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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Totte, P. F. (1994). Evaluation du rôle joué par les cytokines et la myelopéroxydase dans les infections par la rickettsie cowdria ruminantium : implications dans les mecanismes de résistance et dans la pathologie (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/212722/3/d1a2e9d0-98c2-48f8-8ddb-1c0de96295f5.txt
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UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté des Sciences
Section Interfacultaire d'Agronomie
EVALUATION DU ROLE JOUE PAR LES CYTOKINES ET LA MYELOPEROXYDASE DANS LES INFECTIONS
PAR LA RICKETTSIE COWDRIA RUMINANTIUM : IMPLICATIONS DANS LES MECANISMES DE RESISTANCE
ET DANS LA PATHOLOGIE
Thèse présentée en vue de l'obtention du grade scientifique de Docteur en Sciences Agronomiques Promoteur : Prof. J. Werenne
Laboratoire de Biotechnologie des
par
PHILIPPE TOTTE
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté des Sciences
Section Interfacultaire d'Agronomie
EVALUATION DU ROLE JOUE PAR LES CYTOKINES ET LA MYELOPEROXYDASE DANS LES INFECTIONS
PAR LA RICKETTSIE COWDRIA RUMINANTIUM : IMPLICATIONS DANS LES MECANISMES DE RESISTANCE
ET DANS LA PATHOLOGIE
Thèse présentée en vue de l'obtention du grade scientifique de Docteur en Sciences Agronomiques Promoteur : Prof. J. Werenne
Laboratoire de Biotechnologie des
par
PHILIPPE TOTTE
TITRE DE LA THESE ANNEXE :
L’utilisation d’un bioréacteur de type Couette - Taylor devrait permettre
d’optimaliser la culture en masse des cellules endothéliales.
Remerciements
Cette thèse a pu être menée à bien grâce au Professeur John Werenne à qui j’exprime ma sincère gratitude.
Cette aventure a commencé par un stage, effectué au Zimbabwé dans le laboratoire du projet UF/USAID de recherche sur la cowdriose. Je tiens à remercier les Drs. A.L.W. De Gee et C. Yunker pour leur accueil et leur disponibilité.
Le travail n’aurait pas pu démarrer sans l’aide des Professeurs G. Uilenberg et F.
Jongejan qui nous ont aimablement fourni des stocks de Cowdria et des cellules endothéliales. Qu’ils soient vivement remerciés. Cette collaboration avec le CIRAD - EMVT (France) et l’Université d’Utrecht (Pays - Bas) s’est concrétisée dans le cadre d’un projet STD 3 (Science and Technology for Development) financé par la CCE.
J’ai eu le grand plaisir, grâce à une bourse du Commissariat Général aux Relations Internationales de la Communauté Française de Belgique, d’effectuer un stage de formation dans le laboratoire de virologie du Prof. I. Sarov (Université Ben Gurion, Beer Sheva, Israël).
Je remercie le Prof. A. Billiau et le Dr. H. Heremans avec qui nous collaborons de manière fructueuse et enrichissante.
Tous mes remerciements vont également au Prof. A. Bollen ainsi qu’aux Drs N.
Moguilevski et C. Tournay pour le matériel qu’ils nous ont fourni, l’initiation à la technique de PCR (grâce à France) et surtout leur accueil chaleureux.
Merci à toi Albert pour m’avoir hébergé lors de mon séjour à Paris et pour m’avoir tant appris en si peu de temps. Merci aussi à Isabelle pour son aide précieuse.
Enfin , je voudrais remercier tout particulièrement les membres du Laboratoire de
Biotechnologie des Cellules Animales pour leur support et collaborations diverses. Un
grand merci à Nathalie pour sa bonne humeur et son dynamisme.
à ma famille, à Françoise.
Abréviations
ADN acide déoxy ribonucléique ARNm : acide ribonucléique messager ARNt : acide ribonucléique de transfert
CCE Commission des Communautés Européennes
CIRAD - EMVT Centre de Coopération Internatbnale en Recherche Agronomique pour le Développement - département d'Elevage et de Médecine Vétérinaire des Pays Tropicaux.
CMH : complexe majeur d’histocompatibilité ConA : concanavaline A
CPA : cellule présentatrice de l’antigène DMEM : Dulbecco minimum essentiel medium DMSO : diméthyl sulfoxyde
DS : déviation standard DTT ; dithiothréitol
EDTA : éthylène diamine tétraacétique
cELISA : compétitive enzyme-linked immunosorbent assay Hepes : N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid IFN interféron
Ig immunoglobuline IL interleukine LPS lipopolysaccharide Mu- murine
P
b ; paires de bases PBS : phosphate buffer saline
SPG : sucrose - phosphate - glutamate SVF : sérum de veau foetal
TNF : tumor necrosis factor
VSV : virus de la stomatite vésiculaire
RESUME
La cowdriose ("Heartwater" en anglais) est une maladie grave des ruminants domestiques et sauvages qui sévit en Afrique Sub-Saharienne. Elle est connue depuis longtemps (1838) en Afrique du Sud où elle constitue un frein majeur à l'amélioration génétique du cheptel. L'étendue de la zone climatique favorable à son vecteur ( les tiques du genre Amblyomma ) est telle que la menace que fait peser la cowdriose dépasse largement le continent africain ( elle est déjà présente dans les Antilles françaises d'où elle risque de s'étendre au continent américain ). Les moyens de lutte contre la cowdriose sont limités et aucun d'entre eux n'est vraiment satisfaisant. Une méthode d'infection - traitement consistant à infecter volontairement les animaux et puis à les traiter au moyen d'antibiotiques au moment de la réaction fébrile, est utilisée à plus ou moins grande échelle en Afrique du Sud (+/- 500.000 doses / an ) et a contribué au contrôle de la maladie dans ce pays. Elle est cependant risquée et laborieuse, et de nombreux éleveurs ne prennent pas le risque de l'utiliser. D'autres moyens, plus appropriés, permettant d'induire une réponse immunitaire protectrice de longue durée chez l'animal susceptible font cruellement défaut. C'est la raison pour laquelle la nature de la réponse immunitaire à Cowdria suscite un intérêt grandissant.
Notre travail a eu pour but de contribuer à une meilleure connaissance de la réponse immunitaire à Cowdria . Si la compréhension de l'immunologie impose, maintenant, l'étude de l'effet d'une infection sur les différentes populations lymphocytaires, les données de base relatives au ruminant manquaient encore, jusqu'il y a peu (la distinction Thi / Th2 ayant été démontrée chez le ruminant qu'en 1993), pour permettre une approche directe dans le cas de la cowdriose. Une autre voie d'approche s'imposait: c'est pourquoi nous avons étudié, pour la première fois, l'implication dans la réponse de l'hôte à Cowdria , de mécanismes d'actions spécifiques ou non spécifiques, tels que ceux mis en oeuvre par les cytokines et la myélopéroxydase (MPO).
Faute de pouvoir étudier toutes les cytokines décrites à ce jour, nous nous sommes
concentrés sur celles qui sont les plus susceptibles de jouer un rôle dans la cowdriose (en
raison de leurs implications importantes dans les infections par d’autres pathogènes intracellulaires) : les IFNs (a et , les ILs (IL -1, IL -2 et IL --6) et le TNF.
Nous avons montré, pour la première fois, un effet inhibiteur de riFNy exogène sur le développement de Cowdria ruminantium , in vitro dans des cellules endothéliales de vaisseaux sanguins, et in vivo , dans un modèle murin des infections par la rickettsie. Ces résultats sont en faveur d'un rôle important pour I'IFN
ydans la résistance à la maladie.
Néanmoins, la production d'IFNy endogène par l'animal infecté n'est pas encore démontrée. Les expériences de traitement au moyen d’anticorps neutralisant riFNy suggèrent que celui-ci ne joue pas un rôle prépondérant dans la pathologie de la cowdriose. Nos résultats sont donc conformes à l’idée que la contribution de I’IFNy à la maladie est bénéfique plutôt que détrimentale. L’ensemble de ces résultats souligne l’intérêt d’orienter les recherches vers l’identification d’antigènes de Cowdria capables d’induire la production d’IFNy par les lymphocytes T. Ces antigènes pourront être éprouvés comme vaccin recombinant contre la cowdriose.
L’IFNa recombinant est également actif contre la rickettsie in vitro, dans la mesure ou il ralentit la progression de l’infection sans toutefois la bloquer totalement. Nous avons observé, chez le bovin infecté expérimentalement par Cowdria , que seuls les animaux qui survivent naturellement (sans antibiotique) à l’infection présentent une augmentation significative et précoce d’IFNa circulant. Ces résultats suggèrent que l’IFNa endogène, produit en réponse à l’infection, contribue à la résistance de l’animal en ralentissant la progression de l’infection. Cependant, d’autres mécanismes, pas encore caractérisés, devraient se mettre en place afin d’assurer le contrôle à long terme de la maladie.
Nous avons également montré que les animaux qui succombent à une infection par Cowdria n’expriment pas d’ARNm codant pour l’IL-2 ce qui suggère qu’il n’y a pas eu prolifération ni activation de lymphocytes T producteurs d’IL-2. L’implication possible, dans la cowdriose, de l’IL-4 et de I’IL-10 en tant qu’inhibiteurs de l’activation et de la prolifération de Thi producteurs d’IL-2 est en cours d’investigation dans notre laboratoire.
Nos résultats indiquent que le TNF ne joue pas un rôle important dans la résistance à
Les cellules endothéliales, traitées à I'IFN
y, expriment à leur surface des antigènes de classe II et pourraient donc, lorsqu'elle sont infectées par Cowdria, jouer le rôle de cellules présentatrices des antigènes du pathogène. Cependant, nous avons observé, au cours de ce travail, que Cowdria diminue drastiquement l'induction par I'IFN
yd'antigènes de classe II du CMH à la surface des cellules endothéliales. Cet effet de Cowdria , s'il est confirmé in vivo, limiterait considérablement la présentation, par la cellule endothéliale, d'antigènes de Cowdria en association avec les molécules de classe II. Dans la mesure où cet effet s'exercerait aussi sur les CPA , il pourrait expliquer qu'au cours de la réinfection par Cowdria il y ait augmentation significative du nombre de lymphocytes T cytotoxiques (dont l'activation ne dépend pas des molécules de classe II) mais pas des lymphocytes T auxiliaires.
Il y a, chez la chèvre infectée par Cowdria., expression d'ARN messagers de l'IL -1 et de l'IL - 6. Dans le cas de l'IL -1, cette expression augmente chez l'animal infecté peu avant l'hyperthermie et quelle que soit l'issue de l'infection (survie ou mort de l'animal). Des expériences de traitements au moyen d'IL-1, d'IL-6 et d'anticorps neutralisant ces cytokines sont en cours dans notre laboratoire et permettront de statuer sur leur rôle dans la résistance à la cowdriose. Des expériences réalisées sur la souris susceptible indiquent que riL-6 ne joue pas un rôle prépondérant dans la pathologie. Le rôle de l'IL-1 dans la pathologie de la cowdriose est à l'étude chez la souris.
Nous avons apporté la première évidence du rôle thérapeutique de la MPO recombinante dans une infection par un pathogène intracellulaire. Le modèle de la cowdriose est donc un modèle prometteur pour l'étude des propriétés de la MPO in vivo.
Nos résultats suggèrent cependant que la myéloperoxydase n'agit pas via la production d'hypochlorite. L'effet de la MPO, in vivo , pourrait résulter d'une action sur les macrophages, d'une part en augmentant leur capacité de phagocytose, et d'autre part la production d'H202 (qui est, comme nous l’avons montré, très toxique pour Cowdria).
L'implication de la MPO endogène dans la résistance à la cowdriose mérite donc une
Summary
Hearwater (or cowdriosis) is a tick-borne disease affecting wild and domestic ruminants in sub Saharan Africa. The disease has been known in South Africa since 1838 and represents one of the main causes of economical losses for cattle breeding in that country. The vector has a very extensive ecological niche and has recently appeared, together with the disease, in the Carribeans from where it could spread on to the american mainland. Methods of vaccination against heartwater exist (e.g. delibarate infection of the animais with virulent sheep blood “vaccine" followed by tetracyclines treatment at the time of hyperthermie ) , but their applications are risky and laborious. There is much room for improvement of this vaccination method. Therefore, information on the mechanisms involved in the protective immune response against Cowdria and in the pathogenesis of cowdriosis may be of considérable help in the search of a safe, easy to use and efficient vaccine against this disease.
As cytokines hâve been shown to play an important rôle in immune responses (both in the résistance and in the pathology) against intracellular pathogens we hâve undertaken a study to evaluate their importance in cowdriosis. Myeloperoxidase which has been shown to act against several facultative intracellular pathogens was aiso studied.
We hâve shown that only cattle that naturally survive an experimental infection with
Cowdria produce significant amount of IFNa. We hâve aIso shown that IFNa is capable to
inhibit, wihthout totally blocking it, the development of Cowdria in vitro in endothélial
cells. These results are in favor of a rôle for IFNa in the résistance against Cowdria . IFNa
may aiso act in vivo to slow down the infection and allow the animal to mount other
mechanisms of defense. Our results indicate that IFNy may play such a rôle. We hâve
indeed shown in vitro that IFNy is an excellent inhibitor of the growth of Cowdria in
endothélial cell. At doses that are not cytotoxic IFNy completely prevents the growth of
Cowdria in endothélial cells. IFNy is active on bovine as well as caprine endothélial cell
and against ail the different stocks tested (Gardel, Sénégal and Welgevonden). Moreover, treatment with recombinant IFNyprotects mice against léthal Cowdria infection. These results are supporting evidence that IFNYplays a rôle in the résistance against Cowdria . However, the production of endogenous IFNy during infection and its involvement in the résistance against Cowdria has yet to be demonstrated. On the contrary, we hâve obtained evidence that IFNy is not involved in the pathogenesis of heartwater in mice since treatment of infected mice with neutralising anti- IFNy antibodies does not prevent mortality nor affects the course of the disease. Therefore, Cowdria antigens that are capable of inducing the production of IFNy by T lymphocytes should be sought and tested fortheir ability to immunize ruminant against heartwater.
We hâve shown, in vitro, that the IFNy - induced expression of MHC class II molécules on the surface of endothélial cells is significantly diminished when the cells are infected with Cowdria . Therefore, the présentation of Cowdria - antigen at the surface of endothélial cell in association with class II molécules, if it happens, is likely to be weak.
This may be a way for the pathogen to avoid récognition by immune effector cells.
Another way may be the induction by Cowdria of the production of IL-4 and IL - 10 wich in turn inhibit activation and prolifération of IFNy and IL - 2 producing T lymphocytes. Our preliminary results showing that animais that die from heartwater do not produce IFNy nor IL - 2 is supporting evidence.
We hâve detected both in animal that survived the infection and in those that died from heartwater a rise in the expression of IL -1 mRNA wich correlates with the rise in température. Studies using recombinant IL - 1 and neutralising antibodies against IL - 1 are underway and will help understanding the exact rôle of this cytokine in cowdriosis.
IL - 6 mRNA appears as soon as day two after infection in both survivors and animais
that die from the infection. Studies using neutralising antibodies indicate that IL - 6 does
not play a major rôle in the pathogenesis of heartwater. The possible rôle of IL - 6 in the
résistance against Cowdria is still to be demonstrated.
Our results indicate that TNF does not play an important rôle in the résistance against Cowdria nor in the pathology of the disease in mice.
We hâve aiso show/n for the first time that myeloperoxidase (MPO) has a therapeutic
effect in vivo in Cowdria infections. However, our results indicate that the anti - Cowdria
effect of MPO is not due to the génération of hypochlorous acid. MPO could act, in vivo,
through the activation of macrophages with subséquent enhancement of both
phagocytosis and H2O2 (which has been shown by us to be very toxic against Cowdria
elementary bodies) production by these cells. The possible involvement of endogenous
MPO in the résistance against Cowdria certainly deserves further investigations.
INDICE
Résumé...I Summary ... IV
I
mpartie:
introduction... 1
SECTION 1. ROLE DES CYTOKINES ET DE LA MYELOPEROXYDASE DANS LES INFECTIONS CHAPITRE I : RESISTANCE AUX PATHOGENES INTRACELLULAIRES 1. INTERFERONS (IFNs)...4
1.1. Interféron 7 (IFNy)... 4
1.1.1. Propriétés immuno-modulatrices... 4
1.1.2. Activation des macrophages... 6
1.1.3. Activation des cellules non phagocytaires...10
1.1.4. Résumé... 11
1.2. Interféron a (IFN a)... 11
2. INTERLEUKINES(ILs)... 14
2.1. Interleukine 1 (IL-1)...14
2.2. Interleukine 2 (IL-2)...15
2.3. Interleukines 3. 4, 5 et 6 (IL-3, 4, 5 et 6)... 15
3. FACTEUR NECROSANT DES TUMEURS (TNF)...18
4. MYELOPEROXYDASE (MPO)... 18
4.1. Introduction ... 18
4.2. Action antimicrobienne...19
CHAPITRE II : IMMUNOPATHOLOGIE 1. REACTIONS INFLAMMATOIRES...22
1.1. Introduction...22
1.2. Fièvre...23
1.3. Chimiotactisme et infiltration... 23
1.4. Perméabilité vasculaire...23
1.5. Mort cellulaire... 24
2. IMMUNOREGULATION NEGATIVE... 25 SECTION 2 . LA COWDRIOSE
CHAPITRE I ; GENERALITES
1. LE PATHOGENE ...27
1.1. Taxonomie ...27
1.2. Cycle biologique in vivo ... 27
1.3. Cycle de développement in vitro ... 28
2. LE VECTEUR ... 29
3. DISTRIBUTION GEOGRAPHIQUE...29
4. IMPORTANCE ... 30
5. SYMPTOMES ET PATHOGENESE... 30
5.1. Symptômes et lésions caractéristiques... 30
5.2. Pathogénèse... 31
6. DIAGNOSTIC ...32
CHAPITRE II : LA REPONSE IMMUNITAIRE CONTRE COWDRIA RUMINANTIUM 1. ROLE DE L'IMMUNITE HUMORALE...35
2. ROLE DE L'IMMUNITE A MEDIATION CELLULAIRE... 35
3. MOLECULES DE CLASSE II DU CMH ET CYTOKINES...36
4. RESUME... 37
CHAPITRE III ; LES MOYENS DE LUTTE 1. LUTTE CONTRE LES TIQUES... 37
1.1. Acaricides... 37
1.2. Vaccination contre les tiques...38
2. VACCINATION CONTRE C..RUMINANTIUM...38
2.1. Méthode d’infection - traitement...38
2.2. Vaccin atténué... 39
2.3. Vaccin tué... 40
3. RESUME ... 40
CHAPITRE IV : BUT DU TRAVAIL ET STRATEGIE EXPERIMENTALE... 41 2i^mfi-PARTIE : MATERIEL ET METHODES
CHAPITRE I : MATERIEL ,44
1. CELLULES ... 44
1.1. Cultures primaires...44
1.2. Lignées secondaires (non permanentes)... 45
2. CYTOKINES RECOMBINANTES... 45
3. ANTICORPS NEUTRALISANTS ... 46
4. MYELOPEROXYDASE HUMAINE (MPO)...46
5. STOCKS DE C. RUMINANTIUM ... 47
CHAPITRE II : METHODES 1. CULTURE CELLULAIRE ... 49
2. PREPARATION DES BUPEC ...49
3. CULTURE DE COWDRIA IN VITRO...51
4. TITRAGE DE COWDRIA UN VITRO (TCLD50)... 52
5. CULTURE DE COWDRIA IN VIVO... 54
5.1. Préparation d'un stock de Cowdria ...55
5.2. Calcul de la dose létale 50% (DL50)... 55
6. PREPARATION DE LYMPHOCYTES DE CHEVRE ET DE BOVIN ... 57
7. DOSAGE DES CYTOKINES...57
7.1. Dosage du TNF... 58
7.2. Dosage de l'interféron...58
7.3. Dosage de l'interleukine-6 de souris...59
8. DOSAGE DES ANTICORPS ANTI-CYTOKINES... 60
9. DETECTION D'ANTICORPS DE COWDRIA PAR UN TEST ELISA DE COMPETITION ... 60
10. DOSAGE DE L'OXYDE NITRIQUE... 61
11. PREPARATION DES LEUCOCYTES CIRCULANT DE CHEVRES ... 62
12. EXTRACTION D'ARN ... 62
13. ELECTROPHORESE D'ARN ... 64
14. SYNTHESE D'ADNc MONOBRIN ...66
15. AMPLIFICATION EN CHAINE PAR LA POLYMERASE...67
16. ANALYSE FLUOROCYTOMETRIQUE (FACS) ...70
3i^ PARTIE : RESULTATS
CHAPITRE 1 : INTERFERONS
1. INTERFERON ALPHA (IFNa) ... 73
1.1. Production d’IFNa chez le bovin infecté parCowdria ... 73
1.2. Effet de riFNa sur le développement de Cowdria n vitro ...79
1.3. Discussion générale ... 87
2. INTERFERON GAMMA (IFN
y) ...88
2.1. Production d'IFNy chez la chèvre infectée par Cowdria ... 88
2.2. Evaluation du rôle de l'IFNYdans les infections par Cowdria chez la souris ... 92
2.3. Effet de l'IFNysur le développement de Cowdrria in vitro... 98
2.4. Recherche des mécanismes impliqués dans l’effet anti- Cowdria de I’IFN
y... 104
2.4.1. Rôle de l'oxyde nitrique ... 104
2.4.2. Rôle des récepteurs à la transferrine ...109
2.4.3. Rôle du métabolisme de l'oxygène ... 112
2.5. Effet de I'IFN
ysur le développement de Cowdria in vivo ... 115
2.6. Effet inhibiteur de Cowdria sur l'induction par I'IFNy d'antigènes de classe II du CMH à la surface des cellules endothéliales ... 119
2.7. Discussion générale ... 122
CHAPITRE II: AUTRES CYTOKINES 1. INTERLEUKINES (ILS) ...124
2. FACTEUR DE NECROSE DES TUMEURS (TNF) ...132
CHAPITRE III : MYELOPEROXYDASE 1. EFFET DE LA MYELOPEROXYDASE (MPO) IN VIVO... 137
2. EFFET DE LA MPO IN VITRO... 138
3. DISCUSSION GENERALE... 139
4iàma
partie:
conclusions et perspectives... 144
5i^m£ PARTIE : BIBLIOGRAPHIE... 150
lél£ PARTIE : INTRODUCTION
AVANT-PROPOS
Notre laboratoire s'est intéressé depuis quelques années déjà à l'étude de l'interféron (IFN), plus particulièrement dans le modèle bovin. Notre groupe a été parmi le premier a montrer, chez le ruminant, l'efficacité d'un traitement à l'IFN contre des infections d’origine virale. C'est donc, au départ, sous l'angle strict de l'IFN que nous nous sommes intéressés à la cow/driose des ruminants. Cependant, il nous est vite apparu évident qu'il était devenu difficile de faire abstraction des autres cytokines qui, comme l’IFN, font partie intégrante et sont des acteurs importants de la réponse de l’hôte à une agression par un pathogène. De plus, des travaux récents ayant montré que les cytokines, dont l'IFN, pouvaient être impliquées dans les phénomènes pathologiques liés aux infections, et, étant donné que les mécanismes responsables de la pathologie dans la cowdriose étaient inconnus, nous pouvions difficilement négliger cet aspect des choses. C'est pourquoi nous avons décidé d’évaluer le rôle des cytokines dans la résistance à la cowdriose mais aussi dans la pathologie de cette maladie importante.
L'introduction est divisée en deux sections, une sur le rôle des cytokines et de la
myéloperoxydase dans les infections (autant du point de vue de la résistance que de la
pathologie), l'autre sur la cowdriose. Dans la première, nous nous sommes limités aux
cytokines les mieux étudiées et aux modèles proches de celui de la cowdriose. Ainsi, nous
nous sommes concentrés sur les infections par des pathogènes intracellulaires (puisque
l'agent causal de la cowdriose est une bactérie intracellulaire) et sur les réactions
inflammatoires (puisque c'est une réaction inflammatoire qui semble être à l'origine de la
pathologie dans la cowdriose).
SECTION 1. ROLE DES CYTOKINES ET DE LA MYELOPEROXIDASE DANS LES INFECTIONS.
Les cytokines sont des protéines synthétisées par les cellules animales de manière constitutive ou en réponse à un stimulus. Comme leur nom l’indique elles constituent de véritables messagers intercellulaires agissant de manière autocrine ou paracrine. Elles jouent un rôle important dans des phénomènes aussi variés que la croissance et la différenciation cellulaire, l’embryogénèse, l’hématopoïese, l’immunité, etc.... En fait, dans tous les phénomènes qui mettent en jeu un ou plusieurs types cellulaires. A l’heure actuelle, une quarantaine de cytokines différentes ont été mises en évidence chez l’homme mais on ne commence à bien connaitre leur rôle et leurs propriétés que pour une dizaine d’entre elles.
Au cours d’une infection par un agent pathogène l’hôte produit des cytokines qui contrôlent la réponse immunitaire et contribuent ainsi à la résistance à l’infection mais aussi dans certains cas à l’exacerbation des réactions pathologiques. En ce qui concerne les infections par la rickettsie intracellulaire, Cowdria ruminantium , les mécanismes responsables de la résistance et de la pathologie sont encore inconnus à ce jour mais certaines observations suggèrent que les cytokines jouent un rôle important. Le but de ce travail étant l’étude du rôle joué par les cytokines et la myélopéroxydase dans les infections à Cowdria ruminantium il nous a semblé utile de faire un rappel des connaissances concernant leur rôle dans les infections par d’autres pathogènes intracellulaires.
CHAPITRE I : RESISTANCE AUX PATHOGENES INTRACELLULAIRES.
Les mécanismes de résistance aux pathogènes extracellulaires (phagocytose,
opsonisation, lyse directe par le complément) sont inopérants face aux pathogènes
intracellulaires lorsque ceux-ci se trouvent à l’intérieur des cellules de l’hôte infecté. Celui- ci doit alors recourir a d’autres moyens de défense parmi lesquels les cytokines ont une place importante. Nous avons décrit, ci-après, les modes d’actions des cytokines les plus étudiées ainsi que ceux de la myeloperoxidase.
1. INTERFERONS (IFNs)
A l’origine, les interférons ont été définis comme des protéines inductibles capables d’inhiber la multiplication virale (Isaacs et Lindenmann, 1957). Depuis, de nombreux travaux ont mis en évidence d’autres propriétés importantes du système IFN comme, par exemple, sa capacité à inhiber le développement de pathogènes intracellulaires non viraux (Byrne and Turco, 1988). Etant donné le caractère non viral de la rickettsie Cowdria ruminantium, nous avons, dans ce chapitre mis l’accent sur la description de mécanismes impliquant l’IFN et qui contribuent à la résistance de l’hôte face aux pathogènes intracellulaires non viraux.
1.1. Interféron gamma (IFN y)
L’IFN y est produit lors d’une réponse immunitaire par les lymphocytes T auxiliaires (Thi) et cytotoxiques et par les cellules tueuses ou “naturel killer cells” (cellules NK). Il n’existe qu’un seul gène codant pour l’IFN y et celui-ci possède une spécificité de genre.
L’IFN y se fixe au niveau d’un récepteur membranaire, il est ensuite internalisé par endocytose (Stewart II, 1979). L’IFN y est un antiviral moins efficace que les autres types d’IFNs mais il possède d’importantes activités immuno-modulatrices..
1.1.1. Propriétés immuno-modulatrices :
a) modulation des molécules du Complexe Majeur d’HistocomDatibilité (MHCf ; La
reconnaissance des antigènes (Ag) du pathogène conditionne la mise en place par l’hôte
de mécanismes de résistance spécifique à l’infection et son immunisation. Les réponses immunitaires spécifiques sont contrôlées par les lymphocytes T et les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité exprimées à la surface des cellules présentatrices d’antigènes (CPA). Les lymphocytes T reconnaissent l’antigène lorsque celui-ci est présenté à la surface des CPA en association avec des molécules du soi codées par le CMH (Schwartz, 1985; Roitt, 1993).
On distingue deux types de molécules du CMH ; Les molécules de classe I, présentes sur toutes les cellules, et les molécules de classe II exprimées de manière constitutive uniquement par certains types cellulaires tels que les macrophages, les lymphocytes B, et les cellules dendritiques. Les molécules de classe I sont nécessaires à la reconnaissance antigénique par les lymphocytes T cytotoxiques alors que les molécules de classe II modulent la reconnaissance de l’Ag par les lymphocytes T auxiliaires.
L’IFN Y augmente la synthèse des molécules de classe I et II, ce qui améliore la présentation de l’antigène et potentialise sa reconnaissance par les lymphocytes T. De plus, riFN yest capable d’induire in vitro la synthèse de molécules de classe II du CMH par des cellules qui ne les produisent pas de manière constitutive: chez l’homme, par les cellules endothéliales et fibroblastiques (Collins et al, 1984); chez le bovin par les cellules endothéliales (Bielefeldt Ohmann et al, 1988). Fontana et al (1984) ont montré in vitro que des astrocytes humains traités à l'IFN y expriment les molécules de classe II du CMH et acquièrent un comportement d’APC vis à vis de cellules T auxiliaires.
L’utilisation de l’IFN
ycomme adjuvant lors de la vaccination a fait l’objet de nombreuses
études. Des expériences réalisées in vivo ont montré l’action immuno-stimulante de l’IFN
Yrecombinant sur la réponse humorale primaire et secondaire
àun antigène donné
(Playfair and DeSouza, 1987; Anderson et al ,1988). Cependant, dans certains cas, un
traitement
àl’IFN
ypeut avoir l’effet inverse et diminuer la réponse immunitaire
àun
antigène probablement en inhibant la croissance des lymphocytes T et B (Johnson and
Terres, 1983; Gajewski and Fitch, 1988). L’effet d’un traitement à l’IFN y sur la réponse immunitaire à un antigène dépend du moment d’administration et de la dose utilisée. La maîtrise de ces paramètres conditionne son utilisation comme adjuvant lors de la vaccination.
b) Prolifération des lymphocytes T auxiliaires: L’activation spécifique d’une cellule T auxiliaire par un antigène donne lieu a une cascade d’événements biochimiques responsables de la prolifération clonale de cette cellule et de la production de lymphokines. La prolifération clonale dépend de la production d’interleukine 2 (IL-2) par la cellule activée et de l’expression, à la surface de cette cellule, de récepteurs à L’IL-2 (Waldmann, 1986). L’IFN y produit, entre autres, par les cellules T auxiliaires activées, joue un rôle important dans I’ augmentation et le maintien de l’expression de récepteurs à riL-2 (Johnson, 1983). Voir aussi le schéma récapitulatif page 13 .
1.1.2. Activation des macrophages :
Le monocyte et sa forme différenciée, le macrophage, jouent un rôle particulièrement important dans les infections en général. En plus de leur activité en tant que CPA, ces cellules sont capables de se fixer aux pathogènes, de les internaliser de manière active (phagocytose) et de les détruire. La phagocytose et la capacité microbicide des macrophages sont considérablement augmentées par l’IFNy. De plus, certains pathogènes intracellulaires capables de se multiplier à l’intérieur des monocytes - et des macrophages sont efficacement détruits si la cellule hôte est traitée à l’IFNy. La description des mécanismes connus d’activation du pouvoir microbicide des monocytes et des macrophages par l’IFNy fait l’objet de ce chapitre.
a) Mécanisme dépendant de l’oxygène : L’internalisation du phagosome au cours de la
phagocytose provoque une augmentation du métabolisme oxydatif du macrophage. Il y a
augmentation de la consommation en oxygène qui est réduit en anion superoxyde (02')
par une enzyme telle que la cytochrome NADPH oxydase présente au niveau de la membrane cellulaire ou phagosomale (Babior, 1978). Cet anion superoxide se transforme en peroxyde d'hydrogène (H2O2) par dismutation, soit spontanée, soit catalysée par une enzyme comme la superoxyde dismutase (SOD).
2 O2 + NADPH ====> 2 02’ + NADP+ + H+
2 O2- + 2H+ ====> H2O2 + O2 (SOD)
2 02' + 2H+ ====> H2O2 + ^02 (dismutation spontanée de 02")
A son tour, l’H202 peut donner naissance à des radicaux hydroxyles (0H‘) ou à des
oxygènes singulets (''O2) par la réaction de Haber Weiss. L’H202, l’OH' et r'*02 sont
hautement réactifs et peuvent interagir avec la bicouche lipidique des membranes au
niveau des lipides insaturés. Les réactions avec la membrane provoquent des
modifications de structure et de fonction. Notamment, la perméabilité membranaire va être
augmentée, induisant une redistribution des ions et de l’eau. Les produits oxygénés
peuvent aussi traverser la membrane, soit par diffusion comme l’H202, soit via un canal à
anion comme pour l’02, affectant ainsi le système intracellulaire. Des études réalisées
avec des macrophages dépourvus de métabolisme respiratoire (provenant de patients
atteints d'une maladie granulomateuse chronique) ont montré l’importance de ce
mécanisme dans la destruction de certains microorganismes (Wilson et al, 1989). De
nombreux travaux ont suggéré que l’IFN y était capable d’activer les macrophages, cette
activation étant notamment caractérisée par une augmentation des produits du
métabolisme oxydatif et de l’activité microbicide. Mais, il a fallu attendre de pouvoir
disposer d’IFNy recombinant et d’anticorps monoclonaux neutralisants pour démontrer
son actbn in vitro et in vivo (Nathan at al, 1983).
b) Mécanisme dépendant du TrvDtophane : L’IFNy induit la synthèse d’indolamine 2,3 dioxygenase (IDO) chez le monocyte (Ozaki, 1987) et le macrophage (Murray, 1989).
Cette enzyme intervient dans le catabolisme du tryptophane en rompant le cycle indole (1). Il y a alors formation de N - formylkynurénine qui se dégrade en kynurénine (2) en présence d’une enzyme constitutive ; la formamidase. Les conséquences de la dégradation du tryptophane sont la diminution de sa concentration intracellulaire et l’accumulation de métabolites toxiques. L’inhibition de la croissance des pathogènes sensibles à ce mécanisme semble être principalement due à la déplétion en tryptophane (Byrne and Turco, 1988). Dans les macrophages, activés par riFNy, ce mécanisme intervient dans l’inhibition du développement de différents pathogènes intracellulaires importants mais la destruction rapide et efficace de ces parasites semble principalement médiée par la voie oxydative (Murray, 1989).
,CH2^CHCOOH NH
+
02
--->
IDO
SX
.C0CH2pHC00H NH
HCOH ^
% NH2 y^^^C0CH2CHC00H
H2 FORMAMIDASE
Tryptophane N-foimyl kynurénine Kynurénine
(1) (
2
)c) mécanisme dépendant de I’ oxvde nitrique : Ce mécanisme de protection, induit par
riFN Y, consiste en une production d’oxyde nitrique à partir de la L-arginine. L’IFN y
'augmente la synthèse d’oxyde nitrique synthase qui dégrade la L-arginine en L-citrulline
et en oxyde nitrique (Moncada, 1992). L’oxyde nitrique , par sa structure de radical libre,
est très réactif et va former entre autre N02' et NO3-.
NH NH2 0 NH2
NH NH
(CH2)3 +02 mmque * Mn
1 synihaae I
CH CH
/\ / \
NH2 COOH NH2 COOH
L-Arginine - 02 ===-=*--- => CiïruNine - NO
La production d'oxyde nitrique déclenche une diminution de la concentration intracellulaire en fer provoquant l’inactivation de certains enzymes dont les sites actifs sont dépendants du fer. Plusieurs enzymes de l’hôte ou du pathogène peuvent être une cible potentielle (Park and Rikihisa, 1992) : NADPH ubiquinone oxydoréductase, succinate ubiquinone oxydoréductase, aconitase, ribonucléotide réductase. Il y a inhibition de la respiration mitochondriale ainsi que de la synthèse d'ADN. Les dérivés nitrés peuvent aussi agir directement sur l’ADN en le désaminant (Wink et al, 1991).
Le rôle de ce mécanisme a été mis en évidence in vitro en supprimant la synthèse d’oxyde nitrique au moyen d'arginase et de N - monomethyl - L- arginine, un inhibiteur de l’oxyde nitrique synthase. Il intervient notamment dans l’inhibition de pathogènes intracellulaires obligés tels que Ehrlichia risticii (Park and Rikihisa, 1992), Leishmania major (Green et al, 1990), Toxoplasma gondii (Langermans J.A.M. et al, 1992) et de pathogènes intracellulaires facultatifs tels que Mycobacterium bovis (Flesch et al, 1991).
In vivo, les macrophages activés par riFNy détruisent Leishmania major (Liew et al, 1990) et Francisella tularensis (Green et al, 1993) par un mécanisme dépendant de l’arginine.
d) mécanisme dépendant de la transferrine : La concentration intracellulaire en fer est régulée de différentes façons dont l’une d’elles est dépendante des récepteurs à la transferrine. Le fer est importé dans la cellule grâce à la présence sur la membrane de récepteurs à la transferrine. Ils sont composés de deux chaînes polypeptidiques identiques capables de fixer spécifiquement deux molécules de transferrine diferrique à
9
pH neutre. Lors de l’internalisation du complexe transferrine - récepteur, le pH acide de la vacuole permet la dissociation des ions fer de la transferrine. Le Fe3+ est réduit en Fe2+
avant d’être libéré dans le cytoplasme. Le fer importé dans la cellule va constituer le “pool labile” utilisable et est en équilibre avec les protéines contenant du fer.
L’IFNy diminue l’expression des récepteurs à la transferrine des monocytes humains (Byrd and Horwitz, 1989) et des macrophages murins (Weiel et al, 1985) ce qui provoque une dimunition du fer utilisable dans la cellule. Ce mécanisme intervient in vitro dans l’inhibition par l’IFN y du développement de Légionella pneumophila (Byrd and Horwitz, 1989) et Histoplasma capsulatum (Lane et al, 1991).
1.1.3. Activation des cellules non phagocytaires :
Le développement de certains pathogènes intracellulaires dans des cellules autres que les monocytes - macrophages est également inhibé efficacement par riFNy. Jusqu’à présent, les mécanismes d’inhibition impliqués sont les mêmes que ceux décrits précédemment. Ils varient d’un pathogène à l’autre et d’un type cellulaire à l’autre mais aussi selon que l’on se place dans un modèle d’infection humain ou murin.
a) cellules fibroblastiques: Dans les fibroblastes humains, riFNy inhibe le développement in vitro de Toxoplasma gondii ( Pfefferkorn, 1984) par un mécanisme dépendant du tryptophane. Par contre, dans les fibroblastes de souris l’IFNyne semble pas induire de dégradation du tryptophane (Turco and Winkler, 1986). L’inhibition in vitro du développement de Chlamydia trachomatis dans des fibroblastes de souris est médiée par un mécanisme dépendant de l’arginine (Mayer et al, 1993).
b) cellules épithéliales : Dans les cellules épithéliales humaines, l’inhibition du
développement in vitro de Chlamydia psitacci (Byrne et al, 1986) et Chlamydia
trachomatis (Shemer et al, 1987) par riFNy est levée par l’addition de tryptophane.
c) hépatocytes ; In vitro , riFNy inhibe le développement de Plasmodium berghei dans les hépatocytes de souris par un mécanisme dépendant de l’arginine (Mellouk et al, 1991).
1.1.4. Résumé :
L’IFNy apparait comme un des acteurs principaux de la résistance aux infections par des pathogènes intracellulaires. Il agit indirectement en stimulant la réponse immunitaire mais aussi directement en inhibant le développement du pathogène dans la cellule qu’il parasite. Les mécanismes (directs et indirects) d’inhibition du développement de pathogènes intracellulaires non viraux par riFNysont repris à la figure 1, page 13. Certains de ces mécanismes ont été mis en évidence in vitro , mais leur implication réelle in vivo dans les infections n’est pas connue. Par contre, le rôle protecteur de l’IFNy in vivo a été démontré dans de nombreux modèles, soit en utilisant des anticorps monoclonaux neutralisant riFNy endogène, soit en traitant les animaux avec de riFNy recombinant (Byrne et Turco, 1988).
1.2. Interféron alpha (IFN a)
Les IFNs a sont produits par les leucocytes et les cellules lymphoblastoides en réponse à une infection virale mais aussi à des parasites intracellulaires non viraux (Ho, 1984) tels que Chlamydia, Rickettsia, Listeria, etc... La production d’IFN a se fait principalement de manière non spécifique et indépendamment des molécules du CMH.
Les IFNs a agissent par l’intermédiaire d’un récepteur cellulaire différent de celui de l’IFN y et induisent l’expression d’un grand nombre de gènes. Certains produits de cette expression sont impliqués dans l’inhibition de la réplication virale. Une autre fonction importante de l’IFN a est la stimulation de l’expression des molécules de classe I du CMH.
L’IFNa a été étudié in vivo presque exclusivement dans des modèles d’infections
la vaccine (Werenne et al, 1985) et du rotavirus (Schwers et al, 1985) chez le bovin. L’IFN
a est produit rapidement au cours d’une infection et constitue une première défense,
non spécifique, qui diminue le taux de réplication virale et les effets pathogènes qui y
sont liés. En ce qui concerne les infections par des bactéries intracellulaires, on a nnontré
in vitro que l'IFN a inhibe le développement de pathogènes tels que Chlamydia (Byrne
and Rothermel; 1983) et Rickettsia (Kazar, 1971). Etant donné que ces bactéries
induisent la production d’IFN a in vivo il est raisonnable de penser que celui-ci puisse
jouer un rôle dans la résistance à ces pathogènes. Il n'y a, jusqu’à présent, pas
d’informations disponibles à ce sujet.
IFN
y/ . IL-2
wn
\
hépaJtocytes
Taux : lymphocyte auxiliaire - Te : lymphocyte cytotoxique (t : ce 11U le - C PA ; ce 11 u les prése ntatrice de l'a ntigè ne
Try : tryptophane - Divers : cellules endothéliales, fibroblastes, astrocytes.
FIG. 1. Mécanismes d’inhibition du développement de pathogènes intracellulaires non
viraux par l’IFN y.
2. INTERLEUKINES (ILs)
Les interleukines ont été définies au départ comme des molécules produites par les leucocytes et agissant sur les leucocytes. Depuis, de nombreuses études ont montré qu’elles pouvaient être produites par des cellules non - leucocytaires et avoir une action sur des cellules autres que les leucocytes. Dans ce chapitre, nous nous sommes intéressés aux propriétés des interleukines susceptibles de jouer un rôle dans la résistance aux pathogènes intracellulaires.
2.1. Interleukine 1 (IL-1)
L’IL-1 est produite par presque toutes les cellules nuclées mais le producteur principal semble être le monocyte. Sa production peut être stimulée par des produits bactériens (lypopolysaccharides), l’IFN y , le TNF (Oppenheim and Gerry, 1982) mais aussi par un contact direct lymphocyte T - CPA (Weaver et al, 1983).
L’IL-1 est nécessaire à l'activation des lymphocytes T par les CPA (v. figure 2, page 17).
Parmi les propriétés qui peuvent favoriser la résistance aux infections, on peut noter : - son rôle dans l’hématopoïèse; elle prolonge la survie des cellules hématopoïétiques primitives et en accroit la prolifération (Mochizuki et al, 1987).
- son rôle dans la réponse en anticorps: l’IL-1 participe à la prolifération des lymphocytes B et à leur différenciation en cellules sécrétrices d’anticorps (Chiplunkar et al, 1986; voir aussi la figure 2, page 17 ).
in vivo, riL-1 inhibe le développement de parasites intracellulaires tels que
Toxoplasma gondii (Chang et al, 1990), Listeria monocytogenes (Czuprinski and Brown,
1987) et Brucella (Zhan et al, 1991).
2.2. Interleukine 2 (IL-2)
L’IL-2, anciennement appelé facteur de croissance des cellules T (TCGF), est un produit des lymphocytes T activés par les CPA en présence de molécules co-stimulatrices (V. figure 2. page 17), (Robb, 1984). L’IL-2 produite par les cellules T peut agir de manière autocrine mais également paracrine en favorisant la croissance des lymphocytes cytotoxiques, des lymphocytes B et des cellules NK (Waldmann T.A., 1986). Les lymphocytes T secrétent en réponse à l'IL-2 d’autres lymphokines telles que l’IFN y et le TNF.
L’IL-2 peut jouer le rôle de co-facteur dans l’activation des macrophages par l’IFNyet elle inhibe le développement de Brucella abortis dans ces cellules (Jiang and Baldwin, 1993). Il est également capable d’inhiber le développement, in vivo, de Toxopiasma gondii (Sharma et al, 1985), Trypanosoma cruzi (Choromanski and Kuhn, 1985) et
Escherichia coli (Teck Chong, 1987).
2.3. Interleukines 3, 4, 5 et 6
Les interleukines 3, 4 et 5 sont produites essentiellement par les lymphocytes T activés. L’IL-6 est produite également par de nombreuses autres cellules. Les interleukines 3, 5 et 6 jouent un rôle important dans l’hématopoïèse en stimulant différents stades de différenciation des cellules de la moelle osseuse. L’IL-3 a la propriété d’agir sur les cellules souches les plus immatures.
L’IL-4 et 6 sont des co-activateurs des lymphocytes T , en synergie avec l’IL-1 et l’IL-2.
L’IL-6 s’est révélé être le principal facteur impliqué dans la génération des lymphocytes T cytotoxiques (v. figure 2, page 17).
Enfin, les ILs 4 et 5 favorisent l’activation et la prolifération des lymphocytes B. L’IL-6
agit sur les lymphocytes B activés en augmentant la production d’anticorps. Bien que l’IL-6
montré récemment qu’elle inhibait in vitro le développement de Plasmodium dans des
hépatocytes de souris. De plus, un traitement à l’IL-6 recombinante protège les souris
contre Listeria monocytogenes (Liu et al, 1992).
iL-5 T
aux: macrophage - TC ; lymphocyte cytotoxique T AUX : lymphocyte auxiliaire - B : lymphocyte B
IL-2R : récepteur à l'IL-2 - Y - .
FIG. 2. Régulation positive de la réponse des lymphocytes par les cytokines (adapté de
Dodet, 1986).
3. FACTEUR NECROSANT DES TUMEURS (TNF)
On distingue deux TNFs présentant 30 % d’homologie dans leur séquence d’acides aminés. Le TNF a est produit par les monocytes, les macrophages et les cellules tueuses en réponse à une stimulation par l’IL-2, l’IFN y, les virus, les bactéries et leur produits (Alm, 1987), Le TNF P (ou lymphotoxine) est produit par les lymphocytes T activés (Aggerwal et al, 1985).
Le TNF induit sa propre production et la production d’lL-1 par différentes cellules et, dans certains cas, agit en synergie avec l’IFN y. Le TNF et l’IL-1 ont de nombreuses activités biologiques en commun notamment dans les réactions inflammatoires (v. chapitre immunopathologie, page ), comme agents mitogènes des fibroblastes et dans l’activité antivirale médiée par l’IFN p (Le and Vilcek, 1987).
In vitro , le TNF est capable de détruire sélectivement des cellules infectées par un virus, et d’inhiber le développement intracellulaire de pathogènes tels que Trypanosoma cruzi (De Titto et al, 1986), Chlamydia trachomatis (Shemer et al, 1988) et Rickettsia conorii (Manor and Sarov, 1990). In vivo, des traitements avec du TNF recombinant protègent des souris contre Listeria monocytogenes (Desiderio et al, 1989), Leishmania (Titus et al, 1989) et Toxoplasma gondii (Chang et al, 1990).
4. MYELOPEROXYDASE (MPO)
4.1. Introduction
La myéloperoxydase (MPO) est une enzyme contenue dans les granules primaires des
neutrophiles et dans les monocytes (Locksiey and Klebanoff, 1983). L’enzyme mature de
150 kDa comporte un hème essentiel a son activité. La perte en granules primaires, in vitro
et in vivo , par les monocytes s’accompagne d’une diminution de l’activité antimicrobienne
macrophages, lors de la culture in vitro des monocytes et au cours de la phagocytose.
Dans ce dernier cas, la MPO est libérée soit dans les phagosomes, soit dans l’environnement extracellulaire.
4.2. Action antimicrobienne
La MPO augmente la toxicité des produits du métabolisme oxydatif. Elle est capable, en présence de peroxyde d’hydrogène (H2O2) et d’halogénures, de former des produits très toxiques. Des halogènures tels que le chlorure, bromure, iodure et thiocyanate peuvent réagir avec l’H202. Dans les conditions physiologiques, du Cl ‘ est présent dans les phagocytes en concentration supérieure à celle requise pour induire la cytotoxicité. Il est donc le principal responsable de l’activité antimicrobienne de la MPO en se transformant en hypochlorite et en acide hypochlorique (Locksiey and Klebanoff, 1983).
Les réactions catalysées par la MPO sont les suivantes:
H2O2 +2 Cr ===> 2 HOCI' (acide hypochforique)
H2O2 + Cl' ===> H2O + OCI' (hypochlorite)
H2O2 +2 Br- ===> H2O + 2 OBr-
H2O2 + 2 I ■ ==> H2O + 2 HOI -
Les produits du système H2O2 / MPO / halogénure agissent surtout au niveau des
membranes des cellules et des pathogènes en l’halogénant et en l’oxydant. De
nombreuses études, in vitro, ont montré qu’un grand nombre de pathogènes extra - et
intracellulaires non viraux sont efficacement détruits par ce mécanisme (voir tableau 1).
Les produits du système H2O2 / MPO / halogénure pourraient également agir directement sur les protéines. L’ étude in vitro de la modification des protéines virales du virus Influenza par la MPO en présence d’H2O2 appuie cette hypothèse. La MPO agit à trois niveaux; Elle dégrade les protéines virales, elle modifie leur structure tridimensionelle ou leur ajoute un composé de charge positive et induit la formation d'aggrégat viral insoluble (Yamamoto et al, 1991). La MPO pourrait également intervenir dans des phénomènes de cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps impliquant les neutrophiles et dirigés contre des cellules Infectées par des virus (Siebens et al, 1979;
lhara et al, 1984).
Le mécanisme H2O2 / MPO / halogénure est amplifié par riFNy qui augmente la quantité d’H202 et de MPO produite par les monocytes et neutrophiles. L’IFNy provoque également la dégranulation avec libération de MPO. Le TNF et l’IL-1 augmente l’adhérence des neutrophiles à l’endothélium vasculaire, la poussée respiratoire et la quantité de MPO produite, et enfin provoquent la dégranulation des neutrophiles (Ferrante, 1989).
in vivo, le rôle de la MPO a été mis en évidence chez la souris dans les infections par le
pathogène extracellulaire Naegieria (Ferrante, 1991). La MPO (non recombinante) a un
effet thérapeutique dans un modèle murin d’infection par Candida (Wright and
Nelson,1985). En ce qui concerne les pathogènes intracellulaires, obligés ou facultatifs, il
n’y a pas d’informations concernant le rôle de la MPO in vivo.
TABLEAU 1 : Pathogènes sensibles à la MPO.
Pathogènes Références
Système sans Toxoplasma gondii Locksiey and Klebanoff, 1983
cellule Leishmania donovani • 1 Leishmania tropica • 1 Leishmania braziliensis
ftTrypanosoma cruzi
I»Candida albicans Tournay et al, 1993
HIV Moguilevsky et al, 1993
virus infiuenza Yamamoto et al, 1991
Pathogènes Cellules Références
Système avec cellule
Naegleria fowleri Torulopsis glabrata Candida albicans
neutrophiles humains
«1
Ferrante et al, 1987 Ferrante, 1989
tf
Toxoplasma gondii neutrophiles murins monocytes humains
Locksiey and Klebanoff, 1983
Leishmania donovani neutrophiles murins monocvtes humains
Leishmania tropica neutrophiles murins monocytes humains
HIV monocytes humains Chase and Klebanoff,
1992
CHAPITRE II: IMMUNOPATHOLOGIE
Dans certaines circonstances, la réponse immunitaire est responsable d’une partie, voire de la totalité, des lésions et réactions pathologiques occasionnées par l’agent infectieux. Les réponses inflammatoires par exemple sont à l’origine de la pathologie de nombreuses maiadies des vertébrés y compris ia cow/driose. Les cytokines jouent un rôle prépondérant dans les procéssus inflammatoires. Lorsque la production de certaines d’entre-elles est accrue de façon exagérée et prolongée, cela peut aboutir à la mort de l’hôte. La description des cytokines ies plus importantes et de leur mode d’action dans des modèles in vitro et in vivo des réactions inflammatoires est abordée dans ce chapitre.
Récemment des progrès importants ont été réalisés dans le domaine de l’immunologie cellulaire. La classification des lymphocytes T, acteurs incontournables dans la résistance aux pathogènes intracellulaires, peut se faire en fonction des différentes cytokines qu’ils produisent. Celles - ci peuvent influencer l’issue d’une réponse immunitaire à un pathogène en inhibant l’activation et la prolifération d’une sous - classe de lymphocytes T.
La régulation négative de l’immunité à médiation cellulaire exercée par les cytokines fait également l’objet de ce chapitre.
1. REACTIONS INFLAMMATOIRES
1.1 Introduction : Les réactions inflammatoires peuvent être locales ou généralisées
et d’intensité très variable. Elles sont caractérisées notamment par l’apparition: de fièvre,
d’une dilatation des vaisseaux sanguins, d’une augmentation de la perméabilité vasculaire
avec passage de fluide au travers des vaisseaux sanguins (oedèmes) et d’une infiltration
de leukocytes au niveau des tissus. Dans les cas les plus graves, on observe une
et la mort. Les cytokines sont considérées comme étant les premiers facteurs qui déclenchent la cascade d’évènements régulant les réponses inflammatoires (Heremans et al, 1989). Certaines d’entre - elles sont responsables de l’induction et de la libération d’autres facteurs connus depuis longtemps comme médiateurs de l’inflammation (prostaglandines, leukotriènes, PAF, protéases, histamines,...). Les réactions inflammatoires ne sont pas dues à une cytokine produite en large quantité mais plutôt à l’expression d’une série de cytokines qui constituent un réseau de signaux intercellulaires.
1.2. Fièvre : L’IL-1 et l’IL-6 exercent une action pyrogénique en induisant la synthèse de prostaglandines qui agissent au niveau de l’hypothalamus. La fièvre peut être combattue avec des inhibiteurs de la cyclooxygenase (Ibuprofen). Le TNF est également pyrogénique en partie par l’induction d’IL-1 (Le and Vilcek, 1987).
1.3. Chimiotactisme et infiitration: L’IL-1 est chimiotactique pour les neutrophiles.
L’IL-8, produite par les monocytes activés et les cellules endothéliales, est également chimiotactique pour les neutrophiles et les basophiles. L’adhésion des leucocytes aux cellules endothéliales précède l’infiltration de ces cellules vers l’espace extravasculaire.
L’IL-1, le TNF et l’IFN
yfavorisent l’adhésion des leucocytes aux cellules endothéliales par un mécanisme impliquant la régulation de l’expression de molécules à la surface des leukocytes et des cellules endothéliales vasculaires (Roitt, 1993).
1.4. Perméabilité vasculaire: l’IL-1 et le TNF augmentent directement la perméabilité
des cellules endothéliales. On a montré, in vitro, sur des cellules endothéliales bovines,
que riL-1 et le TNF augmentaient de manière significative la perméabilité de l’endothélium,
sans provoquer de lyse cellulaire ni d’espacement entre les cellules (Royall et al, 1989). In
vivo, le TNFa recombinant augmente la formation d’oedèmes et la perméabilité vasculaire dans les poumons de lapins traités (Goldblum et al, 1989).
Dans les réactions de Schwartzman, on observe suite à l’injection de lipopolysaccharides de Serratia marcescens , l’apparition d’hémorragies résultant d’une augmentation considérable de la perméabilité vasculaire. Un traitement au moyen d’anticorps neutralisant I’IFN
yprotège complètement les souris (Heremans et al, 1989). La malaria cérébrale peut être observée lors d’une infection par Plasmodium berghei. Les symptômes principaux sont : L’accumulation de macrophages dans les capilaires cervicaux et la présence de foyers hémorragiques dans les méninges. La mort survient +/-15 jours après l’infection. Dans ce modèle, les souris sont protégées par un traitement avec des anticorps anti TNFa mais aussi anti IFN7. On a montré que l’IFNy produit par les lymphocytes T auxilliaires était responsable de l’activation des macrophages et de la production de TNF a. De plus, l’accumulation de macrophages est médiée par l’IL-3 et le GM - CSF (“ granulocyte macrophage - colony stimulating factor”), (Grau et al, 1989).
1.5. Mort cellulaire: le choc endotoxinique est dû à la production d’endotoxine par les
bactéries Gram - . Les infections sévères provoquent une réaction inflammatoire aiguë
avec nécrose de certains organes et finalement la mort. In vivo , l’administration d’anticorps
neutralisant le TNF a protège des souris contre les effets létaux des endotoxines (Beutler
et al, 1987). De plus, l’injection de doses importantes de TNF induit un état de choc
accompagné d’hémorragies et de nécrose des intestins, reins et poumons. Plus
récemment, une étude à montré chez la souris le rôle protecteur d’anticorps anti - IL-6
impliquant donc aussi cette cytokine dans les phénomènes de choc endotoxinique
(Heremans et al, 1992).
2. IMMUNOREGULATION NEGATIVE
La classification des lymphocytes T en fonction de leur profil de production de cytokines est reprise dans le tableau 2. Ces différentes sous-classes ont également été mises en évidence chez l’homme (Romagnani, 1991) et, plus récemment chez le bovin (Brown, 1993). Dans les infections par des pathogènes intracellulaires obligés ou facultatifs, l’IFNy et l’IL-2 ont depuis longtemps été associés à la résistance ou l’immunité.
Cependant, des études récentes ont montré que ces cytokines peuvent également intervenir dans les réactions immunopathologiques. Plus récemment, les lymphocytes Th2, et les cytokines qu’ils produisent, ont été associés à la progression de l’infection et à la suppression des réponses immunitaires dues aux Thi. Les acteurs principaux en sont l’IL-4 et l’IL-10.
In vitro , riL-4 inhibe la prolifération des lymphocytes dépendant de l’IL-2 en diminuant la synthèse des récepteurs à l’IL-2 (Martinez et al, 1990). Deuxièmement, il empêche l’activation des macrophages et de leur activité antimicrobienne par riFNy (Lehn et al, 1989). Troisièmement, il inhibe la production d'IL-1 (l’IL-1 est un co-facteur essentiel à l’activation spécifique des cellules T, v. chapitre IL-1 page14) et de TNFa par les macrophages (Hart et al, 1991). Enfin, l’IL-4 peut bloquer (Liew and Cox, 1991) la synthèse d’oxyde nitrique par le macrophage (celui-ci intervient dans la destruction de certains parasites).
Les mécanismes d’inhibition des réponses cellulaires par l’IL-10 ont fait l’objet d’études récentes. L’IL-10 inhibe, in vitro , l’activation des lymphocytes T spécifique d’un antigène en diminuant l’expression des molécules de classe II du CMH à la surface des macrophages et donc leur capacité à présenter l’antigène (De Waal-Malefyt et al, 1991).
L’IL-10 inhibe également la production de cytokines par les macrophages (De Waal-
Malefyt, 1991a), leur activation par riFNy ( Silva et al, 1991) et la production de dérivés
Dans le modèle murin de la leishmaniose viscérale, les souris Balb/c succombent à une infection expérimentale par Leishmania major alors que les C57BL76 sont résistantes. Les cellules T auxiliaires des Balb/c infectées produisent de l’IL-4 et de l’IL-10 alors que les C57BL/6 produisent de l’IFN y et de l’IL-2. Un traitement avec des anticorps neutralisant riFNy abolit la résistance des C57BL/6 alors que des anticorps neutralisant l’IL-4 protègent les Balb/c contre Leishmania (Holoday et al, 1991). De plus, chez les souris Balb/c infectées et traitées aux anticorps anti IL-4 on observe une réapparition de Thi produisant l’IFN y ce qui démontre le rôle de l’IL-4 en tant que régulateur négatif de la prolifération des Thi (Heizel et al, 1991).
ThO Th1 Th2 Tcytotoxique
IFN 7 IFN 7
-IFN 7
IL-2 IL-2
- +1
-IL-3 IL-3 IL-3 IL-3
IL-4
-IL-4
-IL-5
-IL-5
-- -
