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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Darte, C. (1976). Etude du transport des acides aminés dicarboxyliques et de sa régulation chez saccharomyces cerevisiae (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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nité de Physiologie cellulaire

ETUDE DU TRANSPORT DES ACIDES AMINES DICARBOXYLIQUES

ET DE SA REGULATION CHEZ S AC CHAROMYCES CEREVISIAE

-£j

Thèse présentée pour

l'obtention du grade légal de Docteur en Sciences

CLAUDE DARTE

19 7 6

de l'Unité de Physiologie cellulaire et de m'avoir accordé sa confiance pendant la réalisation de ce travail.

J'adresse mon amitié à G. Casteleyn: il sait combien il m'a aidé tant scientifiquement que moralement.

Mes remerciements s ' adressentaussi à E. Dubois et F. Messenguy pour l'apport de leurs discussions.

Je remercie égailement F. Muyldermans et J.-P. Ten Hâve pour l'aide qu'ils m'ont apportée.

A Danielle : merci.

J'ai bénéficié pendant trois ans ( 1973-1975 ) d'une

bourse de spécialisation de l'I.R.S.I.A.

TABLE DES MATIERES.

RESUME. 3

INTRODUCTION.

5

Chapitre I : Le transport chez les procaryotes.

6

Chapitre II : Le transport chez les eucaryotes. 15 Chapitre III; Energétisation du transporte 21 Chapitre IV : La régulation du transport. 26

Chapitre V : Objet du travail. 31

MATERIEL ET METHODES. 36

RESULTATS EXPERIMENTAUX. 40

Chapitre I ; Etude cinétique de l'entrée du

L-glutamate. 40

Chapitre II ; Régulation du transport du

L-glutamatee

79

Chapitre III: Rôle de la glutamate déshidrogénase anabplique dans la régulation du

transport du glutamate.

97

Chapitre IV ; L'ammonium en tant qu'effecteur

probable de la répression du système

GLU-P Ile 103

Chapitré V ; Importance du gène gdhCR dans la

régulation du transport du glutcimate.

109

DISCUSSION ET CONCLUSIONS. II

3

BIBLIOGRAPHIE. 128

468615

L'acide glutamique pénètre dans la cellule de Saccharo- myces cerevisiae ( souche sauvage

21278

b ) par trois systèmes de transport distincts: deux systèmes de transport spécifiques le système GLU-P I et le système GLU-P II et la perméase

générale des acides aminés.

Les systèmes GLU-P I et GLU-P II sont spécifiques vis à vis des trois acides aminés dicarboxyliques : le gluteimate, l'aspartate et

1

'cK,aminoadipate o

Le système GLU-P I est constitutif dans nos conditions de croissance. Son activité est inhibée par au moins le L-gluta- mate et la L-glutamine intracellulaires ou des dérivés métabo­

liques, à condition que la concentration d'cunmonium soit grande.

Le système GLU-P II est soumis à deux types de régulation L'étude du taux différentiel de synthèse de ce système de

transport montre qu'un élément au moins est réprimé vraisembla blement par l'ammonium.

Cette répression est abolie par la mutation gdh A loca­

lisée dans le gène de structure de la glutamate déshidrogénase anabolique NADP dépendante. La disparition de l'activité

catalytique de l'enzyme n’est cependant pas responsable de la perte de la régulation de synthèse du système GLU-P II. La glutamate déshidrogénase anabolique pourrait par conséquent être une protéine régulatrice impliquée dans le mécanisme de la répression comme dans le cas de l'arginase, de l'allantoï- nase et de

1

'uréoamidolyase.

L'intégrité d'un second gène, le gène gdhCR, est elle aussi nécessaire à l'établissement de la répression par l'am­

monium du système GLU-P II. Le système GLU-P II partage par conséquent un élément de régulation avec tous les enzymes soumis à une régulation azotée testé jusqu'à,ce jour.

L'activité du système GLU-P II est de plus inhibée au

moins par le glutamate et la glutamine intracellulaires ou des dérivés métaboliques.

L'étude de la spécificité de la perméase générale des acides aminés, également inactive en présence d'ammonium dans le milieu, n'avait pu préciser si les acides aminés dicarbo- xyliques font partie de ses substrats. Nous avons pu montrer que la perméase générale des acides aminés transporte effecti­

vement le L-glutamate et le L-aspartate» Nous n'avons pas déterminé si 1'(Xaminoadipate est lui aussi transporté par ce système.

Sur la base de leur spécificité et de leur mode de régu­

lation, nous discutons du rôle physiologique que pourraient avoir ces trois systèmes de transporte

Comme la perméase générale des acides aminés, le système GLU-P II pourrait constituer pour le glutamate un système de

transport cataboliqueo

Le rôle physiologique du système GLU-P I serait fonction de la source d'azote fournie aux cellules.

INTRODUCTION.

Bien que l'importance du concept de perméation sé­

lective avait été reconnue depuis longtemps en physiologie animale, l'étude chez les microorganismes du rôle de la mem­

brane dans les échanges de substances avec le milieu extérieur a longtemps été négligée: les microbiologistes qui étudiaient ].a phisiologie des microorganismes éliminaient le plus souvent les problèmes membranaires par l'emploi de conditions "in vitro"«

L'idée de perméation sélective en microbiologie a été suggérée chaque fois qu'une différence existait entre la capacité enzymatique d'un système en extrait et l'activité correspondante mesurée sur des cellules entières (Doudoroff et al., 19^9» Barrett et al., 1953» Kogut et Podoski, 1953)»

par exemple par l'état cryptique de certaines fonctions

spécifiques dans des cellules entières. La spécialisation des systèmes de transport était suggérée par l'accumulation par certaines cellules de métabolites (GaJ.e, 1947). la démonstra­

tion que les caractéristiques cinétiques de l'utilisation d'un ou de plusieurs substrats par des cellules entières

sont différentes de celles de la première étape du métabolisme de ces substrats mesurées en extrait et la mise en évidence, dans certains cas, de contrôles génétiques différents de la première étape d'utilisation et du transport n'ont fait que confirmer l'hypothèse de la spécialisation (pour revue: Cirillo,

1961

).

CHAPITRE I : LE TRANSPORT CHEZ LES PROÇARYQTES

1) LA LACTOSE PERMEASE CHEZ E. COLI .

L'étude du transport des y^galactosides chez E. coli par Monod et ses collaborateurs constitue l'étape décisive dans la compréhention du transport chez les microorganismes

( Rickenberg et al. , 1956 ; Cohen et Monod , 1957 ) • Ce travail , en reprenant les problèmes de crypticité spécifique déjà mentionnés et de spécialisation des systèmes de transport , conduira à la découverte du concept des perméases .

Ce travail désormais classique a conduit les auteurs à postuler l'existence dans la membrane imperméable "per se"

d'un transporteur protéique stéréospécifique , produit du gène y de l'opéron lac , inductible par les galactosides .

Cette perméase , couplée à une réaction fournissant de l'énergie, provoquerait l'accumulation intracellulaire de son substrat

( transport actif ) , tandis que découplée elle serait respon­

sable de l'équilibration des concentrations interne et externe ( transport passif ) .

La mise à profit par Fox et Kennedy ( Fox et Kennedy ,

1965

) de l'inhibition du transport des galactosides par

certains réactifs des thiols et de 1' effet protecteur exclusif de certains substrats de la perméase , leur a permis la mise au point d'une technique de marquage spécifique d'une protéine membranaire , appelée protéine M . Cette protéine M , marquée

spécifiquement par le N-éthyl maléimide radioactif , a pu être solubilisée et purifiée . D'un poids moléculaire de 31.000 , sa présence dans la membrane est en stricte corrélation avec l'expression du gène y de la perméase ( Fox et al. ,

1967

; Jones et Kennedy , I

969

) . La similitude de la spécificité de la protéine M et de la perméase des galactosides , aliée au fait que seul l'expression du gène y soit indispensable à la fois

ponr la fonction du transport du lactose et pour la présence de la protéine dans la membrane , suggèrent la similitude entre le transporteur postulé par Rickenberg et al. et la protéine M

( Kennedy , 1970 ) .

La méthode employée par Fox et Kennedy pour purifier la protéine M a récemment permis l'isolement chez une bactérie Gram^ ( B. subtilis ) de protéines pouvant être impliquées dans le transport d'acides dicarboxyliques du cycle de Krebs .

L'implication directe des deux protéines isolées , bien que proposée par les auteurs , n'est cependant pas démontrée ,

l'absence de mutant ne permettant pas d“analyse génétique analo­

gue à celle réalisée dans l'étude de la protéine M chez E. coli ( Willecke et Lange , 197^ > Fournier et Pcirdee , 197^ ) .

Le développement de l'étude du transport chez les bactéries a , par la suite , démontré la multiplicité des sys­

tèmes de transport spécifiques responsables de l'accumulation intracellulaire de leur(s) substrat(s) contre un gradient de concentrations ( pour revues : Oxender , 1972 ; Kepes , 1964 ).

En s'inspirant d'une classification des systèmes de transport actif des sucres chez les bactéries proposée par Kepes ( Kepes , 1973 ) > trois grandes classes de systèmes peuvent être distinguées ;

1) les systèmes de transport étroitement associés à la membrane et responsables de l'accumulation intracellulaire du/des substrat(s) non modi- fié(s) chimiquement contre un gradient de concentrations .Le prototype de cette classe est la perméase du lactose chez E. coli .

2

) les systèmes de transport sans modification chimique du/des substrat(s) , dont l'un des composants protéique est une "protéine liante périplasmique" .

3

) les systèmes à réaction vectorielle provoquant une modification chimique du substrat en même temps que sa translocation .

2) LES SYSTEMES DE TRANSPORT A PROTEINE LIANTE PERIPLASMIQUE .

Cette seconde classe n'existe que chez les bactéries Gram faisant intervenir un élément protéique du système de transport soit situé dans l'espace périplasmique entre la

membrane et la paroi soit faiblement attaché sur la face exter­

ne de la membrane . Cet élément protéique , contrairement au

"transporteur" des systèmes appartenant à la première classe citée , peut être libéré dans le milieu par un traitement des cellules par un choc osmotique à froid qui n'affecte pas leur viabilité ( Neu et Heppel , 1965 ).

Anraku a pu isoler des 2% des protéines libérées de E. coli par un tel traitement deux protéines liant le galactose et la leucine respectivement et sans activité enzymatique mesu­

rable ( Anraku , 196? ) •

Indépendamment et travaillait sur une autre souche de E, coli , Oxender et ses collaborateurs ont isolé , purifié et cristalisé la protéine liante de la leucine ( Piperno et

Oxender , 1968 ; Piperno et Oxender , I

966

; Penrose et aJ., ,

1968

) . Le transport de ces deux substances dans les cellules est fortement réduit par le choc osmotique à froid , des mutants

"perméase moins" ont perdu spécifiquement la protéine liante correspondante , 1 *inductibilité du système de transport du galactose par le galactose ou le D fucose est parallèle à celle de la protéine liante correspondante ( Horecker et al.. , 1960a;

Horecker et al. , 1960b ; Horecker , I

96

I ; Buttin , I

967

» Boos et Sarvas , 1970 ; Lengeler et al. , 1971 ) , la synthèse du système de transport de la leucine et celle de la protéine liante de la leucine sont réprimées par l'acide aminé .

Un rôle direct et spécifique dans le transport du gadactose et de la leucine a dès lors été postulé pour chacune des deux protéines liantes respectivement , d'autant plus qu*’on avait

montré que leur affinité et leur spécificité envers leur substrat mesurées"in vitro" sont comparables à celles mesurées "in vivo"

pour les deux systèmes de transport correspondants ( Piperno et Oxender ,

1966

; Anraku , I

968

) .

De nombreuses protéines liantes périplasmiques ont été depuis isolées de nombreuses bactéries Gram . Sur la base de critères analogues à ceux utilisés pour celles du galactose et de la leucine chez E. coli , un rôle direct dans le transport des substances pour lesquelles elles ont de l'affinité a été avancé ( pour revue : Oxender , 1972 ) . Dans tous les cas , la perte de la protéine liante d'une substance soit par choc osmotique , soit par mutation , conduit à la disparition plus ou moins complète d'au moins un des systèmes responsablesdu transport du métabolite .

La différence structurelle fondamentale entre les

systèmes de transport bactériens appartenant aux deux premières classes peut se mesurer peir l'étude du transport de métabolites par des vésicules membranaires débarrassées des parois et des constituants cytoplasmiques ( Kaback , 1972 ; Kaback , 197^ ) . A la condition de fournir de l'énergie au système ( sous for­

me de D lactate par exemple ) , seule l'activité des systèmes de transport appartenant à la première classe sera mesurable ; la préparation des vésicules membranaires impliquant la perte de toutes les protéines périplasmiques , tous les systèmes de transport de la seconde classe seront inactivés ( Lombairdi et Kaback , 1972 ) .

-Rôle des protéines liantes périplasmiques dans le transport .

Comme nous le voyons , les arguments en faveur d'un rôle direct dans le transport sont attrayants . Encore faut-il démontrer peir exemple que c'est la libération des protéines liantes pajr choc osmotique qui est directement responsable des diminutions de transport correspondantes et non pas une altéra­

tion des propriétés de la membrane qui inhiberait certaines activités de transport , La correspondance entre la régulation de certains systèmes perméasiques et celle de protéines liantes signifie-t-elle que les deux phénomènes soient liés ?

Dans bien des cas , la similitude entre les mesures de l'affi­

nité des systèmes de transport et des protéines liantes corres­

pondantes envers leur(s) substrat(s) peut indiquer que la reconnaissance du/des substrat(s) par la protéine liante est l'étape limitante de la réaction de transport (Oxender, 1972), mais elle peut tout aussi bien paraître suspecte, les condi­

tions de mesure étant fort différentes dans les deux cas.

Quelques tantatives ont été faites de rétablissement de l'activité de transport par l'addition de protéines liantes partiellement purifiées à des cellules ayant subi un choc osmo­

tique à froid. Bien que des résultats positifs aient été rap­

portés, le fait que ce soit toujours dans des conditions où l'activité de transport n'avait été que faiblement abaissées par le traitement des cellules (au plus

50

^), les rend peu convaincants (Anraku, 1967» Wilson et Hôlder,

1969

). D'autre part, des résiiltats franchement négatifs ont été obtenus

(Oxender, 1972). Le meilleur résultat est celui de Medveczky et Rosenberg qui rapportent la réactivation du transport du phosphate chez E. coli, qui est détruite spécifiqument par une mutation rendant la souche moins perméable au phosphate sans affecter la protéine liante correspondante (Medveczky et Rosenberg, I

969

) . Ce résultat indique peut être que les condi­

tions d'une bonne réincertion de la protéine dans la membrane n'étaient pas remplies dans les travaux précédemment cités;

mais surtout que si la protéine liante périplasmique joue un rôle direct dans la perméation, elle n'est vraisemblablement pas le seul élément du système de transport. Cette conclusion

est d'ailleurs en accord avec tous les résultats des études génétiques des systèmes de transport réalisées jusqu'à ce jour:

l'expression d'un ou de plusieurs gènes différents de celui codant la protéine liante sont nécessaires au bon fonctionne­

ment du transport, la présence d'une protéine liante normale n'étant pas la condition suffisante au transport.

Par exemple, chez E. coli le transport du galactose par le système des méthylgalactosides dépend de l'intégrité de

trois gènes différents: mglA, mglB et mglC. Le gène mglB codant la protéine liante, des mutants touchés dans les deux autres ne peuvent plus transporter efficacement les méthyl-

gcuLactosides et possèdent pourtant une protéine liante fonc­

tionnelle ( Boos ,

1969

; Hazelbauer et Adler , 1971 ) •

On a montré , de la même façon , que l'intégrité de plusieurs gènes différents de celui codant la protéine liante périplas- mique spécifique est nécessaire spécifiquement aux transports du maltose , du glutamate et des acides dicarboxyliques chez E. coli ( Schwartz , I

966

; Hatfield et al. , I

969

> Hofmung et Schwartz , 1972 ; Hofmung , 197^ > Hofmung et Schwartz , I

969

; Willis et Furlong , 1975 ! Barash et Halpern , 1971 5 Miner et Frank , 197^ ) > du sulphate et de l'histidine chez Salmonella typhimuriura ( Pardee et al. , I

966

; Otha et al. , 1971 ;

Ames ,

1972

) .

On peut suposer que certains de ces gènes autres que celvii do structure de la protéine liante puissent jouer un rôle dans la régulation des systèmes de transport correspondants ou que leur expression n'affecte qu'indirectement l'activité de

transport en déterminant une propriété nécessaire de la membra­

ne . Mais la spécificité de la réduction de l'activité de trans port provoquées par les mutations localisées dans ces gènes discrédite la dernière hypothèse » Des travaux récents sont en faveur d'une nature protéique du produit de certains de ces gènes .

Chez S. typhimurium par exemple , le produit du gène His P , indépendent du gène de structure de la protéine liante

( His J ) du système de transport à grande affinité de 1' his- tidine , est une protéine : une mutation amber localisée dans ce gène provoque l'inhibition complète de l'activité de ce système ( Ames et Roth , I

968

) . Lo et Ranwal ont pu isoler à peirtir de la membrane de E. coli les deux protéines codées par les deux gènes autres que celui de structure de la protéine liante dont l'expression est nécessaire spécifiquement au trans port des acides dycarboxiliques ( Lo et Ranwal , 1975 ) .

L'ensemble de ces résultats est plutôt en faveur d'une structure complexe des systèmes de transport dépendant d'une protéine liante périplasmique spécifique . Ces systèmes néces­

siteraient 1' activité de plusieurs protéines membranaires

en .plus de la protéine liante elle-même . Cette dernière recon­

naîtrait son substrat dans le milieu extérieur et l'apporterait au niveau du site de translocation membranaire spécifique , composé au moins en partie des autres éléments protéiques du système de transport . Récemment Robins et Rotman ont montré que la translocation du galactose par le système des méthyl-

galactosides de E. coli ne nécessite pas la présence de la

protéine liante spécifique mais dépend de l'expression des deux gènes mglA etmglC ( voir plus haut ) ( Robins et Rotman , 1975 ) • La distinction entre l'étape de la reconnaissance du substrat par la protéine liante et celle de sa translocation est encore accentuée par les résultats de Willis et Furlong : l'activation du trasport du glucose par le Na^ ( Miner et Frank , 197^ ;

Maxcus et al. , 1975 ) chez Eo coli W serait due à celle de l'é­

tape de translocation , la protéine liante spécifique correspon­

dante paraissant insensible à la présence du cation ( Willis et Furlong , 1975 ) • Enfin , chez S» typhimurium , une mutation localisée dans le gène de structure de la protéine liante J de l'histidine , sans modifier l'affinité de liaison de l'acide aminé par la protéine J "in vitro” , provoque une diminution importante de l'entrée de l'histidine "in vivo" : le Km de

l'entrée est augmenté . Les auteurs postiolent que la protéine J du mütamt est affectée au site de reconnaissance du second élément

du système de transport , la protéine P , non modifiée ( Kuster et Ames , 197^ ) •

3) LES SYSTEMES A REACTION VECTORIELLE .

Cette troisième classe est représentée essentiellement par le système PEP-Ptransférase . Contrairement aux systèmes

appartenant aux deux premières , un système à réaction vecto­

rielle modifie chimiquement son/ses substrat(s) en même temps qu'il le transloque .

L'étude de ce type de système a débuté par la description d'une nouvelle P-transféraffie bactérienne qui catalyse le trans­

fert de phosphate du P-énolpyruvate à une série de sucres

( Kundig et al. , 1964 ) . La réaction , constituée de deux étapes , est la suivante :

PEP + HPr ' ^^pyruvate + P-HPr (l) Enz.I ,Mg

P-IiPr + Sucre ---Sucre-P + HPr (

2

) Enz.II,Mg

(Facteurlll)

PEP + Sucre ---^---m- Sucre-P + pyruvate (

3

) EnzI,EnzII,Mg ,HPr

(Facteurlll)

( Kundig et al. , I

966

)

HPr , une protéine de faible poids moléculaire thermos­

table qui a été purifiée jusqu'à l'homogénéité ( Anderson et al.,

1971

) et l'enzyme I sont principalement solubles , tandis

que l'enzyme II est membranaire . La protéine "Facteur III" n'a été décrite que chez quelques bactéries , en particulier chez S. aureus ( Simoni et al. , I

968

; Hengstenberg et al. ,

1968

);

elle transfert le phosphate de P-HPr au sucre » L'enzyme II est responsable de la spécificité de la réaction envers les diffé­

rents sucres : la perte , par mutation , d'un des nombreux enzymes II n'affecte la phosphorylation que d'un seul sucre ( Epstein , 1973 ) . Par contre , HPr et 1"enzyme I sont parta­

gés par tous les substrats ( Simoni et al. , I

967

) .

La participation du système dans le transport de certains sucres chez les bactéries a fait l'objet de nombreuses dis­

cussions ( pour revue ; Wilbrandt et Rosenberg , I

96

I ; Christensen , I

962

) . La démonstration définitive n'a été apportée que par 1' emploi de vésicules membranaires débarras­

sées de la paroi bactérienne et des constituants cytoplasmiques ( Kaback , 1970 ) approvisionnées en PEP .

Dans ce système simplifié , on a montré que le sucre est , en même temps que phosphorylé , accumulé contre un gra­

dient de concentrations à 1' intérieur des vésicules <, Le fait que cette accumulation disparaisse dans des vésicules préparées à partir de mutants qui ont perdu l'un ou l'autre composant du système PEP-P-transférase et que cette altération du transport ne touche spécifiquement que celui des substrats du système ,

démontre 1 ' individuailité de ce système de transport (Kaback, I

97

O; Epstein et Curtis, 1972).

Les causes de l'orientation de la réaction (le sub­

strat est puisé

à

l'extérieur et relâché, phosphorylé

à 1”

intérieur) ne sont pas connues.Soit que l'insertion de l'enzymell dans la membrane est asymétrique, soit que la différence de

composition des milieux intérieur et extérieur impose l'orienta­

tion (Kepes,

1973

).

Le système PEP-Ptransférase, présent chez la majorité des bactéries étudiées tant Gram^ que Gram , ne semble trans­

porter en général, que peu de sucres différents: le glucose, le mannose, le fructose et le mannitol chez E.coli par exemple

(Tanaka,Lerner et Lin , I

967

). Il ne transporte ni les acides aminés ni la plupart des sucres dont les systèmes de transport sont inductibles (qui appartiennent aux deux premières classes)

(Kaback 1972) . Chez Staphylococcus aureus par contre, la plupart des hydrates de carbone sont transportés par un système de

transport de ce type (Kaback,1972) »

Jusqu'à ce jour, on n'a rapporté l'existence que d'un second système de transport appartenant à la classe des systèmes à réaction vectorielle chez les bactéries (Hochstadt et al., 1971) Le transport de l'adénine par des vésicviles de E.coli est

couplé à la phosphorylation sous forme d'AMP. La réaction est catalysée par" l'adénine phosphoribosyltransférase stimulée par le 5-phosphoribosyl-l-pyrophosphate.

L'étude comparative du transport de nombreux métabolitès chez les bactéries montre que les systèmes de transport actif y sont prédominants (Kotyk,

1973)»

Ils sont tous constitués d'un ou plusieurs éléments protéiques associés plus ou moins étroitement

à

la membrane plasmique.

L'hypothèse de l'existence de transporteurs protéiques membra­

naires et spécifiques développée par Rickenberg et al. dès 1956 s'est par conséquent toujours vérifiée. Les différences structu­

relles (couplées

à

des différences dans le mécanisme de la

Bésermaisi le nem de ''perméase" est denné exelusivement à 1»

élément de reeennaissanee spéeifique du sufestrat# tandis ^ue la désignatien "système de transpert" s'applique au système dans sa tetalité#

6HAPlf«g XX

I

Li T^ANiPOËT GHiZ Lfi füOABYOTfi.

1) Lii iü6ASY©™ ÏNfiRîltmi.

L'étude "in vive" du transpert des métaPelites ehez les ehampignens a mentré que l'entrée des aeides aminés est due à l'existenee de systèmes de transpert aetif et que eelle des sueres est prineipalemènt médiatisée par des systèmes de transpert passif#

la) Le transpert des aeides aminés#

11 est assuré à la feis par des systèmes de transpert spéeifiques et par des systèmes à spéeifité beaueeup plus large (fateman et al#f 1173 1 fateman et al#flf74f ierdce et lfl7l HaeJfitte et §lif lf7©l SHye et Segelf I970i )• Sn parti- eulieri en a mentré par des eMpérienees de eempétitien et le plus seuvent par l'iselement de mutatiens détruisant spéeifi»

quement eHaeun des systlmü étudiés> qu'il existe ehe^ S«eere- viiiiii des systèmes de transpert spéeifiques de la L«>arif la L=lyS| la L=metf les aeides aminés dlearbexyllques» la L-his, la L=pre» l'urée et l'ammenlum ( Tableau I ).

gn eutre# il existe ehea eet ©rganisme un système de transpert

"général" , "perméase générale" eu "GAP" à spécificité beaueeup

plus étendue# transportant la majorité des acides ^inés et

détruite spécifiquement par la mutation gap( Tableau I ).

Tableau I ; systèmes de transport chez Si cerevisiae.

I. Systèmes de trans­

port spécifiques.

Références.

L-arginine Grenson et aLL . , I966.

L-lysine Grenson, I966.

L-méthionine Gits et Grenson, I967•

Acides aminés dicarboxyliques

Joiris et Grenson, I969;

Darte et Grenson, 1975a et 1975b.

L-histidine Crabeel et Grenson, 1970.

L-proline Casteleyn; résultats non pu­

bliés.

S-adénosylméthionine Petrotta-Simpson et al., 1975.

Pyrimidines Grenson, I9690

Ammonium Roon et al., 1975=

Urée Cooper et Sumrada, 1975=

II. Systèmes de trans­

port général des acides aminés

(Perméase Générale)

Grenson et al., 1970j

Grenson et Hou, 1972=

Ib) Le transport des sucrest

Le transport passif des sucres chez Stcerevisiae serait assuré par deux systèmes spécifique chacun d'un groupe de

monosaccharides, un troisième système de transport passif ap­

paraissant après induction par le galactose ou le glucose (Kotyki 19671 Cirillo, I968).

le) Isolement de protéines liantes chez les champignons.

La spécialisation des systèmes de transport, leur spéci­

ficité, leur saturabilité par leur(s) substrat(s)et leur

dépendance de l'expression de gènes spécifiques, suggèrent, com­

me chez les bactéries, la nature protéique d'au moins une de leurscomposantes .

Les différentes protéines liantes isolées sont présentées dans le tableau II. Les argiiments en faveur du rôle de ces pro­

téines dans le transport sont parfois malheureusement fort

pauvres et fort peu convaincants.Vorisek d'ailleurs n'en présente aucun et Kotyk et collaborateurs à peine davantage. Par contre, les arguments essentiellement génétiques présentés par Wiley et par Stuart et Debusk nous font penser qu'ils ont réellement réussi l'isolement de composants protéiques de systèmes de trans­

port. Oes auteurs ,en particulier, ont montré qué les deux mutations affeotant respeotivement et spécifiquement le trans­

port des acides aminés basiques et neutres, provoquent la

substitution d'acide aminé dans chacune des deux protéines liantes oorrespondantes• Par contre, une troisième mutation à effet

pléiotrope sur l'entrée des aoides aminés ne semble pas modi­

fier les propriétés des deux protéines liantes isolées.

Tous les systèmes de transport isolés posséderaient un élément commun ou la mutation affecterait une fonction qui leur serait nécessaire à tous, comme l'approvisionnement en énergie par exemple.

Ces résultats sont fort comparables à ceux obtenus chez les bactéries et en faveur d'une structure complexe des systèmes de transport. L'existence des deux types de mutations, spéci­

fiques et pléiotropes, chez S.cerevisiae (Grenson et Hennaut

1971) peut être due à une structure aneilogue de ses systèmes de

transport des acides aminés.

fère se distingue essentiellement de celui des micrcorganismes par la prédominance de la diffusion libre (transport passif)^

sauf dans les organes spécialisés dans le transport comme le rein ou l’intestin grêle où le transport est actif (Sbruik et Bihler, 19751 Kotyk, 19731 Kimmioh, 1973).

La spécificité et le nombre des systèmes de transport ne sont pas bien établis. Il apparait de plus en plus que la spé­

cificité serait large, certains auteurs allant Jusqu'à postu­

ler l'existence d'un transporteur polyfonotionnel commun aux acides aminés et aux sucres (Alvarado. 1966 et 1968).

Il semble plus vraisemblable cependant qu'il existe au moins un système de transport spécifique de chacun de ces deux types de nonélectrolytes ( voir pour revue Kimmioh|1973I Christensen et al., 1973).

La nature du transporteur postulé n'est pas connue# Par analogie avec le transport chez les mioroorganismes chez qui la nature protéique de certains éléments des systèmes de transport

est maintenant bien établie., différents auteurs ont essayé d'iso 1er de la membrane cellulaire une ou plusieurs protéines dont les caractéristiques pcuvaient ccîncider avec celles attendues d'un transpcrteur.

Thomas et collaborateurs ( 1973 et 1973) ont isolé de la bordure en brosse du rein de rat,

peut

une méthode analogue à celle de Fox et Kennedy ( Fox et Kennedy, 19651 voir plus haut), une protéine de poids moléculaire de 30.000 susceptible d'être le transporteur du D-gluoose . Faust et Shearin ( Faust et Shearin 197à) ont isolé de la bordure en brosse de l'intestin grêle de Hamster, une protéine de poids moléculaire de 56.000 capable de lier réversiblement le D-glucose et la L-histidine otqui d'après

eux pourrait être le transporteur polyfonotionnel des sucres et

des acides aminés postulé par Alvarado (Alvarado, 1968). Cette

conclusion cependant est basée uniquement sur la dépendance

spécifique au sodium de la liaison à la fois du transport des

sucres et des acides aminés dans l'intestin grêle et de la liai­

son de la protéine liante isolée avec le substrat.

Récemment enfin, Hbmk et Guidotti ( Homk et Guidotti, 1975) ont isolé de la membrane de l'érythrocyte humain une protéine

qui présente toutes les caractéristiques du transporteur commun du chlore, du phosphate et du sulfate suggéré par Passow

( Passow, 1964).

Les auteurs de ces travaux ne donnent aucune preuve direc­

te de la participation de la protéine isolée dans le transport des substances pour lesquelles elles possèdent de l'affinité.

Ils le suggèrent cependant en montrant la similitude entre les propriétés de la liaison du métabolite par le transporteur pré­

sumé et celles du transport correspondant ( activation par Na^,

inhibition par certains inhibiteurs etc...)

CHAPITRE III ; ENERGETISATION DU TRANSPORT .

Un apport d'énergie est nécessaire chaque fois que l'activité d'un système de transport provoque l'accumulation d'un métabolite contre un gradient de concentrations. L'étu­

de du métabolisme énergétique couplé à l'accumulation de métabolites dans la cellule a essentiellement été dévelop­

pée chez les cellules de mammifère et récemment chez les bactéries.

1) CHEZ LES PROCARYOTES.

Pour les systèmes phosphotransférases l'énergie est dérivée directement du phosphoénolpyruvate: le bilan énergé­

tique des réactions est favorable à l'accumulation (Kaback,

1970

et

1974;

Kepes,

1973).

La source d'énergie dés autres systèmes de trànsport pourrait dépendre de ce qu'ils possèdent ou non une protéine liante périplasmique. Berger et Heppel (Berger, 1973; Berger et Heppel, 1974) ont montré quel

». l'accumulation d'un substrat par un système à pro­

téine liante périplasmique chez B. coli est nécessairement liée à: la présence d'ATP dans la cellule; elle est totalement inhibée lorsque la cellule est vidée de son ATP soit par trai­

tement à l'arsénate soit à cause d'une mutation provoquant le

/

2

+

2

+

découplage de la phosphcrylatien oxydative (mutant Mg /Ca

ATPase membranaire ), quand le donneur d'énergie est exclusi­

vement oxydable par les chaînes respiratoires.

- par contre, les systèmes de transport fermement attachés à la membrane peuvent être énergétisés soit directe­

ment par la respiration même sans phosphorylation oxydative

2

+

2

+ soit par l'hydrolyse de l'ATP exclusivement par la Mg /Ca ATPase: il y aurait dans les deux cas formation d'un état

activé membranaire conformément à l'h

3

q>othèse chémiosmotique de Mitchell (Mitchell, I

963

; pour revue; Harold, 1972).

Ces résultats ont été largement confirmés par la suite (Wilson, 197^* Curtis, 197^; Covrell, 197^5 Rosen et Àdler, 1975; Hirata et al., 1973 et 197^ î Altendorf et Hajrold, 197^» Kashket et Wilson, 1972 et 1973» Klein et Boyer, 1972; Rosenberg et al., 1975;

Kasahara et Anraku,

197^»

Lieberman et Hong,

197^;

Kadner et Winkler, 1975» Sprott et al., 1975). Ils sont parti­

culièrement en accord avec ceux de Kaback et collaborateurs.

Ces auteurs ont depuis longtemps étudié l'acciimulation des non- électrolytes par des vésicules membranaires activées par le D-lactate (pour revue: Kaback, 1972 et 197^)» Les systèmes étudiés dans ces conditions sont ceux étroitement fixés à la membrane (Lombard! et Kaback, 1972). Kaback s*est longtemps op­

posé au concept d'état activé membranaire; il vient de s'y rallier récemment (Schuldiner, Kerwar et Kaback, 1975).

- Nature de l'état activé membranaire:

D'après l'hypothèse originaie de Mitchell, l’état ac­

tivé membranaire serait lié à la formation d'un gradient de

protons (H^ . Ht ^ ) lors du transfert d'électrons dans les

ext. int.' 2+ 2+

chaînes respiratoires ou par l'hydrolyse d'ATP par la Mg /C

bl

ATPase (Mitchell, 1963). Conformément à elle, l'addition d’Og à des vésicules membranaires d'E. coli en anaérobiose en pré­

sence de D-lactate provoque une sortie rapide de H (Reeves, 1971) et 1 'acctunulation d'un cation liposoluble, le dibenzyl- diméthylammonium (Hirata et al., 1973)» ce qui indique vrai­

semblablement l'apparition d'un potentiel membranaire avec l'intérieur de la cellule négatifs

» Nature du couplage entre l'état activé membranaire et

1b

transport L'hypothèse est que les métabolites seraient cotrans-

portés avec des protons, le gradient de ces protons consti­

tuant la force motrice du phénomène (Mitchell, I963) .

Hirata et al. (Hirata et al., 197è) ont montré par exemple que l'entrée de la L-proline dans des vésicules membranaires de E. coli peut être induite par l'établissement artificiel d'un potentiel de membrane et est couplée d'une entrée simul-

tannée de de protons.

Cecehini ©t Koch (Cecehini et Koch, 1975) montrent que l'entrée des galactosides par le système lac chez E.coli est vraisem­

blablement couplée à celle de protonsi

Le transport du lactose chez E.coli semble couplé lui aussi au cotransport de protons (West et Mitchell, 1973> West, I970).

L'intervention des 10ns Na et K dans le phénomène d'énergétisation semble peu probable chez les bactéries. Si la présence de ces ions dans le milieu est nécessaire à certaines activités de transport, jamais leur gradient n'a pu être direc­

tement impliqué (Harold, 1972) .

Chez les cellules de mammifère par contre, l'energie du transport actif est au moins partiellement dérivée des gradients de Na^ et de engendrés par la Na^/K^ ATPase mem­

branaire.

2) LES CELLULES DE MAMMIFERE ,

Le transport actif des sucres et des acides aminés dans les cellules épithéliedes d'intestin grêle , des tubes proximaux de rein et des cellules d'Erlich dépend de la pré­

sence de Na^ dans le milieu et de l'activité de la Na'*'/K'*'ATPase membranaire (Kimmich,1973).

Deux hypothèses ont été initialement formulées pour expliquer 1'énergétisation de oes transports 1

1. l'hydrolyse de l'ATP par l'ATPase serait la source directe de l'énergie, le Na'*’ n'étant nécessaire que pour 1' activation de l'enzyme (Csaky, 1963)0

2. les sucres et les acides aminés seraient cotrans- portés avec le Na , l'énergie étant fournie par l'établisse­

ment d'un gradient,à travers la membrane, de Na^favorable

^ ext int^ Na*^/K'''ATPase (Crane et al., 1965)1 partie intégrante de la pompe à Na^.

Un grand nombre de travaux indiquent qu'en absence de toute autre source d'énergie, un gradient favorable de Na^

peut induire une accumulation de sucres ou d'acides aminés

à l'intérieur des cellules (Kimmich, 1973a; Hopfer et al.,

Cependant, l’énergie contenue dans le gradient de Na^ ne semble pas être suffisante pour assurer à elle seule l'accu­

mulation de métabolites mesurée dans d'autres conditions (Riggs et al., 1958) Bddy et al., 1967) Bddy, 1968) Jacquez et Schafer, 1969) Reid et Bddy, 1971) et la paticipation du gradient de a été suggérée et confirmée ensuite (Kimmieh, 1973b) Reid et Bddy, 1971) Schafer et Heinz, 1975)* Celle d'autres ions, comme les protons par exemple, n'a jamais été démontrée chez les cellules de mammifèrei sans être exclue à priori, elle ne semble pas importante (Jacquez, 1972) Bddy, 1972) . Néammoins, même dans ces conditions et bien que leur participation ne puisse plus être mise en doute, les gradients d'ions ne semblent pas constituer l'unique source d'énergie du transport (Kimmieh, 1973b) Schafer, 1972) Jacquez, 1972) Bddy, 1968) Colombini et Johnstone, 197^)> une autre source

suplémentalre d'énergie proviendrait du métabolisme cellulaire sous la forme d'ATP ou d'un de ses dérivé (Schafer, 1972)

Il apparait par conséquent de plus en plus, qu'il faille réconcilier les hypothèses de Crâne et de Csaky qui semblaient pourtant opposées. Mais il suffit de constater la difficulté, voir l'impossibilité d'estimer la part des ions intracellulaires participant effectivement dans le phénomène d*énergétisation, pour réaliser qu'il est actuellement impos­

sible de se faire une idée précise de l'importance respective des différentes sources d'énergie disponibles pour le trans­

port ,

Kimmieh et ses collaborateurs ont proposé un modèle dans le­

quel les transports des sucres et des acides aminés sont

énergétisés par un des intermédiaires phosphorylés connus de

la Na^/K^ ATPase membranaire et par les gradients de Na^ et

de (Kimmieh, 1970, 1972, 1973a et 1973b, 1975). Ce modèle

est purement formel. Il souligne cependant le rôle central de

la Na''’/K^ ATPase (pompe à Na''') non seulement dans l'établis­

sement d'une des deux sources possibles d'énergie du transport, les gradients de Na^ et mais aussi dans un couplage plus direct avec le métabolisme énergétique de la cellule a

3) CHEZ LES CHAMPIGNONS,

D'une façon générale» les acides aminés dont les systèmes de transport ont été étudiés» sont accumulés dans la cellule contre un gradient de concentrations sans modifi­

cation chimique (voir plus haut). Ce transport est rendu actif par son couplage avec le métabolisme énergétique de la cellule (Crabeel» 1973» Marzluf» 197^1 Pateman et al.» 1974;

Cooper et Sunrada» 1975). la nature de ce couplage n'est cependant pas établie.

D'après certains auteurs» le couplage du transport des acides aminés chez les champignons pourrait présenter cer­

taines analogies avec celui existant chez les cellules de mammifère. Cette hypothèse est basée sur la constatation que l'entrée d'acides aminés dans des cellules de levure partiel­

lement carencées en énergie est d'autant plus grande que le pH du milieu est bas. Cet effet de pH peut être inhibé par l'augmentation de la concentration externe de alors que le Na^ ne semble pas important (Eddy» 1966 et 1972b), Eddy supose que l'entrée des acides aminés pourrait être énergéti- sée par un ootransport avec des protons et par la sortie

simultané® de K**", L'énergie proviendrait du maintient par la cellule des gradients de H et K i la levure absorbe le K vraisemblablement par son échange avec des protons» qui dès lors s'accumulent à l'extérieur; cet échange pourrait être

couplé directement à l'hydrolyse d'ATP par une H'*^/K^ ATPase membranaire hypothétique (analogue à la Na^/K ATPase) mais

suggérée par des études directes de l'établissement du poten­

tiel de membrane chez les champignons (Pena et al.» 1972;

Slayman et eü.. » 1973). Cette hypothèse est affirmée par la

constatation que l'entrée d'acides aminés» en particulier du

glutamate» chez la levure est accompagnée par une alcalinisa-

OHAPITRE IV J LA REGULATION DU TRANSPORT,

L'étude einétique et, chaque fois que possible,

génétique du transport chez les procaryotes et les eucaryotes conduit à la conclusion qu'il est réalisé par des systèmes de transport membranaires spécifiques, La nature protéique d'au moins certains de leurs composants, démontrée dans un nombre croissant de cas, est généralement, admise, leur activité ressemblant à celle des systèmes enzymatiques.

On comprend dès lors, qu'une régulation précise du transport est le plus souvent nécessaire à son intégration dans le métabolisme cellulaire.

Cette régulation pourra, comme pour les enzymes, s'exercer à deux nivaux différents» soit une régulation d'ac­

tivité, soit une rég\ilation de la synthèse d'au moins un des composants du système, soit les deux. Il faut dors et déjà noter que la spécificité des systèmes de transport, qui im­

plique leur multiplicité, outre qu'elle assure la perméation sélective, permet une régulation individuelle de chacun d'eux en fonction des exigences du métabolisme. Cette notion est d'autant plus importante qu'il existé souvent plusieurs

systèmes différents capables de transporter un métabolite don né dans la même cellule (pour revuet Oxender, 1972)» sans doute chacun des systèmes mis en oeuvre remplit-il un rôle physiologique différent et dans ce cas pourrait-on mesurer des différences entre leur régulation,

1) REGULATION D'ACTIVITE.

Une approche simple de l'étude de la régulation

d'activité est celle qui consiste à analyser les facteurs qui font qu'un métabolite additionné en excès au milieu dans le­

quel se trouvent les cellules ne s'accumule pas indéfiniment

à l'intérieur de ces cellules» mais que assez rapidement»

au bout de quelques minutes» un plateau maximum d'accumulation est atteinte Soit que la concentation interne du métabolite au plateau est égale ou inférieure à la concentration externe (transport passif)» soit plus grande (transport actif)•

- Transport passif.

Dans le cas du transport passif médiatisé par des systèmes de transport assurant à la fois l'entrée et la sor­

tie de leur substrat» un état d'équilibre s'établit entre les deux phénomènes dès que les concentrations externes et inter­

ne s'égalisent. Cette situation simple requiert que l'entrée nette du substrat ne constitue pas l'étape limitante de son utilisation par les cellules. C'est le cas du treuisport des acides aminés ou des sucres chez les bactéries privées d'éner­

gie et de celui des sucres chez certaines cellioles de mammi­

fère (érythrocytes» du cristallin» du foie etc...) par exemple (Oxender» 1972) Elbruik et Bihler» 1973). Aucune régulation à proprement parler n'est nécessaire.

Si par contre» l'étape d'entrée nette est toujours limitante» le métabolite ne s'accumulant pas ou peu dans la cellule» son système de transport fonctionnant au maxi­

mum de ses capacités. C'est probablement le cas du glucose

chez le muscle ou le tissu adipeux par exemple (Elbruik et Bihler 1973). Une augmentation de l'utilisation du substrat par la

cellule n'est dès lors possible que si la capacité du trans­

port augmente parallèlement. Lors des contractions musculaires le catabolisme du glucose s'accroît ainsi que son transport dans la cellule pourtant toujours limitant. Une régulation commune contrôlerait les deux activités (Elbruik et Bihler»

1975)modxilant en particitlier la capacité du système de trans­

port et l'adaptant aux différentes nécessités métaboliques de

la cellule.

- Transport actif.

Le mode de régulation du transport actif est fort dif­

férent entre les bactéries et les champignons.

- Les bactéries» chez B.coli par exemple, le niveau d'équili­

bre de la concentration interne de beaucoup de sucres et d'aci­

des euninés est déterminé par la balance entre la vitesse de leur entrée et de leur sortie. Il y a donc échange entre sub­

strat externe et interne de façon assez semblable à celle

décrite pour le transport passif non limitant (Kepes et Cohen, 1962} Kepes, 1973 )• Ici cependant, l'apport d'énergie induit une accumulation du substrat contre un gradient de concentra­

tions» Cet effet serait du à une modification du "transporteur"

sur la face interne de la membrane uniquement qui diminuerait son affinité pour son substrat intracellulaire (Fox et Kennedy, 1965» Winkler et Wilson, 1966} Kepes, 1971> Wilson et al.,1972;

Wilson et Kush, 1972; Lagarde et Stoeber, 1975) et qui peut- être l'induirait à se réorienter, libre de substrat, plus rapidement vers l'extérieur (Schuldiner et al., 1975 J Rudnick et Kaback, 1975) mais voir pour controverse, Lancaster et al.,

1975).

- Les champignons; chez la levure par exemple, des acides 1 aminés accumulés dans la cellule contre un gradient de con­

centrations ne peuvent plus ni settir ni être échangés avec les acides aminés du milieu (Crabeel et Orenson, 1970; Orenson, 19731 étude réalisée sur le transport de la L-his ).

L'étape d'entrée dans la cellvile n'étant généralement pas limitante (Grenson, 1973)1 les acides aminés ne s'accumu­

lent pourtant pas indéfiniment dans la cellule. Crabeel et Grenson (Crabeel et Grenson, 1970) ont montré, chez S.cerevi-

siae, dans le cas de l'histidine, que l'entrée est régulée spécifiquement peur une inhibition par rétrocontrôle et que ce type de régvilation existe sans doute pour les entrées spéci­

fiques de la L-méthionine, la glycine, la L-sérine,la L-thréo- nine.

La régulation spécifique par inhibition par rétrocontrôle

existe vraisemblablement aussi chez Pénicillium chrysogenum

(Benke tt aiti 19^71 Huntar tt Ssf@l| 1973)» at chez Neurospo- ra eraisa (Wiley ©t Matehatti 19661 Pall, 1971| Pall ©t Kelly, I97I1 Marzluf, 197^) et Aspegillus nidulans (Pateman et al., 1974).

Dans tous les eas, le métabolite (ou un de ses dé­

rivés) intraeellulaire inhiberait sa propre entrée spécifi­

quement .

2) RIGULATION DE SYNTHESE.

La régulation des systèmes de transport au niveau de leur synthèse a été étudiée le plus à fond chez E.coli pour l'entrée des ^galactosides (Beckvrith et Zipner, 1970).

Comme nous l'avons vu, la synthèse du transporteur des gai- aotosides, la protéine M, est induite par les substrats du système. Cette induction correspond en fait à celle de l'ex­

pression des trois gènes z, y et a de l'opéron lac codant respectivement la galaetosidase, la galactose perméase et la galactoside acétylaseï la perméase possède une régulation commune avec le premier enzyme d'utilisation des galactosides.

L'opéron lac est soumis en plus à une répression, même en présence de l'inducteur, lorsque le milieu contient une substance capable de fournir plus rapidement que les ga­

lactosides les mêmes catabolites ( le glucose par exemple).

Le rôle évident de cette régulation a conduit à la qualifier de "catabolique" (Neidhardt et Nagasanik, 1956} The Lactose operon, 1970).

D'autres systèmes de transport sont soumis à cette double régulation (induction-répression catabolique)1 celui du galactose chez E.coli (Vu, I967)» du citrate chezB.subtilis

(Villecke et Pardee, I971), de la proline chez P.aerugina (Kay et Gronlund, 1969)» et du medate chez Streptococcus par exemple (London et Meyer, 1970)•

Ce type de régulation parait très économique puisqu'il provo­

que l'apparition d'un système de transport uniquement lorsque

le substrat correspondant est présent dans le milieu et

qu’il n'y a pas d'autre métabolite énergétiquement plus favorable.

D'autre part, certains systèmes de transport parais­

sent réprimés par leur propre substrat ou un dérivé: le système de transport à protéine liante périplasmique de la leucine chez E. coli en est un exemple (voir plus haut).

Ce type de régulation correspond classiquement à l'avantage que peut avoir la cellule à ne pas synthétiser les éléments d’une chaîne anabolique en présence du produit final.

Chez la levure en particulier, on a montré qu“il pourrait exister une régulation de la synthèse d'un élément au moins du système de transport spécifique des acides aminés dicarboxyliques actif dans la souche sauvage RV 20 en crois­

sance en présence d'ammoniijm comme seiale source d'azote:

une répression semble s'installer lorsqu'on ajoute du L-glu- teunate, de la L-lysine ou de la L-arginine au milieu. Cette régulation n'existe pas cependant dans la souche sauvage S1278b (Joiris et Grenson,

1969

)•

CELLULE.

Le L-glutamate et la L-glutamine possèdent un rôle central dans le métabolisme azoté: le L-glutamate constitue le premier intermédiaire dans l'assimilation de l'azote sous forme organique:

otcétoglutarate + NH^ - » L-glutamate

Cette synthèse de L-glutamate peut être catalysée par diffé­

rents enzymes:

a) l'amination réductrice de 1'(xcétoglutarate catalysée par la glutamate déshydrogénase anabolique (NADP dépendante et pour les bactéries aussi NAD dépendante), la GDHase A, a longtemps été considérée comme la seule voie de biosynthèse du L-glutamate:

okcétoglutarate + NH^ + NADPH---L-glutamate + NADP^

b) une autre voie de biosynthèse du L-glutamate a par la suite été découverte chez un grand nombre de bactéries, certaines d'ailleurs ne possédant pas de GDHase A (Meers et Tempest, 1970; Meers, 1970; Tempest et al., 1970 et 1973;

Elmerich, 1972; Nagatani et al», 1971; Miller et Stadtman, 1972):

L-glu + ATP + NhJ ---L-gluNHg + ADP + P^

©(.cétoglutarate + L-gluNH^ + NADPH---► 2 L-glu + NADP^

occétoglutarate + NH^ + ATP + NADPH—►L-glu + ADP NADP^

La glutamine synthétase catalyse la première réaction (l), la glutamate synthase la seconde (

2

).

La fonction de cette voie biosynthétique chez les procaryotes serait de produire du L-glu quand la quantité de NH^ disponible est limitante et que la GDHase A n'est plus

inconnue chez les eucaryotes. Sa présence chez différentes espèces de levures a cependant été rapportée: chez Schizosac- charomyces pombe (Brown et al., 1973) et chez Saccharomyces cerevisiae (Rom et al., 197^)* Le rôle physiologique joué par l'enzyme chez les champignons n'a pas encore été rééllement étudié; il semble toutefois que chez ces microorganismes la GDHase A constitue l'enzyme principal de synthèse du L-gluta- mate: la perte par mutation de son activité provoque, chez S. cerevisiae sur milieu minimum ammonium, une diminution

significative de la vitesse de croissance (Dubois et al., 1973).

La condensation de l'ammonium et du L-glutamate,

catalysée par la glutamine synthétase, assure avec la formation de la glutamine la seconde étape de l'incorporation de l'ammo­

nium sous forme organique.

Le L-glutamate qui constitue la réserve d'azote oCaminé pour les réactions de transamination, est aussi au point de départ des voies de biosynthèse d'acides aminés pour lesquels il fournit en plus le squelette carboné, comme la L-arginine, la L-lysine et la L-proline par exemple. La L-glutamine inter­

vient plus particulièrement dans la synthèse des purines, des pyrimidines, des hexosamines et de certains acides aminés

comme la L-histidine et le L-tryptophane. Le L-glutamate et la L-glutamine constituent, on le voit, la source exclusive de

tous les autres composés azotés.

Ce rôle central, évident lorsque la source d”azote fournie est constituée par l'ammonium lui-même, reste fonda­

mental quand la source est différente. On sait depuis longtemps que l'assimilation de n'importe quel métabolite azoté, et

des acides aminés en particulier, implique soit leur dégradation avec libération d'ammonium qui est ensuite incorporé sous

forme organique grâce à la synthèse de L-glutamate et de

L-gluteimine, soit la formation de L-glutamate le plus souvent grâce à des réactions de transamination.

2) LE TRANSPORT DU L-GLUTAMATE CHEZ LA LEVURE.

Au commencement de ce travail, on savait que chez la levure, souche sauvage 21278b, en croissance sur milieu minimum ammonium, le L-glutamate pénètre dans la cellule par un système de transport qu*il partage au moins avec le L-aspajr- tate et l'aaminoadipate (Joiris et Grenson, I

969

).

En outre, en absence d'ammonium, lorsque la source d'azote est constituée par de la L-proline parexemple, le L-glutamate possède de l'affinité pour le site de reconnais­

sance de la perméase générale des acides aminés: il inhibe compétitivement l'entrée d'acides aminés par ce système de

transport (Grenson et al., 1970). Cependant, il n'avait pas été établi si la perméase générale des acides aminés (GAP) transporte effectivement les acides aminés dicarboxyliques dans ces con­

ditions. En effet, l'augmentation de l'activité de transport des acides aminés sur milieu minimum proline par rapport à celle mesurée sur milieu minimum ammonium due à la mise en route de la GAP, disparait dans la souche 2512c ,chez qui l'activité de la GAP a disparu (mutant gap) ; le gluteimate

cependant fait exception, puisque sa vitesse initiale d'entrée chez 2512c reste plus grande en absence qu'en présence d'ammo­

nium, comme chez le sauvage.

3) LA REGULATION CATABOLIQUE AZOTEE CHEZ S. CEREVISIAE.

L'ammonium provoque, chez S. cerevisiae, la répression de plusieurs enzymes cataboliques: l'arginase, 1'uréoamidolyase , 1°allanteïnase et la glutamate déshydrogénase catabolique

(NAD dépendante)(GDHase C), ainsi que l'inhibition de plusieurs perméases: de 1'uréidosuccinate, de la proline, la GAP (Dubois et al-.,1973; Grenson et Hou, 1972; Grenson et Casteleyn: résul­

tats non publiés). De plus, la vitesse initiale d'entrée du L-glu est, elle aussi, plus grande enabsence qu'en présence d' ammoniiam.

La répression de l'arginase, de 1'allantoxnase, de 1 * uréoamidolyase et l'inhibition de la GAP par 1 * anunonium dis­

paraissent en présence de la mutation gdh A localisée dans le gène de structure de la GDHase A (Dubois et al.., 1973)*

L'activité catalytique de l'enzyme n'est pas impliquée dans la régulation des trois enzymes et la GDHase A est suposée avoir un rôle de protéine régulatrice dans la répression cata­

bolique azotée.(Dubois et al., 197^)» Cette répression appa- rait lorsque la GDHase A est sous une forme catalytiquement active, ce qui nécessite la présence simultanée de deux de ses substrats: le NH^ et l'otcétoglutarate „ La synthèse de la GDHase A ne semble être sous le contrôle d'aucune régulation importante chez S. cerevisiae.

Un autre élément est nécessaire à l'installation de la répression par l'ammonium non seulement de l'arginase, de 1'allanteïnase, de 1'uréoamidolyase mais aussi de la gluta­

mate déshydrogénase catabolique (GDHase C): le gène de régula­

tion gdh CR. Cette repression disparait en effet en pré­

sence de la mutation gdh CR, totalement récessive.

4) BUT DU TRAVAIL.

Chez la souche sauvage 21278b, seul le système de transport du L-glutamate actif sur milieu minimum ammonium a été partiellement décrit. Etant donné le rôle central du L-glutamate dans le métabolisme azoté, ainsi que l'importance

jouée par la GDHase A, l’enzyme qui catalyse sa biosynthèse, dans la régxilation de ce métabolisme, nous nous sommes fixés comme buts d'identifier les différentes voies d'entrée du L-glutamate dans les cellules dans les différentes conditions de croissance et d'en étudier la régulation.

Le fait que le L-glutamate possède une vitesse ini­

tiale d’entrée plus grande en absence qu’en présence d°cunmonium (Grenson et al», 1970), nous indique qu’il peut y avoir une régulation de son entrée, sans doute en fonction de la source d'azote fournie aux cellules. Il faudra définir la nature de la/des régulations et l’identité du/des système(s) de transport

sur le/lesquel(s) elle(s) s“exerce(nt).

On pourrait interpréter la participation de la GDHase A en tant qu'élément de régulation du métabolisme azoté en fonction du rôle central joué par le L-glutamate dans ce métabolisme: la GDHase A sous sa forme cateilytique- ment active peut être considérée comme le signal le plus direct de l'existance d'une capacité de synthèse du L-glu­

tamate importante; la répression par l'ammonium des enzy­

mes soumis à la régulation qui fait intervenir directement la GDHase A , l'arginase, 1 'uréocunidolyase et l'allantox- nase, correspondrait à l'avantage qu'aurait la cellule à ne pas dégrader ses composés azotés lorsqu'elle est en train de synthétiser leur précurseur à partir du NH^ et de 1'dcétoglutarate: le L-glutamate.

Mais l'activité du/des système(s) de transport du L-glutamate fournissent une autre source de glutamate à la

cellule. On le voit, il sera important de regarder si la régulation de ce(s) système(s) participe à la régulation catabolique azotée plus générale. Il faudra regarder si la mutation gdh A , qui suprime la répression catabolique azotée de trois enzymes, a un effet sur celle du transport du

L-glutamate.

Dans le même ordre d'idée, puisque la mutation gdh CR suprime elle aussi, et plus largement encore, la répression par l'ammonium d'enzymes cataboliques, nous

regarderons si l'intégrité du gène gdhCR est aussi nécessaire dans la régulation du transport du L-glutamate.

MATERIEL ET METHODES.

1. SOUCHES.

Les souches de Saccharomyces cerevisiae utilisées sont haploïdes et isogènes de la souche sauvage 21278b.

Elles sont originaires du laboratoire»

Souche. Génotype. Références »

21278b sauvage ( <^ ) ^-

2512c gap (

0

^ ) ! mutant chez qui la perméase généreile des acides aminés est inactive.

Grenson M, Hou C et Crabeel M, 1970.

4324d gdhA ( ) : mutant défi­

cient en glutamate déshy- drogénase anabolique

(NADP dépendante).La mutation affecte le gène de structure de l'enzyme»

Grenson M et Hou C, 1972;

Grenson M et al . 1974.

FMI 71 ( (X ) : mutant qui a perdu l'activité de la perméase spécifique de l'uréidosuc- cinate.

FMI 72 f»

-

FM173 ^{II -}

FMI 74 ^II -

FMI 75 ^II

2. MILIEUX.

Milieux liquides :

le milieu

150

, milieu minéral de base, a été décrit antérieu­

rement (Grenson et al o,

1966

). Il est composé de tampon citra­

te à pH 6,1, et de sels minéraux. On y ajoute du glucose y^o et des vitamines (biotine, thiamine, mésoinositol, Ca-pantho- ténate et pyridoxine) ainsi qu'une source d'azote constituée soit de NH^ 0,02 M (sous forme de (NH

2

^)

2

SOji^ ) ,

soit d'un acide aminé à une concentration de Img/ml,

soit d'une combinaison de plusieurs de ces substances azotées aux mêmes concentrations.

Ce milieu minimum sera désigné par la lettre M suivie du nom des constituants de la source d'azote»

Milieux solides :

ces milieux contiennent

2

^ de gélose.

868

: milieu complexe contenant du glucose

2

'^, bactopeptonel'^

et extrait de levure (Oifco)

1

^»

Les autres milieux gélosés utilisés sont identiques aux milieux liquides.

Les souches sont conservées sur

868

et au frigo.

3

. CONDITIONS DE CROISSANCE.

Les cultures en milieu liquide sont réalisées à 29° sous agi­

tation.

La dégradation du glucose se fait principalement par fermen­

tation bien que les conditions de culture soient aérobies. La respiration est en effet inhibée en présence de la forte con­

centration de glucose utilisée (contre-effet Pasteur) (DeDeken,

1966

)»

La croissance est suivie par lecture de densité optique (DO.) à 660m^ au spectrophotomètre Beckman c. Des cellules en phase

exponentielle de croissance ont été utilisées dans toutes les