d'interaction entre les bases azotées et détermine l'arrangement spatial relatif de celles-ci. Bien que d'autres types d'appariement existent nous nous focaliserons ici sur les deux types les plus courants : les interactions « Watson-Crick » et « Hoogsteen ».

Initialement proposées en 1953 par Watson et Crick les interactions canoniques qui portent leurs noms sont illustrées à la Figure 1-16. L'adénine y forme deux liaisons hydrogène avec la thymine tandis que la cytosine en forme trois avec la guanine.

Figure 1-16

Interactions canoniques de Watson et Crick. Le « R » représente le désoxyribose lié à la base.

Outre les interactions de Watson-Crick, les purines peuvent réaliser d'autres liaisons hydrogène, appelées interactions de Hoogsteen La Figure 1-17 schématise ces deux types de liens H pour chacune des deux purines. Les interactions Watson-Crick sont colorées en rouge et les interactions Hoogsteen sont en bleu.

Hoogsteen \

A

Hoogsteen

Figure 1-17

Liaisons hydrogènes possibles pour l'adénine et la guanine. Le « R » représente le désoxyribose lié à la base.

17

(30)

La Figure 1-18 représente deux exemples d'appariements de Hoogsteen entre bases azotées. L'un d'eux requiert la protonation d'une des bases azotées. D'autres appariements de Hoogsteen sont possibles ; cette notion s'étend à tout appariement comportant des liens H représentés en bleu à la Figure 1-17.

Figure 1-18

Exemples d'appariements de Hoogsteen.

Selon les conformations adoptées par les brins d'ADN, l'un, l'autre ou les deux types d'interaction décrits ci-dessus seront impliqués.

18

(31)

3.3 Les duplexes

Les duplexes comportent deux segments d'ADN associés par des interactions de type Watson-Crick. Plusieurs types de duplexes ont été mis en évidence parmi lesquels les plus communs sont l'ADN-A, l'ADN-B et l'ADN-Z ; tous trois sont illustrés à la Figure 1-19.

Figure 1-19

Structures de l'ADN-A, de l'ADN-B et de l'ADN-Z (de gauche à droite).

Les fichiers PDB utilisés pour créer ces représentations sont respectivement 1VJ4 IBNA et IDCG

La Structure B constitue la forme la plus courante de l'ADN. Proposée en 1953 par James Watson et Francis Crick elle fut inspirée et corroborée par un cliché de cristallographie RX de Rosalind Franklin La forme A a été mise en évidence et caractérisée la même année par Rosalind Franklin à des teneurs en eau plus faibles que la forme B La structure Z, quant à elle, est formée par certaines séquences dans des conditions spécifiques comme notamment à très haute force ionique ou en présence de cations divalents comme Mg^* Elle est de plus stabilisée par des cations complexes tels que [Co(NH3)6]'"et [Ru(NH3)6]'"‘'"''"’.

Le Tableau 1-1 reprend les principales caractéristiques structurales de ces trois types d'hélice.

ADN-A ADN-B ADN-Z

Hélice droite/ gauche Droite Droite Gauche

Diamètre 26 Â 20 Â 18 Â

Nombre de bases par tour 11 10.5 12

Incrément (par base) 2,6 Â 3,4 Â 3,7 Â

Tableau 1-1

Caractéristiques principales des trois duplexes les plus courants d'ADN.

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Une molécule d'ADN qui se replie sur elle-même peut former une portion d'ADN duplexe. Il est alors dit qu'elle adopte une structure en épingle à cheveux. La Figure 1-20 représente une molécule reployée de la sorte ainsi que la schématisation qui y est associée.

Figure 1-20

Structure en épingle à cheveux d'un brin d'ADN (1LA8) et représentation schématique associée à ce type de structure.

Les traits pointillés représentent des appariements de type Watson-Crick.

3.3.1 Duplexes et reconnaissance par hybridation

L'hybridation spontanée d'un brin d'ADN à son brin complémentaire pour former une structure duplexe permet la détection d'ADN et en particulier celle des portions d'ADN codant pour des protéines, les gènes.

Millan et al. ont été les pionniers dans l'utilisation de l'hybridation pour la détection électrochimique d'ADN Ils ont utilisé comme indicateurs d'hybridation des complexes métalliques de cobalt, électroactifs, qui se lient au sillon mineur de l'ADN duplexe.

Depuis leurs travaux, de nombreux groupes ont développé des stratégies de détection qui reposent sur l'immobilisation et l'hybridation de sondes d'ADN linéaires. La Figure 1-21 schématise l'hybridation de telles sondes. Pour majorité, ces travaux recourent soit à un marqueur redox fixé à la sonde soit présent en solution comme l'atteste le récent article de synthèse de E. Palecek et M. Bartosi'k Certaines études utilisent des sondes fixées sur un polymère électroactif ou une monocouche redox Moins fréquentes, les études basées sur l'électroactivité intrinsèque des bases nucléiques utilisent des sondes d'ADN linéaires exemptes de guanines (lesquelles sont remplacées par des inosines) pour détecter l'hybridation par oxydation des guanines de la cible L'une ou l'autre étude réalisée en absence de marqueur exploite une variation de capacité de l'interface

20

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ADN compl.

Figure 1-21

Représentation schématique de l'hybridation de sondes ADN linéaires (adaptée de la thèse de M. Steichen

En dehors des brins d'ADN linéaires, d'autres structures plus complexes de l'ADN ont été exploitées à des fins de reconnaissance dans des biosenseurs électrochimiques. C'est par exemple le cas des simples brins reployés en épingle à cheveux. Les stratégies de détection tirent alors profit de leur ouverture induite par l'hybridation avec une séquence complémentaire à celle de la boucle, laquelle provoque des modifications plus importantes des propriétés interfaciales par rapport au cas de sondes linéaires. Ce principe est illustré à la Figure 1-22.

Figure 1-22

Représentation schématique de l'hybridation de sondes ADN en épingles à cheveux (adaptée de la thèse de M. Steichen

Outre les méthodes basées sur le marquage des sondes en épingle à cheveux ou sur la présence d'un marqueur redox en solution des dispositifs sans marqueur ont été proposés (basés sur des mesures d'impédance

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(34)

3.4 Les triplexes

La première description d'une structure triplexe a été réalisée en 1957 sur base de données cristallographiques La formation d'une structure triplexe, telle qu'illustrée à la Figure 1-23, découle de l'interaction d'un troisième brin dans le sillon majeur d'un duplexe.

Au sein d'une structure duplexe, seules les positions Watson-Crick des bases sont impliquées dans des liaisons hydrogène. L'interaction avec un troisième brin d'ADN peut dès lors se produire par le biais d'appariements Hoogsteen entre les bases de celui-ci et celles situées dans le sillon majeur du duplexe Cette interaction requiert la protonation des cytosines du troisième brin et se produit au niveau des régions où un brin du duplexe comprend exclusivement des purines (brin polypurines) et l'autre uniquement des pyrimidines (brin polypyrimidines).

Figure 1-23

Structure d'un triplexe d'ADN (149D) ; la troisième chaîne, en mauve, est insérée dans le sillon majeur du duplexe.

Plusieurs types de triplexes intermoléculaires peuvent se former. Le motif dit

« pyrimidine » se distingue de celui dit « purine » par l'orientation du troisième brin. Dans le premier cas, la polarité (direction 5'-3') du troisième brin est parallèle au brin polypurines tandis que dans le second, elle est anti-parallèle (le brin est positionné dans le sens opposé). La Figure 1-24 représente ces deux motifs et les triplets de bases associés.

22

(35)

ia) y y

y. y

-t 11 > Il 11 I li I I 111 I I n 11 ^3'

— 5’

Triplex-fomiing oligonudcocide Polypurinc Htrand of DNA Pt>lyp)rrtmkline ^nuiJ of DNA

Protonation at N?

required

ib)

C+<}:C

Iiiiimrilii-rm-»-^' y

TA:T

TnptcX'rarming oligonucleotide Polypurine 5tnnd of DNA PtHypyrimidtne sinnü of DNA

AA:T

Figure 1-24

(a) Mode de liaison du troisième brin d'un triplexe au sein d'un motif dit « pyrimidine » et triplets de bases associés.

(b) Mode de liaison du troisième brin d'un triplexe au sein d'un motif dit « purine » et triplets de bases associés.

Outre ces motifs intermoléculaires, un brin d'ADN peut se reployer sur lui-même pour former une structure triplexe intramoléculaire. La formation d'un tel triplexe intramoléculaire a été suggérée pour la première fois en 1982 puis confirmée quelques années plus tard Lorsque la structure formée correspond au motif dit « pyrimidine », le triplexe intramoléculaire est appelé ADN-H car cette structure est stabilisée par des protons et se forme de préférence en milieu acide Des triplexes intramoléculaires correspondant au motif dit « purine » ont été identifiées par la suite et dénommées ADN-

1^* [72]

(36)

3.4.1 Triplexes et reconnaissance de duplexes

A. Patterson et al. ont développé une méthode électrochimique de détection d'ADN duplexe basée sur la formation d'un triplexe. Le principe de détection utilisé est schématisé à la Figure 1-25.

Figure 1-25

Principe de détection électrochimique d'un ADN duplexe par formation d'un triplexe.

Les sondes simple brin, modifiées par du bleu de méthylène, sont flexibles ce qui permet le transfert électronique entre le marqueur redox et l'électrode d'or modifiée. L'ajout de l'ADN duplexe cible conduit à la formation d'un triplexe rigide ce qui inhibe le transfert électronique. La limite de détection rapportée pour cette méthode est d'environ 10 nM.

24

(37)

3.5 Les quadruplexes

Nombre de séquences d'ADN riches en guanines sont capables de former des structures dénommées G-quadruplexes. Les guanines s'y associent pour former des quartets. Chaque quartet correspond à l'assemblage plan de quatre guanines tel que schématisé à la Figure 1-26. La première description d'un quartet, déduite par cristallographie, fut donnée en 1962 par Gellert et al. Les quatre guanines y forment un carré, chacune jouant à la fois le rôle de donneur et d'accepteur de liens H. Les désoxyriboses associés à ces guanines adoptent tous une conformation C2'-endo.

Figure 1-26

Structure d'un quartet. Le « R » représente le désoxyribose lié à la base.

Une structure quadruplexe est constituée d'un empilement de quartets caractérisé par un espacement régulier entre ces plans de guanines et une torsion systématique entre quartets successifs qui génèrent une hélice droite. Cet empilement, qui minimise la surface des bases exposée au solvant, est favorisé par des interactions hydrophobes. Le squelette sucre-phosphate forme quatre sillons contenant un réseau de molécules d'eau dont l'orientation est déterminée par la position des atomes donneurs (comme les groupements amines en N2) et accepteurs (tels que les N3) de liens H Un exemple de structure tridimensionnelle associée à un quadruplexe est illustré à la Figure 1-27.

25

(38)

Figure 1-27

Exemple de structure de quadruplexe tétramoléculaire possédant trois quartets (139D)

Au sein d'un quadruplexe, les segments impliqués dans la formation des empilements de quartets peuvent adopter différentes orientations relatives (en termes de polarité 5'-3'), présentées à la Figure 1-28. Chacune d'elle correspond à un arrangement syn-ont/ spécifique des torsions glycosidiques.

(a) (b) (c) (d) (e)

Figure 1-28

Arrangements relatifs possibles des brins pour un quadruplexe tétramoléculaire.

Le sens des flèches correspond à l'orientation 5' -> 3'. Les rectangles représentent des guanines.

Les guanosines adoptant des torsions glycosidiques anti sont indiquées par la coloration bleue de la guanine correspondante et les syn par la coloration rouge.

(a) et (b) quadruplexes parallèles, (c) et (e) quadruplexes anti-parallèle, (d) quadruplexe « 3+1 ».

26

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Un quadruplexe au sein duquel deux segments sont orientés dans un sens et les deux autres dans le sens opposé est appelé « anti-parallèle » (Figure l-28-c et e). Lorsque tous les segments sont orientés dans le même sens, le quadruplexe est dit « parallèle » (Figure l-28-a et b). A ce jour, pour des quadruplexes tétramoléculaires - aussi appelés intermoléculaires - parallèles seul l'arrangement avec des torsions glycosidiques anti (Figure l-28-a) a été mis en évidence.

Outre ces structures tétramoléculaires, les quadruplexes peuvent également être bimoléculaires ou monomoléculaires. Leur structure comprend alors des boucles entre les segments qui participent à l'empilement des quartets. Celles-ci peuvent être diagonales, latérales ou externes.

Différents reploiements possibles pour un quadruplexe bimoléculaire sont illustrés à la Figure 1-29. Les types de boucles impliqués sont mentionnés dans chaque cas.

Figure 1-29

Arrangements relatifs possibles des brins pour un quadruplexe bimoléculaire et types de boucles associés.

Le sens des flèches correspond à l'orientation 5' -> 3'. Les rectangles représentent des guanines. Les guanosines adoptant des torsions glycosidiques anti sont indiquées par la coloration bleue de la guanine correspondante et les syn par la

coloration rouge.

La Figure 1-30, page suivante, montre les topologies accessibles aux quadruplexes monomoléculaires - dits aussi intramoléculaires. Elles sont plus variées et plus complexes que pour les quadruplexes tétra- ou bimoléculaires.

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diagonale

latérale

Figure 1-30

Arrangements relatifs possibles des brins pour un quadruplexe monomoléculaire et types de boucles associés.

Le sens des flèches correspond à l'orientation 5' -> 3'. Les rectangles représentent des guanines. Les guanosines adoptant des torsions glycosidiques anti sont indiquées par la coloration bleue de la guanine correspondante et les syn par la

coloration rouge.

Si les liaisons H et les interactions hydrophobes favorisent la formation des structures quadruplexes, le positionnement des quatre oxygènes 06 au centre des quartets, en revanche, a un impact déstabilisateur en raison de leur forte densité de charges négatives.

La présence de cations au sein des quadruplexes joue dès lors un rôle déterminant dans la stabilisation de ces structures, différents cations pouvant stabiliser les quadruplexes à différents degrés.

De plus, la nature des cations peut influencer la conformation adoptée par les quadruplexes. Le type de quadruplexe formé par un brin d'ADN dépend donc non seulement de sa séquence mais aussi de la nature des cations qui le stabilisent.

En dehors des G-quadruplexes, il existe d'autres structures quadruplexes, comme les l-motifs qui impliquent des séquences riches en cytosines

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(41)

3.5.1 Quadruplexes et reconnaissance de protéines : les aptamères

Les applications qui exploitent les structures quadruplexes pour la détection électrochimique de protéines connaissent un essor important. Les dispositifs utilisés impliquent généralement des aptamères. En effet, parmi les aptamères ADN déjà sélectionnés vis-à-vis de protéines, de nombreuses séquences forment des structures quadruplexes. C'est le cas notamment d'aptamères qui possèdent une activité anti-virale, anti-proliférative ou anti-coagulante

Aptamères anti-viraux

Le virus d'immunodéficience humaine (VIH) représente l'agent étiologique du SIDA.

Plusieurs aptamères ont été développés pour cibler différentes protéines impliquées dans le processus d'infection par ce virus. Certains d'entre eux sont mentionnés ici à titre d'exemples.

Les séquences (GGGT)4 et GGG GTG GGAGGAGGG GT inhibent toutes deux l'intégrase du VIH in vitro bien qu'elles forment des quadruplexes de topologies distinctes La première adopte un reploiement de type quadruplexe anti-parallèle intramoléculaire. La seconde présente un arrangement dimérique interconnecté illustré à la Figure 1-31.

4

Motif structural d'un aptamère quadruplexe dimérique capable d'inhiber l'intégrase du VIH.

Différents aptamères ADN qui ciblent la transcriptase inverse du VIH ont été décrits notamment un quadruplexe monomoléculaire Il adopte la structure représentée à la Figure 1-32.

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S'

■G

;C

Figure 1-32

Motif structural d'un quadruplexe monomérique capable d'inhiber la transcriptase inverse du VIH.

Aptamères anti-prolifératifs

La séquence GGT GGT GGT GGT TGT GGT GGT GGT GG constitue un exemple d'aptamère anti-prolifératif. Elle se reploie en un quadruplexe bimoléculaire schématisé à la Figure 1-33.

Cet aptamère interagit avec la nucléoline, une protéine multifonctionnelle impliquée dans la transcription de TARN et la réplication de l'ADN et qui peut transférer des molécules de la surface cellulaire vers le noyau. La nucléoline est surexprimée dans différents tissus cancéreux ^{[86, 87]}

Figure 1-33

Schéma d'un aptamère quadruplexe bimoléculaire interagissant avec la nucléoline.

30

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Aptamères anti-coagulants

L'aptamère de la thrombine constitue le représentant par excellence des aptamères ADN quadruplexes anti-coagulants. Utilisé dans le présent travail, sa sélection a déjà été décrite à la section 1-2.3.

Dans l'année qui a suivi cette sélection, deux études indépendantes réalisées par RMN, en absence de thrombine, ont décrit le reploiement de l'aptamère schématisé à la Figure 1-34. Huit guanines forment un cœur central constitué de deux quartets connectés à une extrémité par deux boucles TT surplombant les sillons mineurs et à l'autre par la boucle TGT surplombant un sillon majeur. Cette structure correspond donc à un quadruplexe anti

parallèle monomoléculaire.

La même année, une structure cristallographique - d'une résolution de 2.9 Â - de l'aptamère en interaction avec la thrombine a été publiée En ce qui concerne l'aptamère, cette structure est similaire à celle déterminée par RMN en solution excepté que les boucles TT et la boucle TGT y surplombent respectivement les sillons majeurs et un sillon mineur. Dans cet article, les différences par rapport à la structure RMN sont attribuées à un changement conformationnel induit par l'interaction de l'aptamère avec la thrombine.

La Figure 1-34 schématise les deux reploiements distincts obtenus par RMN et par cristallographie.

RMN

Figure 1-34

Reploiement de l'aptamère obtenu par RMN (à gauche) et par cristallographie (à droite).

Les guanosines adoptant des torsions glycosidiques anti sont indiquées par la coloration bleue de la guanine correspondante et les syn par la coloration rouge.

En 1996, deux publications reviennent sur les données cristallographiques et tentent d'établir laquelle des deux structures de l'aptamère (RMN ou RX) interagit avec la thrombine. L'une d'elles démontre que le modèle RMN peut correspondre aux données cristallographiques Dans l'autre, au départ d'un cristal plus grand, K. Padmanabhan et A. Tulinsky améliorent la résolution à 2.8 Â et raffinent la structure sur base des deux reploiements proposés au préalable Toutefois, les critères cristallographiques ne permettent de lever l'ambiguïté ni sur la conformation de l'aptamère ni sur son mode d'interaction avec la thrombine. En effet, dans la structure dérivée du modèle

31

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cristallographique, la boucle TGT interagit au niveau du site de reconnaissance du fibrinogène et les boucles TT interagissent avec celui de l'héparine d'une molécule de thrombine voisine. Dans la structure découlant du modèle RMN, en revanche, les boucles TT interagissent avec l'exosite du fibrinogène tandis que la boucle TGT forme des interactions hydrophobes et des ponts salins dans le site de l'héparine d'une thrombine voisine. Ces deux modes d'interactions sont illustrés à la Figure 1-35.

Figure 1-35

Mode d'interaction de l'aptamère avec la thrombine selon les modèles Issus de la RMN (à gauche - IHAO

et de la cristallographie (à droite - IHAP Les acides nucléiques représentés en vert interagissent au niveau du site de fixation du fibrinogène et ceux en rouge au niveau de celui de l'héparine.

Bien que les critères cristallographiques ne permettent pas de discriminer les deux cas, des indications favorisent le modèle dérivé de la structure RMN. D'abord, l'interaction entre l'aptamère et la thrombine a été mise en évidence au niveau de l'exosite du fibrinogène Au sein du modèle issu de la structure RMN, les boucles TT, conservées parmi les séquences qui se lient à la thrombine, se fixent à ce site plutôt que la boucle TGT, non-conservée. Ensuite, des données cristallographiques relatives au complexe formé entre la thrombine et la séquence GGTTGG - qui inhibe la thrombine à des concentrations plus hautes que TBA - indiquent que deux brins GGTTGG formeraient une structure similaire à l'aptamère sans la boucle TGT. Ce sont donc les boucles TT qui se lieraient au site de reconnaissance du fibrinogène comme pour le modèle découlant de la RMN.

Dans un article paru en 2012, l'ambiguïté concernant le mode d'interaction a été totalement levée grâce à des données de diffraction obtenues sur le complexe thrombine- aptamère en présence de Na"^ à une résolution de 1,80 Â et de à 2,05 Â Celles-ci confirment que l'interaction avec l'exosite du fibrinogène se fait par les boucles TT (comme dans le modèle RMN).

32

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3.5.2 Détection électrochimique de protéines basée sur des aptamères ADN quadruplexes

Les aptamères ADN quadruplexes mentionnés ci-dessus constituent des exemples d'aptamères ciblant des protéines. Malgré l'importante diversité actuelle de ces aptamères, l'interaction entre la thrombine et son aptamère reste, à ce jour, le système-type pour la détection électrochimique de protéines grâce aux aptamères. Comparativement au nombre d'études relatives à la détection de thrombine, seuls quelques travaux se sont attelés à la conception de biosenseurs électrochimiques ciblant d'autres protéines telles que le lysozyme ou le PDGF (pour « Platelet-Derived Growth Factor ») Toutefois, comme les sondes impliquées dans ces cas n'adoptent pas de reploiement quadruplexe nous nous limiterons ici à la description de travaux portant sur la détection de la thrombine.

La littérature relative aux biosenseurs impliquant des aptamères est abondante et a fait l'objet de plusieurs articles de synthèse Son examen attentif révèle que la majorité des études exploitent les méthodologies décrites à la section 1-1. Les distinctions entre les travaux portent généralement sur les moyens de maximiser les variations de signal et sur les espèces électroactives utilisées. Cette diversité est illustrée dans cette section en démarrant des systèmes les plus complexes pour terminer sur des stratégies proches de celle sur laquelle porte le présent travail.

Différents aptamères ciblant une même protéine peuvent interagir au niveau de sites de liaison distincts, c'est notamment le cas pour la thrombine. Ceci permet le développement de stratégies où la cible est détectée « en sandwich » comme illustré à la Figure 1-36.

Dans ces dispositifs, après la formation de l'interaction entre l'aptamère immobilisé et la cible, un second aptamère est ajouté. Ce dernier est généralement marqué par une enzyme ou une nanoparticule ce qui permet l'amplification du signal par l'activation d'un cycle catalytique.

électrode

Figure 1-36

Schéma d'une méthode de détection « en sandwich » par deux aptamères.