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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Gits, J. (1971). Systèmes perméasiques de la méthionine, de la thréonine, de l'isoleucine, de la valine et de la leucine, chez Saccharomyces cerevisiae : mise en évidence, étude des propriétés et de la régulation (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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Service de Microbiologie

SYSTEMES PERMEASIQÜES DE LA METHIONINE,

DE LA THREONINE, DE L’ISOLEÜCINE, DE LA

VALINE ET DE LA LEÜCINE, CHEZ SACCHAROMYCES

CEREYISIAE : MISE EN EYIDENCE, ETUDE DES

PROPRIETES ET DE LA REGULATION.

l

MEMOIRE PRESENTE POUR L'OBTENTION DU GRADE LEGAL DE DOCTEUR EN SCIENCES ZOOLOGIQUES

JACQUELINE GITS

1971

Service de Microbiologie

SYSTEMES PERMEASIQUES DE LA METHIONINE,

DE LA THREONINE, DE LTSOLEUCINE, DE LA

VALINE ET DE LA LEÜCINE, CHEZ SACCHAROMYCES

CEREVISIAE : MISE EN EYIDENCE, ETUDE DES

PROPRIETES ET DE LA REGULATION.

MEMOIRE PRESENTE POUR L'OBTENTION DU GRADE LEGAL DE DOCTEUR EN SCIENCES ZOOLOGIQUES

JACQUELINE GITS

exprimer ma reconnaissance,ainsi qu'à Monsieur Wiame,pour l'aide qu'ils m'ont apportée.

Je voudrais également remercier tous les membres du labo­ ratoire,et particulièrement A.Piérard, C.Joiris, G.Hou, F.Hilger et J.Béchet pour leur contribution à ce travail et pour les fruc­ tueuses discussions que j'ai eues avec eux.

Mes remerciements vont également à F.Verhaegen-Muyldermans et J-P. Ten Hâve pour leur aide technique efficace et aimable.

I. AVANT-PROPOS , BUT ET PLAN DU TRAVAIL .

II. EVOLUTION DE L'ETUDE DES PHENOMENES DE PERMEABILITE MEMBRANAIRE ET DES PRINCIPAUX MODELES DE SYSTEMES DE TRANSPORT .

1. Premières mises en évidence de phénomènes de perméabilité sélective.

2. La perméase des /3-galactosides.

3. Perfectionnement du modèle perméasique : introduction de la notion de transporteur. 4. Couplage des systèmes de transport à des

sources d'énergie.

5. Choix d'un modèle pouvant servir d'hypo­ thèse de travail.

III. PROBLEMES PARTICULIERS LIES A L'ETUDE DES SYSTEMES DE TRANSPORT .

1. Problèmes liés à la caractérisation des systèmes "in vivo".

2. Isolement et purification de molécules faisant partie de systèmes perméasiques. 3. Etude du transport des métabolites au tra­

I. AVANT-PROPOS , BUT ET PLAN DU TRAVAIL .

L'un des éléments essentiels qui concourent à faire d'une cellule vivante une unité physiologique distincte du milieu où elle est placée est l'existence d'une barrière qui enveloppe ses consti­ tuants, qui empêche la diffusion des métabolites qui lui sont indis­ pensables vers l'extérieur et qui freine la pénétration de certai­ nes substances dans son milieu interne.

Ces propriétés sont réalisées par la membrane cytoplasmique et sou­ lignent l'importance d'une de ses caractéristiques fondamentales : son imperméabilité.

Il est toutefois évident que la membrane doit également présenter des propriétés de perméabilité pour permettre les échan­ ges indispensables entre la cellule et le milieu environnant: le prélèvement des molécules nécessaires au fonctionnement du méta­ bolisme cellulaire et l'élimination de déchets ou de solutés pré­

sents en excès dans la cellule.

Un second aspect essentiel du rôle de la membrane apparaît donc dans la sélectivité des échanges qu'elle réalise entre les milieux extracellulaire et intracellulaire.

Cette conception de la nature et de l'importance de la membrane cytoplasmique ou même la nécessité de son existence n'ont pas toujours été admises; pendant longtemps on a considéré que la cellule était limitée par un film de cytoplasme riche en lipides dont la tension superficielle assurait la cohésion de la cellule et dont les propriétés physico-chimiques permettaient la diffusion de molécules à l'intérieur de la cellule (voir revue par Wilbrandt et Rosenberg,1961).

Or les interférences entre les phénomènes membranaires et les ré­ actions du métabolisme intracellulaire peuvent jouer un rôle essen­ tiel dans la compréhension de certains mécanismes analysés"in vivo". Citons par exemple le cas,rappelé par Cohen et Monod (1957)^06 la mise en évidence des différentes étapes du cycle de Krebs et des désaccords entre l'étude du métabolisme des cellules intactes et celle des activités enzymatiques des extraits cellulaires ;pendant longtemps,de nombreux auteurs n'ont pas cru à l'existence complète du cycle de Krebs parce que divers microorganismes comme E.coli et la levure ne métabolisaient pas certains intermédiaires de ce cy­ cle (le citrate par exemple). Il a été démontré plus tard que ces cellules étaient imperméables à ces intermédiaires alors que chez Pseudomonas,par exemple,on a trouvé un système de perméation induc­ tible pour ceux-ci,permettant ainsi le fonctionnement complet du cycle,"in vivo".

La mise en évidence du rôle des membranes cellulaires dans le prélèvement actif et spécifique de diverses substances a été ré­ alisée depuis plus de vingt ans,principalement par l'étude de l'ab­ sorption intestinale,puis par celle de divers tissus de mammifères, le cortex rénal,les cellules nerveuses,les muscles et les érythro­ cytes (voir revues par Crâne,I960; Keynes,1960; Wilson,1962; Benson et Rampone,1966).

peut réaliser des analyses génétiques qui fournissent un apport précieux à cette étude.

Les notions,devenues classiques,de "perméase" puis de "système perméasique" (comprenant en plus un "transporteur"),qui ont été définies par l'étude de l'entrée des galactosides dans les, cellules d'E.coli,n*ont toutefois pas été admises par tous les au­ teurs et d'autres modèles de systèmes de transport ont été propo­ sés. En particulier,!'existence de perméases chez des organismes plus évolués que les bactéries est contestée par de nombreux au­ teurs (voir plus loin).

11 nous a donc semblé intéressant d'étudier des phénomè­ nes de perméabilité cellulaire chez un organisme non bactérien. Le choix d'un Protoascomycète comme Saccharomyces cerevisiae se justifie par sa qualité d'eucaryote,ce qui permet de le rapprocher des organismes supérieurs,et par son caractère d'unicellulaire,ce qui lui laisse tous les avantages des bactéries,au point de vue expérimental (conditions de culture,mesures d'accumulation de mé­ tabolites dans les cellules,obtention de mutants et analyse géné­ tique) .

Quand nous avons commencé ce travail,quelques perméases d'acides aminés avaient déjà été décrites chez la levure et chez Neurospora,mais la spécificité de ces systèmes,propriété essen­ tielle des perméases,comme elles ont été définies initialement, était mise en doute dans plusieurs travaux.(voir introduction du chapitre I.)

Nous nous sommes attachés-à l'étude du mécanisme responsable de la pénétration de quelques acides amines dans la cellule de Sac­ charomyces cerevisiae.

Ce travail a été mené en parallèle avec celui de Joiris,sur le transport des acides aminés dicarboxyliques (voir Joiris et Gren-

son,1969 et Joiris,1970).

de transport de la méthionine,acide aminé qui pénètre rapidement dans les cellules et dont il existe des analogues structuraux to­ xiques pour la levure.

L'utilisation de ces analogues pouvait permettre la sélection de mutants résistant grâce à une altération de leur système de trans­ port, suivant la méthode de Schwartz,Maas et Simon (1959)*

L'observation d'interférences entre la méthionine et les autres a- cides aminés à méthyles distaux (voir introduction du chapitrel) nous a amenés à étudier également les systèmes de transport de ces acides aminés et leurs relations avec le système de transport de la méthionine.

La première partie de ce travail est consacrée à la mise en évidence de plusieurs systèmes de transport des acides aminés à méthyles distaux et de la spécialisation de leur fonction. La spéci­ ficité de ces systèmes a été déterminée par l'étude d'éventuelles compétitions entre acides aminés et par l'analyse de mutants.

Cet ensemble d'observations nous a amenés à envisager l'existence de deux étapes successives participant au transport de ces acides aminés.

Des tests préliminaires nous ayant amenés à observer des variations des vitesses d'entrée des acides aminés (augmentation ou diminution) selon les conditions de culture,nous avons envisa­ gé l'existence de mécanismes contrôlant l'activité perméasique. La seconde partie de ce travail est consacrée à l'étude de la ré­ gulation de l'activité et de la régulation de la synthèse des sys­ tèmes de transport des acides aminés à méthyles distaux.

II. EVOLUTION DE L'ETUDE DES PHENOMENES DE PERMEABILITE MEM­ BRANAIRE ET DES PRINCIPAUX MODELES DE SYSTEMES DE TRANSPORT.

1. PREMIERES MISES EN EVIDENCE DE PHENOMENES DE

PERMEABILITE SELECTIVE.

Deux types d'observations,réalisées sur des microorga­ nismes, ont suggéré que la membrane cellulaire était fondamenta­ lement imperméable à la plupart des molécules et que l'entrée de diverses substances dans les cellules était due à des mécanismes de perméation sélective: d'abord la capacité des cellules d'accu­ muler certains métabolites et ensuite l'état de "crypticité" de certaines cellules vis-à-vis d'un métabolite (c'est-à-dire leur incapacité de l'utiliser tout en possédant le système enzymatique nécessaire à sa dégradation).

— Plusieurs auteurs avaient observé,chez E.coli et chez la levure, des mutants incapables de croître en présence d'une source de car­ bone (lactose; Deere,Dulaney et Michelson,1939; maltose,cellobiose ou sucrose; Leibowitz et Hestrim,19^5) alors que les cellules pos­ sédaient tous les enzymes nécessaires au catabolisme de ce substrat. L'interprétation de ces phénomènes de "crypticité" a été fournie par Doudoroff à la suite de l'étude d'un mutant d'E.coli,incapable de croître sur glucose comme seule source de carbone alors qu'il peut utiliser son dimère,le maltose,et possède donc tous les enzy­ mes nécessaires à l'utilisation du glucose (Doudoroff,Hassid,Putnam, Potter et Lederberg,19^9)• Doudoroff (195^) suppose que la cellule

est devenue imperméable au glucose; cette imperméabilité étant limi­ tée à ce seul sucre,elle doit donc résulter de la perte d'un système de perméation stéréospécifique pour le glucose.

Un autre cas de "crypticité" vis-à-vis du fructose a encore été dé­ crit par Doudoroff,Palleroni,Mac Gee et Ohara (1956),chez Pseudomo- nas,et des phénomènes semblables ont été observés dans des mutants de Lactobacillus,auxotrophes pour un acide aminé,qui peuvent utili­ ser des peptides contenant l'acide aminé exigé mais pas l'acide ami­ né lui-même (Kihara et Snell,1953; Peeters,Prescott et Snell,1953; Prescott,Peeters et Snell,1953).

A côté de ces travaux réalisés sur des microorganismes, plusieurs auteurs ont simultanément observé des phénomènes de trans­ port dans différents tissus de mammifères,dans les érythrocytes et dans les cellules d'ascites (tumeur d'Ehrlich).

sorbés par un mécanisme actif et que celui-ci peut être inhibé par divers poisons.

— Plusieurs travaux ont mis en évidence l'accumulation d'acides a- minés (Christensfm,Stceicher et Elbinger,19^8; Christensen,Cushing et Streicher,19^9; Christensen,Riggs,Pischer et Palatine,1952; Christensen,Riggs et Ray,1952; Christensen et Riggs,1952; Riggs, Coyne et Christensen,195^) et d'amines (Conway,0'Brien et Doyle, 1941 ; Christensen et al.,1952g^) dans différents tissus; cette accu­ mulation dépend d'une source d'énergie métabolique (Christensen et al.,1952i^) et la concentration d'acide aminé réalisée dans les cel­ lules est suffisante pour y développer une importante pression os­ motique et y provoquer une entrée d'eau (Christensen,1955)•

— Heinz (195^) a mesuré la pénétration de glycine radioactive dans les cellules d'Ehrlich et a conclu que cette pénétration n'est pas due à une simple diffusion mais à la liaison de la glycine sur un constituant membranaire servant de transporteur.

— La notion de transport actif est également précisée par Conway (195^) et; par Rosenberg (195^) qui l'opposent au phénomène de dif­ fusion: seul le transport actif permet à la cellule de concentrer des molécules ("uphill transport") et ce phénomène nécessite des échanges énergétiques avec un autre système.

2. LA PERMEÀSE DES /o-GALACTOGIDES.

L'étude du mécanisme de l'induction de la fi-galactosidase d'E.coli,l'observation de l'aspect autocatalytique de cette induc­ tion et de l'absence de ce caractère autocatalytique dans des cel­ lules préinduites,ont amené Cohen et Rickenberg (1955) et Monod

(1956) à suggérer l'existence d'un "système y",enzymatique,égale­ ment inductible et responsable du prélèvement et de la concentra­ tion dans les cellules de l'inducteur de la (î>-galactosidase.

Ce "système y" a reçu le nom de perméase (Rickenberg,Cohen, Buttin et Monod,1956) et sa nature et son rôle ont été précisés par de nombreux travaux (Képès et Monod,1957; revue par Cohen et Monod, 1957; Képès et Cohen,1962).

Il faut remarquer que l'étude de cette perméase a été facilitée par l'emploi des thiogalactosides qui ne sont pas métabolisés par la cellule,ce qui permet d'étudier uniquement le phénomène de trans­ port , indépendamment de toute réaction intracellulaire ultérieure. — Le système est rigoureusement spécifique vis-à-vis des [à-galac- tosides.

— Dans des cellules induites,les galactosides sont accumulés jus­ qu'à une concentration ^00 fois supérieure à la concentration du milieu externe et ils peuvent représenter jusqu'à 20% du poids sec des cellules; ceci rend très peu vraisemblable l'hypothèse de leur fixation sur des récepteurs macromoléculaires; de plus cette hypo­ thèse est infirmée par l'aspect cinétique du phénomène d'accumula­ tion.

D'autre part le travail de Sistrôm (195S) montre que le lactose se retrouve,dans des protoplastes préinduits,à l'état libre et doué de pouvoir osmotique (c'est-à-dire capable de provoquer la lyse des cellules); la rétention du substrat dans la cellule ne peut donc être due à sa fixation sur un récepteur.

que le galactoside n'a pas subi de modification chimique à la sui­ te de son transport; le système de perméation semble donc spécia­ lisé dans sa fonction.

De plus la démonstration de l'indépendance fonctionnelle et géné­ tique de la perméase et de la (3-galactosidase a été apportée par la comparaison des cinétiques d'accumulation et d'hydrolyse "in vi­ vo" du lactose,dans des mutants galactosidase” et dans des mutants

"cryptiques",c'est-à-dire perméase” (Herzenberg,1959)•

— Le caractère inductible de la perméase a favorisé sa caractérisa­ tion; seuls les |5-galactosides peuvent servir d'inducteurs; l'in­ duction ne se produit que dans des conditions où la synthèse pro­ téique est possible et le taux différentiel de synthèse du systè­ me montre que cette induction correspond à une synthèse "de novo" de protéines (Monod,Pappenheimer et Cohen-Bazire,1952; Hogness,Cohn et Monod,1955; Rickenberg et al.,1956)»

— En conclusion,une protéine inductible,présentant les propriétés (cinétiques et de spécificité) d'un enzyme,est responsable de l'en­ trée et de l'accumulation des ô-galactosides dans la cellule; elle est spécialisée dans sa fonction et distincte des enzymes métabo­ liques .

Cohen et Monod (1957) font toutefois remarquer que le système de transport complet peut,en outre,comprendre des éléments non induc­ tibles et moins spécifiques (ce qui sera confirmé par Képès: voir plus loin); le terme de perméase doit être utilisé uniquement pour la protéine spécifique et inductible; l'ensemble du système peut être qualifié de système perméasique.

Le rôle et l'importance de la perméase sont soulignés par les mutants "cryptiques" où la faible quantité de lactose qui pénè­ tre ne permet pas la croissance des cellules; cette observation souligne le fait que la membrane cellulaire est pratiquement imper­ méable au lactose,sauf au niveau de la perméase.

poi-sons comme NaN^ et le dinitrophénol (Cohen et Rickenberg,1955; Ric- kenberg et al.,1956); d'autre part le fonctionnement du système d'accumulation provoque une légère augmentation d'activité respira­ toire (la pénétration d'oxygène mesurée suggère la consommation d'u­ ne mole d'ATP par mole de galactoside prélevé:

Képès,1957)-L'accumulation des galactosides dans les cellules n'augmen­ te pas indéfiniment; au cours du temps,un plateau stable est atteint au moment où l'entrée est compensée par une sortie du substrat pré­ accumulé. La nature du mécanisme assurant cette sortie n'est pas é- voquée dans ces travaux; une étude approfondie de ce problème per­ mettra à Képès et à Koch de développer le modèle perméasique (voir plus bas).

l'existence d'une perméase assurant spécifiquement le pré­ lèvement des (^-galactosides impliquait l'existence d'autres systè­ mes semblables et aussi spécifiques pour les autres sucres permet­ tant la croissance d'E.coli.

Quelques travaux (voir revue par Cohen et Monod,1957) ont permis de caractériser plusieurs systèmes présentant les mêmes proprié­ tés que la galactoside-perméase pour divers sucres et intermédi­ aires du cycle de Krebs,et une perméase constitutive pour le glu­ cose (dans ce cas,seules ses propriétés cinétiques et sa spécifi­ cité permettent de la caractériser).

Simultanément l'étude de l'accumulation des acides aminés dans les bactéries a été approfondie.

Cette interprétation a été confirmée par des mesures de pénétra­ tion d'acides aminés radioactifs dans les cellules et par la mise en évidence d'inhibitions compétitives entre acides aminés de structure très proche (Cohen et Rickenberg,1955; Britten,Roberts et French,1955; Cohen,1956).

Les systèmes responsables de l'accumulation des acides aminés chez les bactéries présentent les mêmes propriétés que les perméases ca­ ractérisées pour les sucres mais ils sont constitutifs.

Leur grande spécificité est soulignée par l'existence de mutants ayant perdu l'une de ces perméases tout en présentant une pénétra­ tion inchangée de tous les autres acides aminés (Schwartz et al., ^959; Kessel et Lubin,1962).

3. PERFECTIONNEMENT DU MODELE PERMEA.SIQUE :

INTRODUCTION DE IA NOTION DE TRANSPORTEUR.

Une étude cinétique approfondie du transport des /3-galac- tosides et,en particulier,de la sortie du substrat préaccumulé,ont permis à Képès,puis à Koch,de préciser et développer le modèle perméasique initial.

Képès (I960) a réalisé une étude cinétique du système de transport des galactosides,chez E.coli,et s'est surtout attaché aux propriétés des cellules dans lesquelles l'accumulation a at­ teint son plateau stable. Les mesures des vitesses d'entrée,de re­ nouvellement et de sortie des galactosides,dans différentes con­ ditions (en présence de divers inhibiteurs et compétiteurs),mon­ trent des variations indépendantes des processus d'entrée et de sortie et montrent que la sortie ne peut être due à une simple diffusion (comme cela avait été supposé dans le modèle perméasique initial).

Espace extracellulaire

+ T ^ GT

Espace intracellulaire

ses résultats (voir figure ci-contre) et qui fait intervenir un élément nouveau dans le système perméasique: le transporteur. Dans ce modèle,? représente la perméase,définie comme un enzyme présentant un site catalytique accessible au substrat externe (G ) et qui active celui-ci en le combinant à une molécule de transpor­ teur (T ou sa forme riche en énergie RA>T); les caractéristiques physicochimiques de T ou GT lui permettent le passage de la bar­ rière de perméabilité; GT peut se dissocier spontanément du côté intérieur de la membrane,sans l'intervention d'un second enzyme; le complexe GT est dissociable des deux côtés de la membrane et T est donc responsable de la sortie passive des galactosides accumu­ lés,en fonction de leur gradient de concentration (cette sortie est donc due à un mécanisme de "diffusion facilitée"); ce transpor­ teur est beaucoup moins spécifique que la perméase et peut partici­ per au transport de plusieurs sucres,ce qui expliquerait comment le glucose provoque un efflux de galactoside préaccumulé (ce qui est particulièrement frappant dans les cellules "cryptiques",c'est-à- dire dépourvues de perméase pour les galactosides).

Ce modèle de système de transport comprenant une perméase et un facteur mobile a été précisé par Koch (1964),à la suite d'une étude plus détaillée des phénomènes de sortie des galactosides et de l'action de divers agents,soit sur 1'entrée,soit sur la sortie.

Ce travail met en évidence la nécessité d'un couplage du transport avec une source d'énergie,du côté interne de la membrane (et non du côté externe,comme dans le modèle de Képès,ce qui posait un problème de transport du métabolite riche en énergie),couplage qui "tire" sur l'ensemble du mécanisme et qui est indispensable à l'accumulation du substrat contre un gradient de concentration.

G = sucre (galactosides ou glucose ou peut-être d'autres), P = perméase,en position fixe; plusieurs P peuvent réagir

avec le même T,

Dans son modèle (voir figure ci-contre),Koch présente d'une part le mécanisme complet (quatrième cas),c'est-à-dire quand le système accomplit un travail thermodynamique (entrée et accumulation contre un gradient de concentration) et d'autre part

(trois premiers cas) des éléments du système pouvant fonctionner seuls,dans certaines conditions,ce qui permet de les caractériser (par exemple dans des mutants "cryptiques": 1 et 3 , ou en présen­ ce de poisons énergétiques: 2).

En résumé,le système comprend trois étapes:

— du côté externe de la membrane,une étape de liaison,qui donne sa spécificité au mécanisme et qui est réalisée par les perméases (P) ; — au travers de la barrière de perméabilité,un élément mobile,le

transporteur (T),dont la nature chimique n'est pas précisée,qui est accessible à plusieurs perméases de spécificités différentes et qui peut libérer le substrat du côté interne ou du côté externe de la membrane; ce transporteur est donc responsable de l'influx et de l'efflux du substrat;

— du côté interne de la membrane,un mécanisme qui couple le trans­ port au métabolisme énergétique et qui,en rendant la dissociation du complexe GT plus probable du côté interne de la membrane que du côté externe,"tire" sur l'ensemble du système et permet l'accumu­ lation du substrat.

Koch fait remarquer que son modèle est applicable à de nombreux systèmes de transport déjà décrits mais que l'étape per- méase n'existe peut-être pas chez tous les organismes; le modèle

sous sa forme (5) où la perméase ne participe pas à la réaction, pourrait être étendu à tous les systèmes de transport assez peu spécifiques.

Milieu

extracellulaire

Milieu

intracellulaire

"exchanpi^e diffusion",terme introduit par Ussing (19^7) pour décrire 1'équilibration,molécule pour molécule,d* un substrat au travers d' une membrane,par un mécanisme comprenant sa liaison sur un trans­ porteur.

— De nombreux travaux décrivent ce phénomène,dans des cellules de mammifères,pour des systèmes de transport présentant généralement une spécificité assez large pour des groupes d'acides aminés ou de sucres; dans ces systèmes,on observe un phénomène d'"hetero-exchan- ge",c'est-à-dire qu'un substrat peut s'échanger avec un autre,de structure voisine (Rosenberg et Wilbrandt,1957; Heinz,1957; Heinz et Durbin,1957; Heinz et Mariani,1957; Heinz et Walsh,1958;

John-I I

stone et Scholefield,1959; Lacko,Burger,Hejmova et Rejnkova,1960; Jacquez,1961,1963 et 1967; Oxender et Christensen,1963; Christensen 1964; Christensen et Liang,1965; Christensen et Oxender,1965; Devi­ ne,Oxender et Stein,1965; Jacquez et Sherman,1965; Munck,1965 et 1966; Ring et Heinz,1966; Gillespie et Scholefield,1966; Gillespie, 1967). Pour expliquer ces phénomènes d'"exchange diffusion",Heinz et Walsh avaient déjà proposé,en 1958,un modèle de mécanisme com­ prenant un transporteur mobile,sous forme active (X),c'est-à-dire pouvant fixer le substrat (a),ou sous forme inactive (Y) ayant per­ du son affinité pour le substrat; cette forme Y peut être réacti­ vée par couplage avec une réaction fournissant de l'énergie.

Dans ce modèle,(voir figure ci-contre),les voies 1, 2 et 3 ,c'est- à-dire sans couplage énergétique,réalisent 1'"exchange diffusion", alors que le cycle complet (y compris les réactions 4 et 5 et le couplage énergétique) permet un transport actif de l'acide aminé dans la cellule.

D'autre part,plusieurs systèmes décrits comme perméases, bien que leur spécificité soit beaucoup moins rigoureuse que cel­ le des perméases bactériennes,pourraient également être considérés comme des transporteurs,dans le modèle de Koch: par exemple,le sys­ tème qui semble responsable de l'accumulation de tous les acides a- minés chez la levure (Halvorson et Cohen,1958; Surdin,Sly,Sire,Bor­ des et De Robichon-Szulmajster,1964 et 1965) et chez Neurospora

(Brockman,1964; Bauerle et Garner,1964; De Busk et De Busk,1965; Mathiesen et Catcheside,1965; Wiley et Matchett,1966).

De même,il est vraisemblable que,chez ces organismes,les mutations entraînant une imperméabilité générale aux acides aminés (Sorsoli, Spence et Parks,1964; Surdin et al.,1964 et 1965; Davis et Zimmer- man,1965; Kappy et Metzenberg,1967) aient provoqué la perte d'un transporteur commun à ces acides aminés.

La mise en évidence d'autres systèmes de transport peu spécifiques a amené certains auteurs à une interprétation sembla­ ble: on observe,par exemple,des compétitions entre sucres et aci­ des aminés dans les tubules rénaux (Thier,Box,Rosenberg et Segal, 1964) et dans la muqueuse intestinale (Newey et Smyth,1964; Saun- ders et Isselbacher,1965; Alvarado,1966; Bingham,Newey et Smyth, 1966; Poncovà et Kotyk,1967). Alvarado interprète ces observations par l'existence d'interférences au niveau d'un transporteur commun "polyfonctionnel",c'est-à-dire présentant des sites distincts pour les différentes classes de substrats qu'il peut fixer (sucres,aci­ des aminés et sodium).

(Un modèle de "transporteur polyvalent" avait déjà été proposé par Wong,1965,pour expliquer des effets de stimulation de l'entrée d'un acide aminé par un autre et par le sodium.)

Plusieurs auteurs ont fait une mise au point des diffé­ rents modes de transport des molécules au travers de la membrane et des modèles pouvant expliquer ce transport (revues par Cirillo, 1961; Képès,1964; Heinz,1967; Mitchell,1967; Stein,1967; Pardee, 1968; Roseman,1969; Ring,1970).

En particulier,ces travaux précisent les notions de "diffusion facilitée" (mécanisme comprenant la liaison réversible du substrat sur un facteur membranaire spécifique,qui rend le phénomène plus rapide qu'une simple diffusion,mais sans couplage avec une source d'énergie; c'est donc un transport passif,dans le sens du gradient de concentration) et de transport actif (mécanisme présentant les mêmes caractéristiques que la diffusion facilitée mais nécessitant un couplage avec une source d'énergie,ce qui permet une accumula­ tion du substrat contre un gradient de concentration).

Il faut signaler que Mitchell (1967) utilise une nomencla­ ture différente de celle des autres auteurs et qui est utilisée dans quelques travaux; il distingue deux types de translocations membranaires :

- celles qui sont effectuées par des enzymes et comprennent la for­ mation et la rupture de liens covalents avec le substrat;

- celles qui sont effectuées par des "translocateurs"et comprennent la formation de liens ioniques mais non covalents.

Ce second type de translocation permet trois sortes de transport: a- "non-coupled soluté translocation" ou "uniport" qui désigne la diffusion facilitée au sens où elle a été définie initialement par Danielli (195^),c'est-à-dire l'équilibration d'un seul substrat au travers de la barrière osmotique.

b- "sym-coupled soluté translocation" ou "symport" qui désigne la translocation d'un substrat couplée à celle d'une autre molécule, dans la même direction.

Crane,1962,1965 et 1968; Crâne,Forstner et Eicholz,1965 ; Caspary, Stevenson et Crâne,1969; Letarte et Renold,1969; Letarte,Jeanrenaud et Renold,1969).

c- "anti-coupled soluté translocation" ou "antiport" qui désigne la translocation d'un substrat couplée à celle d'une autre molécule, dans la direction opposée. Ce cas peut s'appliquer à l'"hetero- exchange diffusion".

Il faut remarquer que la nature du transporteur n'a été évoquée dans aucun des travaux cités jusqu'ici et qu'il apparaît seulement comme une molécule mobile,présentant un site de fixation spécifique pour un ou plusieurs substrats. Quelques travaux préci­ sent cependant la fonction de ce transporteur et sa nature chimique.

Rosenberg et Wilbrandt (1952) suggèrent que le transpor­ teur serait une forme de co-enzyme liposoluble,voyageant entre

deux molécules d'enzymes situées sur les deux faces de la membrane.

Mitchell (1960-|^) considère que la fonction principale du transporteur est de rendre le substrat hydrophobe pour lui permet­ tre le passage de la couche lipidique de la membrane et que cette réaction se réalise vraisemblablement par formation de liaisons hydrogène entre substrat et transporteur; il en résulte que la fi­ xation du substrat sur le transporteur augmente la mobilité de ce­ lui-ci au travers de la membrane.

Wilbrandt (I960) précise la nécessité de la mobilité du site de fixation du substrat (pour expliquer 1'"exchange diffusion") mais pas nécessairement du transporteur lui-même et il envisage

l'existence de macromolécules subissant un mouvement de rotation ou présentant des chaînes latérales mobiles.

Plusieurs auteurs suggèrent que des phospholipides jouent le rôle de transporteur (Gaby,Hadly et Kaminski,1957; Hokin et Ho- kin,1958 et 1959; Friedman et Gaby,1960; Barnabei et Ferrari,1961 ; Tria et Barnabei,1963 ; Tarlov et Kennedy,1965 ; Gerbon et Sharpless, 1966; Lembach et Charalampaus,1967); quelques travaux indiquent un

"turn-over" rapide du phosphatidylglycérol associé au transport d' acides aminés et de sucres,chez la levure (Gale et Folkes,1967; Dierkauf et Booij,1968).

Ces observations ne peuvent cependant pas être étendues à tous les systèmes de transport.

De plus,la liposolubilité du transporteur n'apparaît indispensable qu'en fonction de la conception classique de la nature de la bar­ rière osmotique des cellules (Mitchell et Moyle ,195"1 ) •

•Toutefois des études plus récentes de la structure de la membrane semblent indiquer qu'elle n'est pas constituée d'une couche de li­ pides intercalée entre deux couches de protéines mais qu'elle se présente comme une mosaïque de protéines et de lipides (Green et Perdue,1966; Wallach et Zahler,1966; Green,Allman,Bachmann,Baum, Kopaczyk,Kocman,Lipton,Mc Lennan,Mc Connell,Perdue,Ruske et Tzago- loff,1967; Stoeckenius,1967; Korn,1966 et 1968; Green,Hard,Lenaz et Silman,1968).

Vanderkooi et Green (1970) proposent un schéma de membrane compre­ nant deux couches juxtaposées de protéines globulaires; latérale­ ment ces molécules sont disposées lâchement et ménagent des inter­ stices occupés par des molécules lipidiques:

70 ±10 A

1IÎ

A

40 ±5 A

Wallach et Zahler (1966) suggèrent plutôt que les molécules de pro­ téines s'étendent sur toute l'épaisseur de la membrane et présen­ tent,aux deux extrémités,une région hydrophile,et,au centre,une ré­ gion hydrophobe située parmi les molécules de lipides.

Si les membranes présentent ce type de structure,plutôt qu'une couche continue de lipides,le transporteur ne doit pas né­ cessairement être une petite molécule liposoluble mais peut être une protéine.

Plusieurs auteurs considèrent par exemple que c'est la protéine possédant le site de reconnaissance pour le substrat externe qui assure sa translocation (revue par Stein,1967; Pardee,1968); celle- ci peut être assurée par une rotation de la molécule ou par un

changement conformationnel qui provoque un déplacement d'une partie ‘de la molécule ou qui ouvre un passage au travers de celle-ci.

(Cette dernière possibilité est suggérée par Wallach et Zahler qui imaginent la formation d'une sorte de tube intramoléculaire permet­ tant la traversée de la barrière de perméabilité,puisque,dans leur modèle,la protéine s'étend au travers de toute la membrane -voir plus haut-.)

Ce type d'hypothèse présente l'avantage de faire intervenir un très petit déplacement des molécules qui participent à la structure de la membrane cellulaire.

Pardee (1968) rappelle quelques résultats qui peuvent ap­ porter des arguments en faveur de ces interprétations:

— L'effet stimulateur de l'ATP sur le transport des (5-galactosides est le même,qu'il soit ajouté sur la face externe ou sur la face interne de la membrane (Fox,Carter et Kennedy,1967; Scarborough, Rumley et Kennedy,1968; Carter,Fox et Kennedy,1968).

— Les dimensions de la protéine participant au transport du sulfate, isolée par Pardee et al. (Pardee,Prestidge,Whipple et Dreyfuss,

1966; Pardee,1966 et 1967 -voir plus loin-) semblent suffisantes pour que cette molécule s'étende au travers de toute la membrane

— De même l'ATPase de la membrane des érythrocytes,étudiée par Ho- kin et al.(Kahlenberg,Galsworthy et Hokin,1967; Medzihradsky,Kline et Hokin,1967; Ruoho,Hokin,Hemingway et Kupchan,1968) qui semble assurer le transport du sodium et du potassium et qui a été récem­ ment purifiée,est une lipoprotéine de très grande taille,dont le poids moléculaire est estimé à 670.000 .

Elle pourrait donc également s'étendre au travers de la membrane et subir des changements de conformation assurant le transport des deux ions.

Ce type d'interprétation n'est pas incompatible avec les systèmes où l'intervention de deux facteurs a été démontrée; dans ce cas,les deux facteurs pourraient être de nature protéique.

4. COUPLAGE DES SYSTEMES DE TRANSPORT A DES SOURCES D'ENERGIE.

Nous avons vu dans les paragraphes précédents que le trans­ port actif d'un métabolite,permettant son accumulation intracellu­ laire contre un gradient de concentration,nécessite une source d'é­ nergie .

Les premières études des phénomènes de transport chez les microorga­ nismes avaient déjà souligné cette nécessité et avaient montré que les poisons énergétiques comme le DNP et le NaN^ empêchent l'accumu­ lation des métabolites (Gale et Payne,1950; Gale,1951; Cohen et Ric- kenberg,1955)•

De nombreux travaux ont confirmé ces observations pour l'accumula­ tion de diverses molécules dans tous les types de cellules.

Toutefois la nature du mécanisme assurant le couplage du transport avec une source d'énergie n'a pas été évoquée pendant longtemps.

— Dans son modèle.du système perméasique des galactosides,Képès (19.60g^) a placé,du côté externe de la membrane,un mécanisme, four-: nissant l'énergie nécessaire à la fixation du substrat sur le trans porteur (voir plus haut).

— Cependant Cohen et Monod ('1957) avaient indiqué précédemment que l'apport énergétique ne semblait pas nécessaire au transport lui- même mais seulement à l'accumulation du substrat dans la cellule, dans les conditions où sa pénétration n'est pas immédiatement sui­ vie de son utilisation.

— Peu après,Képès (1960-|^) a proposé que l'énergie métabolique soit nécessaire à la dissociation du complexe substrat-transporteur plu­ tôt qu'à sa formation. Cette hypothèse, est également proposée par Koch (1964).

— Winckler et Wilson (1966) ont suggéré que le couplage énergétique diminuait l'affinité du transporteur pour le substrat,réduisant ainsi son efflux et favorisant son accumulation dans la cellule. Cette interprétation explique l'effet des agents comme le DNP et le NaN^ qui augmentent la sortie des /^-galactosides sans affecter leur vitesse d'entrée (phénomène également décrit précédemment par Cohen et Monod,1957 et Koch,1964).

A. Mécanisme modifiant la nature chimique du substrat

transporté: le système "PEP-phospho-transférase".

La nécessité de 1'intervention,dans le transport des su­ cres, d'un mécanisme de phosphorylation est un problème controver­ sé depuis longtemps (revues par Wilhrandt et Rosenberg,1961 ; Chris- tensen,1962). Crâne et al. (I960) ont démontré que,dans l'intestin, aucune phosphorylation n'est nécessaire au transport du glucose. Cependant,chez les bactéries,des travaux ont indiqué que certains sucres s'accumulent au moins partiellement sous forme de dérivé phosphorylé (Rogers et Yu,1962; Hagihira,Wilson et Lin,1963); de plus,Wimckler(1966) a montré que,pendant la première minute sui­ vant le transport,on ne trouve que du glucoside-P dans les cellules et qu'il est déphosphorylé ultérieurement.

Ces résultats préliminaires ont été confirmés et étendus (principalement dans le laboratoire de Roseman) par les études du système phospho-transférase participant au transport de plusieurs sucres chez les bactéries: en résumé,une protéine HPr,pouvant être phosphorylée à partir de PEP grâce à un "enzyme I",fournit l'éner­ gie nécessaire aux systèmes de transport spécifiques ("enzymes II") de neuf sucres différents; ceux-ci sont libérés dans la cellule sous forme de dérivé 6-P et ne peuvent plus retraverser la membrane cel­ lulaire. (Voir revues par Roseman,1969 et Kaback,1970)

§1. Découverte du système PEP-phospho-transférase.

Le système peut transférer un groupement phosphate du phosphoénol- pyruvate (PEP) à 9. sucres,pour donner leur dérivé phosphorylé en position 6. Le système comprend deux enzymes I et II et une proté­ ine HPr (= heat-stable protein) qui sert de transporteur de grou­ pement phosphate pour l'ensemble de la réaction.

Schéma de la réaction :

Enz.I

PEP + HPr P-HPr + pyruvate

P-HPr + sucre ^ sucre-P + HPr

Enz.II

L'enzyme I et la protéine HPr participent à la phosphorylation des neuf sucres; l'enzyme II est responsable de la spécificité de la réaction et il existe un enzyme II pour chaque sucre; ceux du glu­ cose et du mannose sont constitutifs,les autres sont inductibles (références précédentes et Simoni et al.,1968; Roseman,1969)•

§2. Localisation des éléments du système.

Après lyse des cellules et fractionnement des extraits,les différents éléments de ce système ont été localisés comme suit:

— la totalité de l'enzyme II se retrouve dans la fraction membra­ naire (Kaback,19o8; Poseman,1969) et on ne peut l'en dissocier (par lavages ou traitement aux ultra-sons ou à la presse de Prench);

— 95/^ d.e la protéine HPr et de l'enzyme I se retrouvent dans le surnageant (Kundig et al.,1964; Kundig et Roseman,1966).

§3. Purification des éléments du système.

Plusieurs éléments du système ont été fortement purifiés, à partir de diverses bactéries.

est estimé à 9-300 ou 9-700. Elle peut fixer un groupement phos­ phate sur le Nx| d'une histidine. (Kundig et al.,196^; Anderson,Kun- dig,Simoni et Roseman,1968; Roseman,1969-)

— L'enzyme I a été fortement purifié par Roseman (1969) et par Hengstenberg,Penberthy,Hill et Morse

(1969)-- Kundig et Roseman (1969) ont isolé l'enzyme II spécifique des

/i-glucosides et l'ont fractionné en 5 constituants: Hg et

a été séparé en 5 fractions,de spécificités diffé­ rentes (une pour le glucose,une pour le mannose et une pour le fructose); Ilg est une protéine d'un poids moléculaire de 35-000;

a été identifié comme du phosphatidylglycérol. Tous les éléments sont indispensables à la réaction de phosphorylation du substrat et ils peuvent être réassociés en un tout fonctionnel (à condition de les ajouter dans un ordre déterminé).

§4. Participation du système au transport des sucres.

La participation du système PEP-phospho-transférase au mécanisme de transport des sucres a été suggérée par plusieurs cor­ rélations entre les propriétés de ce système et celles des systèmes perméasiques des sucres (propriétés physiologiques et génétiques; activité de membranes isolées) :

-a- Dans des cellules d'E.coli soumises à un choc osmotique provoquant une incapacité d'accumuler différents sucres,cette capacité est partiellement restaurée par l'addition d'HPr purifiée (Kundig et al.,1965 et 1966).

-b- On observe un parallélisme entre le caractère constitutif ou inductible des enzymes II et des perméases spécifiques des différents sucres. De plus,dans les systèmes inductibles on observe une bonne corrélation entre l'augmentation de quanti­ té d'enzyme II et l'augmentation d'activité perméasique (revue

par

se retrouvent dans la cellule exclusivement sous forme de dérivé phosphorylé (Egan et Morse,1965 et 1966; Laue et Mc Donald,1968;Hengstenberg,Egan et Morse,1968).

-d- L'étude de nombreux mutants des différentes espèces bac­ tériennes a montré qu'une déficience en enzyme II entraînait spécifiquement la perte de la capacité de prélever un sucre et de croître en présence de celui-ci (Tanaka et al.,1967; Fox et Wilson,1968); au contraire,une déficience en HPr ou

en enzyme I entraînait la perte de la capacité de prélever un grand nombre de sucres (Tanaka et al.,1967g^; Tanaka et Lin, 1967; Simoni,Levinthal,Kundig,Kundig,Anderson,Hartman et Rose- man,1967; Fox et Wilson,1968; Levinthal et Simoni,1969; Saier Simoni et Roseman,1970; Epstein,Jewett et Fox,1970).

-e- L'étude de membranes isolées et reconstituant des vésicu­ les ayant l'aspect de cellules vides ("ghosts"),dans lesquel­ les on peut mesurer l'accumulation d'un produit,indépendam­ ment de toute réaction métabolique intracellulaire ultérieure

(voir plus loin) a apporté des arguments essentiels dans cette étude (Kaback 1968 et 1970):

— Dans des vésicules de membranes d'E.coli,Salmonella ty- phimurium et Bacillus subtilis,la pénétration et la phosphorylation d'o(-MG (méthyl-o<-D-glucopyranoside) dé­ pendent totalement de l'addition de REP.

— Dans les vésicules formées à partir des mutants HPr~ et enzyme l”,décrits plus haut,aucune accumulation d'a(-MG n'est mesurable,même en présence de PEP.

— L'utilisation de PEP permet de montrer que la quan­ tité de ^^P qui est détachée du PEP se retrouve sur 1'<3(-MG qui s'accumule.

"in vivo" par Hagihira et al.-1963- et Winckler-1966-, et Winckler avait montré,en outre,que seul de 1'<x-MG non phosphorylé pouvait sortir des cellules.)

§5. Conclusion.

Cet ensemble de résultats permet de conclure que le systè­ me PEP-phospho-transférase fait partie du système de transport des sucres et n'est pas une réaction intracellulaire de "trapping" du sucre. Roseman (1969) a résumé le mécanisme par le schéma suivant:

L'enzyme II possède un site de reconnaissance spécifique pour un sucre et un site pour HPr; le sucre se lie sur le site catalytique et un changement conformationnel se produit,qui le place vers l'in­ térieur; la protéine HPr se fixe sur l'enzyme II; elle est phospho­ rylée à partir de PEP,par l'intermédiaire de l'enzyme I; elle trans fère le groupement phosphate au sucre et l'ensemble du complexe se dissocie,libérant le sucre-6-P dans la cellule; celui-ci ne peut plus traverser la membrane.

Kaback (1970) qualifie la translocation du sucre résultant de ce mécanisme,de "phosphorylation vectorielle".

tra-vers de cette structure.

Roseman (1969) fait remarquer que la participation du sys­ tème phospho-transférase au mécanisme de transport des sucrées est très économique pour la cellule puisque toute l'énergie consommée pour le transport (c'est-à-dire l'apport du groupement phosphate) est récupérée par la cellule sous forme de sucre—P,qui est la for­ me généralement utilisée pour le métabolisme.

Un système assez semblable à celui de Roseman et al.,com­ prenant une molécule qui utilise l'ATP comme source de groupement phosphate et qui assure l'entrée de divers hexoses chez la levure, a été mis en évidence par Van Steneninck et al. (Van Steveninck et Dawson,1968; Van Steveninck,1968^et , et 1969)*

ol D

peut toutefois pas être étendu au transport de tous les métaboli­ tes,ni même à celui de tous les sucres. En particulier,le système PEP-phospho-transférase ne semble pas participer au transport des f?)-galactosides chez la plupart des bactéries (revues par Pardee, 1968 et Kaback,19?0),à l'exception de Staphylococcus aureus (Tana- ka et al.,voir plus haut).

B. Mécanisme ne modifiant pas la nature chimique du substrat transporté.

Un système entièrement différent du précédent,fournissant l'énergie nécessaire au transport de divers acides aminés (Kaback et Milner,19?0) et des /2>-galactosides (Barnes et Kaback,1970) été mis en évidence dans des membranes isolées d'E.coli (membranes re­ constituant des vésicules dans lesquelles les métabolites sont ac­ cumulés) .

L'accumulation des acides aminés dans ces vésicules est stimulée par le glucose et nécessite de l'oxygène (Kaback et Stadtman,1966; Kaback et Druel,1969),mais elle n'est pas stimulée par l'addition d'ATP ou de PEP et elle n'est pas inhibée par l'arséniate ou l'oli- gomycine. Aucun système phospho-transférase ne semble donc partici­ per au mécanisme responsable de l'accumulation des acides aminés et des /3-galactosides.

Par contre le transport est nettement stimulé par la conversion du D-lactate en pyruvate (la vitesse d'entrée augmente de 20 à 30 fois selon le substrat considéré). Le transport des acides aminés et des galactosides semble donc couplé à l'activité d'une D-lactico-déshy- drogénase membranaire.

montré que la colicine découplait la lactico-déshydrogénase du système de transport de la proline).

Comme aucune modification covalente du substrat,acide aminé ou |3-galactoside,n'a pu être mise en évidence au cours de son trans­ port,Kaback. et al. suggèrent qu'un transfert d'électrons provoque une oxydo-réduction réversible de la protéine-transporteur,entraî­ nant un changement de sa conformation et assurant ainsi la trans­ location du substrat.

L'intervention d'un mécanisme de transport ne modifiant pas la structure du substrat mais plutôt celle du transporteur nous paraît,intuitivement,plus probable,dans tous les cas où le substrat qui pénètre peut servir à diverses voies métaboliques (comme c'est le cas,par exemple,pour les acides aminés).

5. CHOIX D'UN MODELE POUVANT SERVIR D'HYPOTHESE DE TRAVAIL.

Les différentes conceptions des mécanismes responsables du transport des métabolites dans les cellules peuvent être résu­ mées en deux modèles qui se distinguent par le nombre d'étapes participant à la réaction: l'un ne comprend qu'un seul élément, responsable à la fois de la reconnaissance et de la translocation du substrat; l'autre comprend deux éléments distincts,1'un,respon­ sable de la reconnaissance du substrat et 1'autre,assurant sa translocation au travers de la membrane.

A. Mécanisme de transport comprenant un seul facteur.

qui ressort de l'ensemble des travaux des laboratoires de Chris- tensen,Heinz,Ring,Stein,Hokin,Roseman et Kaback (voir plus haut):

Nous pouvons donc envisager,comme première hypothèse, l'existence d'une protéine présentant ui^site de reconnaissance pour un (ou plusieurs) substrat et pouvant assurer sa transloca­ tion au travers de la membrane à la suite d'une rotation ou d'un changement de conformation.

Comme nous l'avons vu dans le paragraphe précédent,un couplage avec une source d'énergie peut,soit permettre ce mouvement de la molécule de transporteur,soit favoriser le décrochage du substrat

B, Mécanisme de transport comprenant deux étapes successives.

Nous pouvons envisager une deuxième hypothèse,conforme au modèle perméasique classique décrit plus haut.

Sur la face externe de la membrane,une perméase possédant un site de reconnaissance pour un (ou plusieurs) substrat catalyse sa li­ aison sur une deuxième molécule,le transporteur,responsable de la translocation proprement dite du substrat.

La nature de ce transporteur doit être précisée.

Le couplage avec une source d'énergie peut se faire de différentes manières,comme nous l'avons envisagé dans l'hypothèse précédente. Schéma proposé :

G. Remarque.

membrane. Nous n'avons donc pas envisagé de modèle plus complexe comme hypothèse préliminaire.

Nous envisagerons plus loin (voir introduction du chapi tre II ) les différents modes de régulation qui peuvent toucher les mécanismes de transport.

III. PROBLEMES PARTICULIERS LIES A L'ETUDE DES SYSTEMES DE TRANSPORT .

Les méthodes classiques de 1'enzymologie qui permettent de caractériser une séquence de réactions participant à une voie métabolique et qui comportent l'isolement des éléments du système, l'étude de leur fonctionnement "in vitro" et sa mise en parallèle avec le comportement des cellules intactes,se sont révélées diffi­ cilement applicables à l'étude des phénomènes de perméabilité.

Si on considère que la seule fonction d'un système de trans­ port est de faire franchir une barrière imperméable à une molécule,

quand ce système est isolé,il perd la possibilité d'exercer sa fonc­ tion et devient ainsi difficile à identifier et à analyser.

Aussi,pendant longtemps,1'étude des mécanismes responsables du trans­ port des métabolites n'a pu se baser que sur des mesures réalisées avec des cellules entières et les propriétés de ces systèmes ont été mises en évidence par des méthodes indirectes.

Des études assez récentes ont toutefois permis l'isolement de molécules participant au transport de divers métabolites; on a généralement démontré que ces molécules sont indispensables au trans­ port et qu'elles présentent une affinité pour leur substrat,mais le fonctionnement normal du système ne peut être analysé par cette mé­ thode .

Un complément d'information essentiel a été apporté à ces travaux par l'étude des membranes isolées et qui reconstituent des vésicules capables d'accumuler divers métabolites.

1. PROBLEMES LIES A LA CARACTERISATION DES SYSTEMES DE TRANSPORT "IN VIVO".

Un premier problème qui se pose,dans l'étude de tout sys­ tème de transport,est celui de la spécialisation de sa fonction; en effet,il est souvent difficile de démontrer si le transport est, ou non,indépendant de toute réaction intracellulaire du métabolisme du substrat qui pénètre, (voir revue par Cohen et Monod,1957)

Le système perméasique du lactose était particulièrement favorable à cette étude grâce à l'existence des thiogalactosides qui sont é- galement prélevés par ce système mais qui ne sont pas métabolisés dans la cellule.

Pour l'analyse des systèmes de transport de substrats dont il n'exis te pas d'analogues non métabolisés,on peut soit utiliser un mutant dépourvu de l'activité du premier enzyme impliqué dans l'utilisation du substrat,soit démontrer qu'une mutation peut entraîner la perte de la capacité d'accumuler ce substrat sans affecter les réactions de son métabolisme intracellulaire» On peut encore montrer que le produit accumulé dans les cellules n'a subi aucune modification chi­ mique; par exemple,pour les premiers systèmes perméasiques d'acides aminés mis en évidence chez E.coli,le produit accumulé dans les cel­ lules a été identifié par chromatographie (Cohen et Rickenberg,1956)

L'étude des propriétés des systèmes de transport,au point de vue cinétique et au point de vue de la régulation de leur fonc­ tionnement , fournit des indications sur leur nature:

— Les cinétiques d'accumulation d'un substrat dans la cellule en fonction de sa concentration externe permettent de déterminer une constante d'affinité apparente (Km) de l'ensemble du système de transport vis-à-vis de ce substrat.

Ahmed et Scholefield (1962) ont défini dans quelles conditions on peut conclure que deux molécules sont reconnues par le même site de liaison,grâce à une méthode indirecte basée sur l'observation d'inhibitions compétitives entre les deux molécules et sur la com­ paraison des constantes d'affinité et d'inhibition de leurs systè­

mes de transport (voir chapitre I p.

77

).

quée par Begin et Scholefield (1965) et par Scriver et Wilson (1964) pour déterminer le nombre et la spécificité des sites de liaison participant au transport des acides aminés dans les cellules du pan­ créas et du cortex rénal.

— Les caractéristiques cinétiques et la grande spécificité des sys­ tèmes de transport permettent de conclure qu'ils présentent des propriétés comparables à celles des enzymes et qu'un élément proté­ ique doit être responsable de la liaison spécifique du substrat. Une vérification directe de cette conclusion est apportée par tous les systèmes qui comprennent un élément dont la synthèse est induc­ tible (ce qui est le cas le plus fréquent pour les sucres mais pas pour les autres métabolites) et peut être empêchée par les inhibi­ teurs de synthèse protéique.

— Pour déterminer si d'autres facteurs participent au fonctionne­ ment d'un système de transport et pour préciser le nombre d'étapes qu'il comprend,les études réalisées "in vivo" permettent rarement d'aboutir à des conclusions univoques.

Nous avons vu plus haut que certains modèles de systèmes de trans­ port comprennent une seule étape,responsable à la fois de la liai­ son spécifique du substrat et de sa translocation au travers de la membrane; d'autres modèles comprennent deux étapes successives, se partageant ces deux aspects du rôle du système de transport.

Outre l'emploi de divers inhibiteurs,on peut,à cet effet,utiliser la méthode graphique de Monod,Pappenheimer et Cohen-Bazire (1952) qui permet de déterminer si un effecteur agit ou non sur le taux de synthèse d'un enzyme.(Cette méthode sera utilisée et son principe sera discuté dans le chapitre II.)

Il faut remarquer que l'étude des phénomènes de perméabi­ lité dans des cellules intactes est encore beaucoup plus complexe dans les tissus de mammifères que dans les microorganismes; en ef­ fet,dans certaines cellules (comme celles de la paroi intestinale ou du cortex rénal) le transport doit s'exercer au travers de la cellule entière et ses deux faces opposées doivent donc présenter des propriétés différentes. De plus,dans le cas de 1'intestin,les différentes techniques mises au point ("everted sac" et perfusion d'un fragment "in situ") étudient le transport global au travers de toutes les couches de cellules qui constituent la paroi intes­ tinale .

2. ISOLEMENT ET PURIFICATION DE MOLECULES FAISANT

PARTIE DE SYSTEMES PERMEASIQUES.

Des précisions importantes sur la nature et sur le nombre des facteurs nécessaires au transport d'un métabolite ont été appor tées par l'isolement de constituants de quelques systèmes perméasi- ques.

Deux types de méthodes ont été utilisées pour purifier ces consti­ tuants: soit un marquage radioactif sélectif de la molécule à iso­ ler, soit son identification par sa capacité de lier son substrat, sans marquage préalable de la molécule à isoler.

A. Purification de molécules rendues radioactives.

lement de la (3-galactoside-perméase d'E.coli: l'une utilise la ca­ pacité de la molécule de fixer irréversiblement un inhibiteur radio­ actif sur le site de reconnaissance du substrat; l'autre provoque

la synthèse induite de la perméase en présence d'acides aminés ra­ dioactifs qui sont donc intégrés dans sa structure.

—1— Fox et Kennedy (1965) ont utilisé un inhibiteur spécifique, l'N-éthylmaléimide,qui se lie irréversiblement sur les groupements sulfhydryles et qui empêche le transport des 6-galactosides.

Un double marquage des cellules (avec et G) a été réalisé pour permettre de distinguer les cellules non induites et les cellules induites (c'est-à-dire possédant une grande quantité de perméase), — Du KEM non radioactif est d'abord ajouté aux cellules en présen­ ce de galactoside; il se fixe sur toutes les molécules susceptibles de le lier,sauf sur la perméase dont le site est protégé par son substrat; le NEM et le galactoside sont alors retirés du milieu. — Ensuite,les cellules induites sont mises en presence de C-NEM et les cellules non induites,en présence de ^H-NEM, Les deux types de bactéries sont mélangées et broyées; à partir de leur fraction membranaire,la protéine radioactive est extraite avec un détergent Triton et isolée par chromatographie,

— La fraction isolée présente un rapport élevé C/^H,résultat qui

est attendu puisque la technique doit sélectivement marquer le si-14

te de transport induit avec le C-NEM.

— La protéine ainsi isolée,baptisée protéine M (Membrane protein) est inductible avec le reste de l'opéron "lac"; elle ne présente pas d'activité enzymatique (c'est-à-dire ne correspond ni à la

/i-galactosidase ni à la transacétylase) et elle présente une affi­ nité importante pour les galactosides; elle possède donc les pro­ priétés essentielles attendues pour la perméase.

molécu-la cellule (Fox et al.,1967; Jones et Kennedy,1968 et 1969; Scarbo­ rough et al, , 1968; Carter et al.,1968; Fox,1969).

- Deux travaux récents de Fox (1969) et de Hsu et Fox (1970) ont montré que la synthèse d‘une protéine M fonctionnelle n'augmente pas. indéfiniment avec la dose de gène y: la protéine M est synthé­ tisée normalement et peut être isolée en partie dans la fraction cytoplasmique de la cellule,mais son intégration dans la membrane et son activité sont limitées par la synthèse d'un lipide complexe qui doit se lier à la protéine M pour donner un système de trans­ port fonctionnel.

—2— Dans une étude des synthèses protéiques accompagnant l'adapta-., tion des cellules d'E.coli à l'utilisation du lactose (au .cours de la croissance diauxique en présence de glucose et de lactose),Naono, Rouvière et Gros (1965) ont trouvé des conditions particulièrement favorables à l'isolement de la perméase:

- pendant la phase de latence de la croissance,les cellules réali-sent une synthèse préférentielle des protéines de 1'opéron"lac";

^14

- en marquant ces protéines par un "puise" d'acides aminés G-,on: reconnaît,après extraction et chromatographie,trois pics radioactifs importants: les deux premiers sont identifiés,par leur activité enzy­ matique , comme la/b-galactosidase et la trahsacétylase ; le troisième ne présente pas d'activité enzymatique et les auteurs supposent qu'il correspond à la perméase.

Ce travail n'a pas été poursuivi mais une méthode sembla­ ble a été développée peu après par Kolber et Stein (1966) puis par

Stein (1967): ■

- les protéines de. cellules induites pour l'opéron "lac" et de cel­ lules non Induites sont marquées avec de la phénylalanine,soit ^H,

14 soit _ G ;

tes sont séparées sur une colonne de DEAE-cellulose,éluée au moyen d'un gradient de chlorure de sodium;

- les protéines extraites présentent la même quantité d'^H et de G,sauf dans trois pics: le premier qui présente l'activité de la (?>-galactosidase; le deuxième qui présente l'activité de la trans- acétylase et le troisième qui ne présente pas d'activité enzymati­ que; ce dernier disparaît quand l'expérience est réalisée avec des mutants y”; il semble donc correspondre à la perméase.

Utilisant la même technique de double marquage isotopique, Kotyk (1967) et Haskovec et Kotyk (1969) ont isolé,à partir de cel­ lules de levure,une protéine, inductible qui semble responsable du transport du galactose; son affinité pour son substrat est évaluée par dialyse à l'équilibre; cette méthode montre également la spéci­ ficité de la protéine isolée vis-à-vis de son substrat.

B. Purification de molécules sans marquage radioactif préalable.

Neu et Heppel (1965) et Nossal et Heppel (1966) avaient montré que des cellules bactériennes soumises à un choc osmotique ,

(transfert rapide des bactéries d'une solution concentrée de sucro- se à une solution diluée de MgCl2 ,à 0®C,)perdent différentes pro­ téines et enzymes membranaires tout en restant viables. De nombreux travaux ont montré ensuite que ces cellules perdent la capacité d' accumuler divers métabolites et que des protéines faisant partie de leurs systèmes de transport ("binding proteins") peuvent être iso­ lées à partir du liquide surnageant après ce traitement des cellu­ les, Après divers modes de fractionnement,ces protéines peuvent ê- tre identifiées par dialyse à l'équilibre (Piperno et Oxender,1966) , par libération de leur substrat radioactif préalablement fixé sur une résine échangeuse d'ions (Pardee et al.; Wasserman;Taylor et al.ivoir plus bas) ou encore par fixation du substrat marqué sur la protéine et récupération de la fraction radioactive après passa­ ge sur une colonne de Sephadex (Anraku,1967 et 1968 ),

—1— Piperno et Oxender (1966) ont isolé une protéine participant au transport de la leucine,de l'isoleucine et de la valine,chez E.coli. Les constantes d'affinité de la protéine isolée,pour ces trois substrats,déterminées par dialyse à 1'équilibre,sont iden­ tiques à celles déterminées "in vivo" pour le système de transport des acides aminés. La spécificité de la protéine isolée et des in­ hibitions compétitives entre ces trois substrats ont également été étudiées par dialyse à l'équilibre.

- Les propriétés de cette protéine ont été précisées dans des tra­ vaux ultérieurs du même laboratoire (Oxender,Piperno et Penrose, 1967; PenrosejNichoalds et Oxender,1968; Nakane,Nichoalds et Oxen­ der,1968; Nichoalds,Penrose et Oxender,1969) et elle a été haute­ ment purifiée et même cristallisée. Son poids moléculaire est de 56

.

.

- La participation de cette protéine au transport des acides aminés est confirmée par le fait qu'elle ne peut être isolée à partir de cellules cultivées en présence de leucine et dans lesquelles la syn thèse du système de transport de cet acide aminé est réprimée

(Oxender et al.,1967).

- La localisation de cette protéine à la surface de la membrane a été démontrée par la fixation,sur des cellules intactes,d'anticorps dressés contre la protéine purifiée (Penrose et al.,1968).

—2— Pardee et al. ont isolé une protéine liant les ions sulfate et qui fait partie de leur système de transport chez Salmonella typhi- murium (?ardee et Prèstidge,1966; Pardee,1966 et 1967;Pardee et al. 1966; Pardee et Watanabe,1968).

- La protéine a été obtenue à partir de cellules cultivées en pré­ sence d'une concentration limitante d'ions sulfate,ce qui provoque une dérépression de la synthèse de leur système de transport.

- Une protéine d'un poids moléculaire de 52.000 a été obtenue à l'é tat pur et a été cristallisée.

ine isolée et l'activité du système de transport du sulfate dans les cellules intactes,ce qui confirme que la protéine isolée fait partie du système de transport.

—3— En étudiant le système PEP-phospho-transférase,Kundig et al. (1966) ont montré que les cellules d'E.coli traitées par choc osmo­ tique ne peuvent plus concentrer les glucosides et ne contiennent presque plus de protéine HPr; l'addition de la protéine HPr purifiée à ces cellules restaure complètement leur capacité d'accumuler les glucosides.

Cette protéine apparaît donc comme un élément essentiel du système de transport des glucosides.

—4— Anraku et Heppel (196y^ et ont montré que les cellules d'E. coli soumises au choc osmotique perdent la capacité d'accumuler le galactose,la leucine,1'uracile et la thymine.

- Dans ces conditions,Anraku (1967 et; 1968_) a isolé et purifié une

O.

protéine liant la leucine et une autre liant le galactose,par chro- matographies sur colonnes de DEAE-cellulose,d'hydroxylapatite puis de DEAE-Sephadex. La pureté des deux protéines est démontrée par é- lectrophorèse sur gel d'acrylamide. Leur capacité de lier leur sub­ strat et la spécificité de cette réaction ont été déterminées par dialyse à l'équilibre. Ces deux protéines sont distinctes des enzy­ mes pouvant catalyser l'utilisation de leur substrat à l'intérieur des cellules (enzyme d'activation de la leucine; galactokinase). - Les propriétés physico-chimiques des deux protéines ont été pré­ cisées (Anraku,1968^); leur composition en acides aminés a été éta­ blie; leur poids moléculaires sont très voisins: 36.000 pour la pro­ téine qui lie la leucine et 35.000 pour celle qui lie le galactose; chaque molécule de protéine peut fixer une molécule de substrat. La protéine liant la leucine a été cristallisée.

- Les deux protéines peuvent être réintégrées dans les cellules ayant subi le choc osmotique (Anraku,1968^).