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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository
Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:
Callens, N. (2002). Régulation transcriptionnelle du gène suppresseur de tumeur "brca2" chez la souris (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.
Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/211353/1/7fb9fb71-9e4a-4ada-ad92-15aa632c4d3f.txt
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D Erasme
BiWiotheque de Médecine - CP 607 Route de Lennick, 808 (Bât.E)
B- 1070 Bruxelles Tél.; 02/555.61.70
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
Faculté de Médecine
Promoteur de thèse : Professeur Yvan de Launoit U.L.B, Laboratoire de Virologie Moléculaire Co-promoteur de thèse : Docteur Jean-Luc Baert
Institut de Biologie de Lille, UMR 8117, CNRS
Régulation Transcriptionnelle du Gène Suppresseur de Tumeur brca2 chez la
Souris
Nathalie CALLENS
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales
2002
Tho^^gO
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
Faculté de Médecine
Promoteur de thèse : Professeur Yvan de Launoit U.L.B, Laboratoire de Virologie Moléculaire Co-promoteur de thèse : Docteur Jean-Luc Baert
Institut de Biologie de Lille, UMR 8117, CNRS
Régulation Transcriptionnelle du Gène Suppresseur de Tumeur brca2 chez la
Souris
Nathalie CALLENS
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales
2002
Ü^merciements
Aux membres de ce jury qui m’ont fait l’honneur déjuger cette thèse.
Monsieur le Professeur Marc Abramovicz Monsieur le Professeur Vincent Bours Monsieur le Professeur Daniel Christophe Monsieur le Professeur 7ea/i Feunteun Monsieur le Professeur Michal Svoboda Monsieur le Professeur Gilbert Vassart
Monsieur le Professeur Jea/i-LMC Baert, Co-Directeur de thèse Monsieur le Professeur Yvan de Launoit, Directeur de thèse
* Mes plus sincères remerciements.
Au terme de ce travail, je voudrais remercier tout particulièrement Yvan de Launoit.
Tu as pris le ‘risque’ de m’intégrer au sein de tes deux laboratoires ; l’un à Bruxelles et l’autre à Lille. Même s’il en restera des traces, cette belle aventure touche à sa fin. Je me souviendrai de ton optimisme à toutes épreuves, ta gentillesse et ta simplicité. Ce manuscrit me permet de te témoigner ma sincère admiration tant sur le plan scientifique que sur le plan humain.
Un grand merci à Jean-Luc Baert, mon promoteur d’adoption à Lille. Une grande partie de ce travail n’aurait pas été possible sans ta contribution. Tu es intervenu au moment de mon parcours initiatique où l’ADN s’est accompagné de partenaires protéiques. Je regretterai nos réunions quotidiennes ; le café pour bien commencer la journée et les discussions à propos d’éventuels contrôles à ajouter (histoire d’être sûrs de ne pas raconter n’importe quoi !). Ce travail est aussi un peu le tien. Pour ta gentillesse, ta compétence, ton enthousiasme et surtout pour tout le reste, merci !
Un grand merci au Professeur/acçues Simard qui m’a accueillie dans son laboratoire
à Québec ti Martine Dumont qui m’a beaucoup appris.
Je remercie Carine Van Lint ainsi que tout le personnel de son laboratoire pour leur collaboration dans ce travail. Je remercie tout particulièrement Nan de m’avoir fourni des outils indispensables à ce travail.
Je remercie Agnès Bègue. Tu as guidé mes premiers pas dans ma carrière d’apprentie scientifique. Pour ton aide et ton soutien, merci !
Je remercie tout particulièrement lolanda Mazza, de son aide, son optimisme et sa bonne humeur. Ton rire et ton sourire auront illuminé mon passage dans le laboratoire de Bruxelles.
Je tiens également à remercier Philippe Maurer. En plus d’être un lien Bruxelles-Lille (vive les ragots!), tu as été un ami très cher. J’ai apprécié ton écoute et ton soutien dans certains moments difficiles. Merci pour ta gentillesse et ta compréhension.
A toutes les autres personnes du laboratoire de Bmxelles, Carmen, Perrine, Racket, France, Pascale, Nicole, Isabelle, Mary-Lou et les autres, pour leur accompagnement tout au long de ce travail, merci !
Je remercie Didier Monté, la mauvaise foi incarnée, de ses conseils. Tu as su faire abstraction (enfin un peu !) du fait que je suis une femme, une belge et une blonde pour me guider dans mon travail. Tu as été indispensable à mon défoulement quotidien.
Je remercie tout particulièrement Zoulika Kherrouche de son soutien durant tout ce travail de thèse. Je te souhaite bonne route....
Je remercie Laurent Goutte de m’avoir appris un vocabulaire sans lequel il m’aurait été difficile de communiquer dans ce laboratoire.
Je remercie Anne Chotteau. Tu as été ma colocataire de bureau. Tu as su écouter mes
plaintes et râleries sans jamais sourciller. Tu m’as souvent aidée à remonter ma glycémie avec
tes petits biscuits. Pour ta bonne humeur tout au long de ces années, merci !
Je remercie également Isabelle Damour, Anne Flourens et Nathalie Tomavo. Nos discussions à la paillasse café m’ont aidée à rendre la vie du laboratoire plus agréable.
Je tiens à remercier toutes les personnes de rUMR 8117 et de l’UMR 8526 que je n’ai pas citées mais qui ont contribué chacune à leur façon à la réalisation de ce travail de thèse. Je pense particulièrement aux dames de la laverie qui, dans la bonne humeur, ont participé tous les jours à cette thèse.
Merci également au Professeur Dominique Stéhelin de m’avoir accueillie à l’Institut de Biologie de Lille.
J’adresse un grand merci au Docteur/ea/i Dubuisson de m’avoir accordé sa confiance pour l’année prochaine.
»
J’adresse un grand merci à mes parents et à ma famille qui ont toujours cru en moi et m’ont permis de réaliser mes études.
Enfin, je voudrais remercier Héloïse, ma fille. Ta naissance a été un tournant majeur de mon existence. Ton rire et tes mimiques m’ont encouragée tout au long de ce travail. Grâce à toi, j’ai appris à prendre du recul vis-à-vis de la vie en général et de la biologie en particulier.
Je ne saurais conclure ces remerciements sans en adresser un tout particulier à Tomy.
A chaque instant tu as été au cœur de ce travail, tu as été à l’écoute jour après jour. Tu as accepté mes absences et compris mes moments de désespoir et toujours tu as su me redonner confiance. Sois assuré de tout mon Amour.
Enfin, je dédie cette thèse àRudy, l’homme aux dix doigts d’or...
Qrand est k vide que tu nous as Caissé
Mais si cfïers sont [es souvenirs passés.
ABREVIATIONS
ADN Acide DéoxyriboNucléique
ADNc Acide DéoxyriboNucléique complémentaire
AP-1 Activator Protein 1
ARN Acide RiboNucléique
ARNm Acide RiboNucléique messager ARN polll ARN polymérase de type II ATF Activating Transcription Factor
ATP Adénosine TriPhosphate
BRCAl Breast Cancer de type 1 BRCA2 Breast Cancer de type 2
CRE cAMP Responsive Elément
CREB CRE binding Protein
CREM CREB Modulator
DBD DNA Binding Domain
DRIP vitamine D3 Receptor Interacting Protein
EBS 'ETS Binding Site
ELFl E74-Like Factor
ELKl ETS-like 1
ERF Ets2 Repressor Factor
ERG Ets Related Gene
ERM Ets Related Molécule
ESEl Epithelium Spécifie Etsl
ETS E-Twenty-Six
ETSl E-Twenty-Six oncogene 1
ETS2 E-Twenty-Six oncogene 2
ETVlà6 Ets Translocation Variant 1 à 6
EWS Ewing Sarcoma
FEV Fith Ets Variant
FUI Friend Leukemia Intégration I
FOS Finkel Biskis jinkins Osteosarcoma oncogene
GABP GA Binding Protein
GST Glutathione S-Transferase
HAT activité Histone Acétyl Transferase HDAC activité Histone DéAcétylase
HLH Helix-Loop-Helix
HTH Helix-Tum-Helix
JUN JU-Nana ( dix-sept en japonais)
LEFl Lymphocytes Enhancer binding Factor I
MED MEDiator
NCoR Nuclear receptor CoRepressor
Net New ETs factor
NF k B Nuclear Factor Kappa B
FAX facteur de transcription à domaine Paired boX
PCAF p300/CBP Associated Factor
PEA3 Polyomavirus Enhancer A binding protein 3
PIC Préinitiation Complex
PUl Purine rich 1
SMCC SRB/MED Containing Cofactor
SMRT Silencing Mediator for Retinoic acid and Thyroid hormone receptors
SRB Suppressor of RNA polymerase B
TAF TBP Associated Factor
TBP TATA Binding Protein
TEL Translocated Ets Leukemia
ZF Zinc Finger
NOMENCLATURE ‘
Pour l’écriture des gènes, des transcrits et des protéines, nous avons suivi la nomenclature suivante :
Les noms des gènes sont toujours en lettres minimales et en italique Les noms des transcrits sont en lettres minuscules
Les noms des protéines sont en lettres Majuscules
Les mots anglais sont en italique
Avant-propos
Le cancer est une maladie complexe caractérisée par une prolifération anormale des cellules. Presque tous les tissus de notre organisme peuvent être affectés par ce dérèglement dont les causes, les évolutions et les conséquences sont très diverses.
Il existe plus d’une centaine de maladies cancéreuses. Parmi les différents types de cancers, le cancer du poumon est la forme de cancer la plus fréquente chez l’homme (17%) suivi du cancer colorectal (13%). Chez la femme, le cancer du sein représente près de 30%
des cas de cancers. On estime que 5 à 10 % de ces cancers du sein seraient d’origine héréditaire.
Le cancer du sein, considéré comme un problème de santé publique, préoccupe depuis plusieurs années des équipes de chercheurs. Des progrès dans le domaine de la biologie moléculaire ont permis d’identifier deux gènes, brcal et brca2, impliqués dans la transmission héréditaire du cancer du sein. Un déficit fonctionnel de ces gènes concerne près de 85% des cas de cancer du sein héréditaire.
Récemment, ces gènes ont été impliqués dans certains cancers du sein d’origine sporadique où l’on observe des variations dans leurs niveaux d’expression. En effet, 20% des cancers du sein d’origine sporadique surexpriment l’ARN messager du gène brcal. Ainsi, il nous a semblé intéressant d’étudier les mécanismes moléculaires qui sont à la base du contrôle de la régulation transcriptionnelle de ce gène.
L’étude de la régulation du gène brcal chez l’homme a été entamée. Une région
promotrice minimale a été définie et des sites fonctionnels pour plusieurs facteurs de
transcription ont été identifiés. En revanche, alors que la souris représente le modèle in vivo le
plus utilisé pour l’étude de la cancérogenèse mammaire, aucune information concernant
l’organisation génomique et les mécanismes présidant la régulation du gène murin ne sont
aujourd’hui connus. Nous nous sommes donc proposés d’établir dans un premier temps
l’organisation génomique du gène brcal chez la souris et ensuite d’entamer l’étude de la
régulation transcriptionnelle de ce gène.
INTRODUCTION 6
I. LE CANCER DU SEIN...6
A. E
pidemiologie... 6
B. L
esgenesimpliquesdanslaformationdetumeurs...7
1. Les proto-oncogènes...8
2. Les gènes suppresseurs de tumeur... 9
2.1. Le principe de Knudson... 9
2.2. Exemples de gènes suppresseurs de tumeurs... 9
2.3. Les protéines de la famille BRCA... 10
2.3.1. Les gènes brcal et hrca2 sont des gènes suppresseurs de tumeurs.... 11
2.3.2. Epidémiologie des cancers du sein familiaux attribués à des mutations * dans les gènes brcal et brca2... 12
2.3.3. Caractérisation des gènes brcal et brca2...13
2.3.4. Expression des transcrits brcal et brca2... 15
2.3.5. Les fonctions des produits des gènes brcal et brca2...17
2.3.6. Invalidation des gènes brcal et brca2 chez la souris... 23
2.3.7. Implication des gènes brcal et brca2 dans les cancers du sein d’origine sporadique...25
II. LA REGULATION TRANSCRIPTIONNELLE...:...26
A. L
esacteursdelarégulationtranscriptionnelle... 26
1. La chromatine... 27
1.1. Modifications des nucléosomes...28
1.1.1. Modifications covalentes...28
1.1.2. Modifications non covalentes des histones... 30
1.2. Modification de l’ADN : la méthylation... 31
2. La machinerie basale de la transcription... 32
3. Les facteurs régulateurs... 34
3.1. Principaux domaines fonctionnels...34
3.1.1. Les domaines de liaison à l’ADN... 34
3.1.2. Les domaines régulateurs de la transcription... 36
3.2. Modulation de l’activité des facteurs de transcription...36
3
3.2.1. Partenaires protéiques... 37
3.2.2. Modifications post-traductionnelles...37
4. Les cofacteurs transcriptionnels... 38
4.1. Les coactivateurs...39
4.2. Les corépresseurs...39
B. L
esproteinesdelafamilleCREB/ATF
etdelafamilleE
ts... 40
1. Les facteurs de transcription de la famille CREB/ATF... 40
1.1. Les membres de la famille CREB/ATF... 41
1.2. Les facteurs CREB/ATF et la régulation transcriptionnelle... 41
1.3. Les rôles biologiques des facteurs de transcription CREB... 43
2. Les facteurs de transcription de la famille Ets... 45
2.1. Les membres de la famille Ets... 45
2.2. Les facteurs Ets et la régulation transcriptionnelle... 46
2.3. Les rôles biologiques des facteurs Ets...47
C. R
égulationtranscriptionnelledesgenesbrcaI
etbrca2... 48
1. Le promoteur du gène brcal...49
2. Le promoteur du gène brca2... 50
RESULTATS...52
/. Contexte...53
2. Etude de l'organisation génomique du gène brca2 murin...54
3. Les facteurs de transcription de la famille Ets, et CREB régulent l'expression du gène brca2 murin...'... 63
4. Les facteurs de transcription de la famille CREB et de la famille Ets interagissent via leurs domaines de liaison à l'ADN... 99
5. L'interaction des facteurs de transcription CREB avec le cofacteur CBP /p300 n 'est pas nécessaire à l'activation du promoteur minimal du gène brca2 murin...100
6. Le mécanisme de régulation du promoteur minimal du gène brca2 murin n 'est pas spécifique de la glande mammaire...101
7. Le promoteur minimal du gène brca2 murin est-il bi-directionnel ?...102
DISCUSSION ET PERSPECTIVES... 104
L LE GENE BRCA2 CHEZ LA SOURIS...105
IL LA REGULATION TRANSCRIPTIONNELLE...107
A. L
epromoteurminimal... 107
B. L
esfacteursrégulateurs...108
1. Le siteEBS... 108
2. Le site CRE... 110
3. La coopération ETS/CREB... 111
4. L'expression tissu spécifique... 114
BIBLIOGRAPHIE... 117
5
I. LE CANCER DU SEIN
A. Epidémiologie
Le cancer du sein est la malignité la plus fréquente chez la femme et représente dans les pays occidentaux un problème de santé public. On estime aujourd’hui qu’une femme sur 10 en sera atteinte à un moment de sa vie. Depuis les années 1950, on constate une augmentation régulière de l’incidence des cas de cancer du sein. Cette augmentation est de l’ordre de 2% par an (http://www.medisite.fr/femmes.cancersein). Les principaux facteurs de
* risque sont, entre autres :
- L’âge : deux tiers des cancers du sein surviennent après 50 ans. La maladie est rare chez les femmes de moins de 25 ans et tout à fait exceptionnelle en dessous de 20 ans.
- Le sexe : 99% des cancers du sein concernent des femmes.
- L’âge de la première grossesse : Le risque de cancer du sein est plus élevé chez une femme ayant eu une première grossesse après 30 ans que chez une femme ayant eu une première grossesse à 20 ans. Ce risque est encore plus élevé chez les femmes n’ayant pas eu d’enfants.
- Les facteurs hormonaux : Le risque de cancer du sein peut être corrélé à la durée d’exposition aux œstrogènes. C’est ainsi que ce risque augmente chez les femmes ayant eu l’apparition précoce de menstruations et chez les femmes ménopausées sous traitement de substitution aux œstrogènes.
- L’environnement : Les femmes d’origine asiatique ont un risque moindre
de développer un cancer du sein par rapport aux femmes occidentales. Ce
risque s’égalise chez les populations asiatiques immigrées dans les pays
occidentaux après la deuxième génération. Les habitudes alimentaires
semblent jouer un rôle dans l’augmentation du risque de cancer du sein
puisque l’obésité augmente ce risque de 20 % et l’alcoolémie l’augmente
d’environ 200%.
ligand
Figure 1 : Représentation schématique des événements cellulaires aboutissant à
^expression de protéines contrôlant la progression du cycle cellulaire.
1. Interaction du ligand avec son récepteur spécifique.
2. Activation de cascades de signalisation (transduction)
3. Activation de facteurs de transcription (en vert) et passage dans le noyau dans le noyau (translocation),
4. Régulation de l’expression de gènes codant pour des protéines (en jaune) contrôlant la
progression du cycle cellulaire (réponse cellulaire).
Les antécédents familiaux : L’existence d’un cancer du sein survenu avant 50 ans chez la mère ou une sœur, multiplie par plus de deux fois la probabilité de développer un tel cancer. On estime que 5 à 10 % des cas de cancer du sein sont d’origine héréditaire.
Le nombre de décès dû au cancer du sein augmente mais de manière plus faible que l’incidence des cas, soit environ 0,5 % par an, et concerne surtout les femmes âgées de 60 à 75 ans, alors qu’il reste stable en dessous de 44 ans. Ceci est probablement lié à une détection précoce de la maladie ce qui entraîne une meilleure prise en charge des patientes. La mammographie et l’autopalpation sont aujourd’hui les seules techniques ayant démontré leur efficacité en terme de prévention.
Au-delà de la maladie, le cancer représente pour les biologistes une énigme passionnante. Depuis plus de 20 ans, des recherches sont réalisées afin de mettre en évidence les mécanismes moléculaires impliqués dans la transformation d’une cellule normale en une
»
cellule cancéreuse. Les résultats, venus de divers horizons de la biologie, ont permis de rendre compte de cette énigme en termes moléculaires grâce à l’identification de gènes du cancer : les proto-oncogènes et les gènes suppresseurs de tumeur.
B. Les gènes impliqués dans la formation de tumeurs.
Dans les conditions normales, une cellule ne se divise que si elle en a reçu l’ordre. Cet
ordre prend naissance à l’extérieur de la cellule pour se terminer dans le noyau (figure 1). Ce
sont un ou plusieurs facteurs de croissance se trouvant dans le milieu intercellulaire qui, en se
liant à leurs récepteurs spécifiques sur la membrane des cellules, vont déclencher une cascade
d’événements (transduction) dans le cytosol. Ces événements font intervenir une série de
protéines dont la plupart sont des kinases. Le signal est ensuite transmis au noyau
(translocation) et aboutit à l’activation de facteurs de transcription qui vont activer la
transcription de gènes responsables du contrôle de la croissance cellulaire tels que les cyclines
(figure 1). Les gènes intervenant dans les différentes étapes de cette voie de signalisation sont
importants pour le fonctionnement normal de la cellule. Ces gènes peuvent être répertoriés en
Classification Exemples Exemples références
d’oncogènes de cancers
•Facteurs de PDGF Sein et cerveau Escobedo et ai, 1988
croissance ou Neu(erb-B2) Sein, ovaire et glandes Slamonera/., 1989
récepteurs pour les salivaires
facteurs de RET Thyroïde Eng,1997
croissance
KGF (Hst) Estomac Sugimuraeta/.,, 1990
•Protéines Ras Poumon, ovaire, côlon, sein Bos et al., 1988
intervenant dans les Trk Côlon Martin-Zanca et al.,.
cascades 1986
cytoplasmiques v-src Côlon, leucémie Morris et ai, 1989
•Facteurs de c-myc Leucémie, poumon, sein Yokota et ai, 1986
transcription N-myc Cerveau Yokota et ai, 1986
L-myc Poumon Nau et ai, 1985
•Protéines Bcl-2 Prostate, sein, lymphomes Ruvolo et ai, 2001;
intervenant dans les Haldaretn/., 1997
mécanismes
d’apoptose Bcl-xL Pancréas Ghaneh et ai, 2002
•Protéines issues de Translocations de Alava et ai, 2001
translocations EWS-un
chromosomiques membre de la Sarcomes d’Ewing
Pettretai, 1997 famille Ets
Tableau 1 : Liste non exhaustive de differents oncogènes classés d’après leur
fonction normale dans la cellule.
deux familles : a) Les proto-oncogènes impliqués dans la stimulation de la croissance cellulaire et b) les gènes suppresseurs de tumeur qui au contraire des premiers codent des protéines qui freinent la croissance cellulaire. Ensemble, ces gènes maintiennent un équilibre délicat entre l’activation et l’inhibition de la croissance cellulaire. Leur mutation ou leur dérégulation peut entraîner une prolifération anarchique des cellules caractéristique de la tumorigenèse (Spandidos and Anderson, 1989).
1. Les proto-oncogènes
Les proto-oncogènes sont des gènes impliqués dans les processus moléculaires qui stimulent la différenciation et la prolifération cellulaire. On les trouve à toutes les étapes de la voie de signalisation de la croissance cellulaire. Le nombre de proto-oncogènes déterminés à l’heure actuelle est très élevé. L’activation de proto-oncogènes en oncogènes a lieu lorsqu’une mutation dans leur séquence d’ADN conduit à la production d’une protéine constitutionnellement active ou lorsque le taux de protéines produites est excessif.
L’altération d’une seule copie du gène est suffisante conduire à la perte du contrôle de la division cellulaire. Les cellules peuvent alors se diviser sans nécessiter de signaux extérieurs aboutissant finalement à la constitution d’une masse tissulaire formant la tumeur. H faut noter que chez l’homme l’activation d’un seul oncogène n’est pas capable de provoquer un cancer.
Ceci est illustré par les expériences de l’équipe du Professeur Weinberg dans lesquelles
l’injection, dans des souris immunodéficientes, de cellules exprimant la sous-uhité catalytique
de la télomérase (hTERT) en combinaison avec les oncogènes ras et large-T est capable de
provoquer l’apparition de tumeurs. Cependant, aucune tumeur n’est observée lors de
l’injection de cellules exprimant soit l’oncogène large-T seul ou les deux oncogènes ras et
large-T ou encore l’oncogène large-T et la protéine hTERT. Les chercheurs en ont conclu que
le déclenchement du processus de cancérisation des cellules nécessite l’activation d’une
combinaison de gènes (Hahn et al, 1999). Une liste non exhaustive de différents oncogènes
est présentée dans le tableau 1. Parmi les anomalies les plus fréquentes dans les cas de cancer
du sein, on observe une amplification et/ou une sur-expression des oncogènes neu, myc et ras.
A.Forme familiale B.Forme sporadique
1
1111
tumeur tumeur
Figure 2: Représentation schématique du principe de Knudson.
A. Forme familiale:
1. Une mutation (en rouge) dans un allèle d’un gène suppresseur de tumeurs est transmise par l’hérédité.
2. Une mutation sur le deuxième allèle (en bleu) est acquise de manière sporadique.
3. La cellule contenant les deux mutations devient la cellule souche de la tumeur.
B. Forme sporadique:
1. Une cellule peut acquérir une mutation (en rouge) dans un allèle d’un gène suppresseur de tumeur lors de la prolifération cellulaire normale.
2. Une mutation (en bleu) sur le deuxième allèle est acquise de manière sporadique dans la même cellule.
3. L’ensemble de ces deux mutations acquises entraîne la formation de tumeur.
2. Les gènes suppresseurs de tumeur
Les gènes suppresseurs de tumeur, aussi appelés anti-oncogènes, codent des protéines qui freinent la croissance cellulaire. Ils peuvent être subdivisés en deux classes selon leur fonction ; les caretakers qui assurent l’intégrité du génome et les gatekeepers qui inhibent la croissance cellulaire en régulant l’expression de gènes impliqués dans le contrôle de la progression du cycle cellulaire ou de l’apoptose (Kinzler and Vogelstein, 1997). Au contraire des proto-oncogènes, la formation de tumeurs est le résultat de l’inactivation d’un gène suppresseur de tumeur. Dans ce cas, l’altération des deux copies du gène est nécessaire à son inactivation. Ces altérations peuvent être d’origine sporadique ou être transmises par les cellules germinales.
2.7. Le principe de Knudson
Les analyses statistiques de la fréquence et de l’âge d’apparition des formes héréditaires et sporadiques de rétinoblastomes, cancers de la rétine, ont conduit Knudson à proposer un modèle de développement du cancer en deux étapes (Knudson, 1971). La première est l’apparition ou la transmission germinale d’une mutation dans une copie d’un gène suppresseur de tumeur. La deuxième étape est une altération sporadique du second allèle de ce gène suppresseur de tumeur. C’est seulement lorsque les deux allèles d’un gène suppresseur de tumeur sont mutés qu’il y a perte de l’activité protéique et progression de la cellule vers la cancérisation. Le principe de Knudson est illustré dans la figure 2.
2.2. Exemples de gènes suppresseurs de tumeurs
Un grand nombre de gènes suppresseurs de tumeur a pu être mis en évidence par des
analyses cytogénétiques de patients atteints de cancers. En se basant sur le principe de
Knudson, la comparaison du caryotype de ces patients avec celui de personnes saines a
A. Arrêt du cycle cellulaire
phase S
phase M
B. Apoptose
Figure 3: Fonctions du gène suppresseur de tumeur p53.
A. Arrêt du cycle cellulaire. La progression du cycle cellulaire en phase S nécessite l’activation de l’enzyme Cdk2 qui peut être inhibée par la protéine p21. La progression du cycle cellulaire en phase M nécessite l’activation de l’enzyme Cdc2 qui peut être inhibée par les protéines p21 et GADD45. La protéine p53 active l’expression de ces deux protéines inhibitrices pour induire l’arrêt du cycle cellulaire.
B. Apoptose. L’apoptose peut être induite par la liaison de la caspase 9 sur le cytochrome c et
Apafl. p53 active l’expression des protéines Apafl et Bax. Cette dernière permet la libération
du cytochrome c de la mitochondrie.
limitées à un petit fragment d’ADN, les régions chromosomiques altérées sont déterminées par la méthode dite « de perte d’hétérozygotie ». Dans ce cas, l’ADN des cellules tumorales est comparé avec celui des cellules saines en utilisant des marqueurs génétiques spécifiques de régions d’ADN.
Le premier gène suppresseur de tumeur identifié a été le gène de prédisposition au développement du rétinoblastome, ce gène a été cloné et nommé Rb pour RetinoBlastoma gene. Dans les formes héréditaires de rétinoblastome, un allèle de ce gène est perdu dans les cellules germinales, tandis que le deuxième allèle a été muté dans une cellule de la rétine qui deviendra la cellule souche de la tumeur (Bookstein et ai, 1988).
Le gène suppresseur de tumeur le plus étudié est sans aucun doute le gène p53. Il est impliqué dans au moins la moitié des tumeurs humaines (Hollstein et ai, 1991). Ce gène a été surnommé gardien du génome et fonctionne comme un facteur de transcription. Lorsque l’ADN d’une cellule a été endommagé, p53 peut activer l’expression de gènes codant des protéines inhibitrices de la progression du cycle cellulaire telles que p21 et GADD45 (figure 3). Le blocage du cycle cellulaire permet à la cellule de réparer son matériel génétique.
Lorsque les altérations de l’ADN sont trop importantes, p53 active l’expression de protéines induisant l’apoptose ou mort cellulaire programmée (figure 3) (Carrier et al, 1994;
Selvakumaran et al, 1994 ; Chan et al, 1997 ). Une liste d’autres exemples de gènes suppresseurs de tumeur est présentée dans le tableau 2.
Dans les cas de cancer du sein, on observe plus particulièrement des mutations inactivant les protéines p53 et les protéines de la famille BRCA. Dans ce travail, j’exposerai les données aujourd’hui recueillies sur le rôle des protéines BRCAl et BRCA2 dans la tumorigenèse mammaire. J’insisterai plus particulièrement sur la protéine BRCA2, cette dernière faisant l’objet de ce travail de thèse.
2.5. Les protéines de la famille BRCA
On estime que 5 à 10 % des cas de cancer du sein sont d’origine héréditaire, c’est-à-
dire qu’ils résultent d’une prédisposition génétique par la perte d’hétérozygotie. Les cancers
du sein d’origine héréditaire sont caractérisés par l’apparition de la maladie à un âge précoce
et ils touchent généralement les deux seins. Aujourd’hui deux gènes principaux de
localisation cellulaire
Protéines fonction Exemples de
cancer
Références
•Protéines cytoplasmiques
APC Adhésion cellulaire Côlon, rectum et duodénum
Kurahashi et ai, 1995; Nakamura étal, 1992 NF-1 Contrôle les protéines
RAS
Système nerveux Ainsworth, 1993
NF-2 Interaction cytosquelette- membrane
Système nerveux Kaufmann et al.,, 2001
DPC4
»
Inhibe la prolifération cellulaire
Pancréas Howe et ai, 1998
•Protéines nucléaires
BRCAl Réparation de T ADN Sein, ovaire Hall étal., 1992
BRCA2 Réparation de T ADN Sein, ovaire Wooster et al., 1994
MSH2 Maintien de l’intégrité du génome
Côlon, estomac T^ami et ai, 1995
Tableau 2 : Liste non exhaustive de différentes protéines codées par des gènes
suppresseurs de tumeurs.
susceptibilité au cancer du sein ont été caractérisés chez l’homme, il s’agit des gènes brcal et brcal.
C’est en étudiant le génome de femmes appartenant à des familles dans lesquelles au moins quatre cas de cancer du sein étaient détectés que l’équipe de recherche du Professeur Mary-Claire King a pu cibler le premier gène de susceptibilité au cancer du sein sur la région 21 du chromosome 17. On le baptisa brcal pour "breast cancer type 1 " (Hall et ai, 1992).
La séquence du gène fut complètement réalisée en 1994 (Miki et ai, 1994). Cependant, la moitié des cas de cancer du sein familiaux et aucun cas affectant au moins un homme n’ont pu être attribués à des mutations dans ce gène (Stratton et ai, 1994). C’est pour cette raison que l’existence d’un second gène de susceptibilité a été suspectée. Le gène brcàZ pour "
breast cancer type 2 " a été isolé sur le chromosome 13 en position ql2-13 (Wooster et ai, 1995). La séquence du gène fut complètement réalisée en 1996 (Tavtigian et ai, 1996).
Même si des mutations dans ces deux gènes sont retrouvées dans la majeure partie des cas de cancer du sein familiaux, il reste des cas où aucun de ces gènes n’est altéré. En 2000, la délétion de la région 13q21-q22 a été observée chez plusieurs patients atteints de cancers du sein héréditaires. Ce locus a alors été proposé comme candidat pour contenir un troisième gène de susceptibilité au cancer du sein, brcaS (Thompson et ai, 2002). Aucune donnée concernant la séquence de ce gène n’est disponible à l’heure actuelle.
2.3.1. Les gènes brcal et brca2 sont des gènes suppresseurs de tumeurs.
L’analyse des délétions géniques dans les tumeurs de femmes porteuses de mutations
germinales des gènes brcal ou brca2 a permis de mettre en évidence plus de 200 mutations
dans le gène brcal et plus d’une centaine dans le gène brca2 réparties sur toute la longueur de
ces gènes. Chez toutes ces femmes, on observe une perte d’hétérozygotie c’est-à-dire que
l’allèle perdu est systématiquement l’allèle qui était normal (Comelisse et ai, 1996). Si on se
réfère à la théorie de Knudson, cette observation constitue un argument fort en faveur d’une
activité de gène suppresseur de tumeur. Les gènes brcal et brca2 protégeraient du cancer en
inhibant la croissance cellulaire. Cette hypothèse a été confortée par les résultats des
expériences suivantes :
La transfection de fibroblastes par un vecteur exprimant un messager antisens du gène hrcal conduit à transformation de ces cellules (Rao et ai,
1996).
L’expression de la protéine BRCA2 par un rétrovirus dans une lignée de cellules cancéreuses pancréatiques, CAPAN-1, a pour effet d’inhiber la croissance de ces cellules en culture et de retarder la prolifération tumorale chez les animaux (Wang et al., 2002).
Comme précédemment, l’expression de la protéine BRCAl dans une lignée de cellules issues de tumeurs mammaires sporadiques induit l’inhibition de croissance de ces cellules (Randrianarison et ai, 2001).
2.3.2. Epidémiologie des cancers du sein familiaux attribués à des mutations dans les gènes brcal et brcal.
Comme nous l’avons mentionné plus haut, la majeure partie des familles affligées d’un taux élevé de cas de cancer du sein possède dans leur bagage génétique le gène brcal ou le gène hrca2 muté. De nombreuses études ont été effectuées afin de déterminer la contribution des mutations de chacun de ces gènes de susceptibilité dans l’apparition de cancer du sein.
Les résultats de ces recherches se recouvrent. En résumé, il apparaît que des mutations dans le gène brcal seraient responsables de 80 % des cas de cancer du sein familiaux associés à des cancers de l’ovaire et d’environ la moitié des cas associés à aucune autre tumeur, l’autre moitié des cas restant est quant à elle liée à des mutations dans le gène brca2. De plus des mutations dans ce gène sont responsables de la plupart des cas où au moins un homme est affecté (Easton et ai, 1993 ; Wooster et ai, 1994 ; Wooster et ai, 1995 ; Ford et ai, 1998 ).
A titre d’exemple, voici les résultats d’une recherche effectuée sur 237 familles comptant au moins quatre cas de cancer du sein. Cinquante deux % des familles présentaient des mutations dans le gène brcal et 32% dans le gène brca2. Aucun de ces gènes n’était muté dans 16% des familles. Dans ces 237 familles, 81% des familles affligées par un cancer du sein associé à un cancer de l’ovaire présentait des mutations dans le gène brcal. Parallèlement, 76% affligées par un cancer du sein affectant au moins un homme présentait des mutations dans le gène
12
doigt de zinc (a.a. 24 à 64)
Signaux de Localisation
nucléaire
Motif granine
Motif BRCT
(a.a. 1642 à 1736 et 1758 à 1842) Activation transcriptionnelle
(a.a. 1528 à 1863)
BRCAl 1863 a.a.
BARDl RAD50 RAD51 HDACl/2
BAPl pS3 (a.a. 758-1064) CBP/P300
RNA hélicase BRCA2
Activation BRC: 8 répétitions
Signal de transcriptionnelle
(a.a. 1421 à 2085) Motif Localisation
(a.a. 23 à 105)
---- ►
granine nucléaire
◄---
BRCA2 3418 a.a.
D I
R A 1)51
Figure 4: Représentation schématique des protéines BRCAl et BRCA2 humaines.
Les principaux domaines fonctionnels ainsi que des protéines interagissant avec ces différents domaines sont
indiqués.
brcal (Ford et al., 1998). Alors qu’on estime à 1% le risque de développer un cancer du sein chez la femme âgée de 50 ans et à 10% à l’âge de 70 ans, la transmission germinale d’une mutation dans le gène brcal porte ce chiffre à 49% à l’âge de 50 ans et à 71% à l’âge de 70 ans. Chez les porteurs d’une mutation dans le gène brca2 ce risque est estimé à 29% à l’âge de 50 ans et à 63% à l’âge de 70 ans (Ford et al, 1998 ).
En ce qui concerne le gène brcaS, son implication dans l’apparition de cancers du sein semble concerner moins de 1 % de cas (Kainu et al, 2000 ; Thompson et al, 2002).
2.3.3. Caractérisation des gènes brcal et brcal
Bien que leurs fonctions semblent être similaires, ces gènes ne possèdent pas d’identité de séquence. J’exposerai donc séparément les données concernant l’organisation génomique de ces gènes et l’identification de certains domaines qui semblent important pour leur
»
fonction de gène suppresseur de tumeur (figure 4).
-BRCAl : du gène à la protéine
Le gène brcal humain est constitué de 24 exons dont 22 sont des exons codants.
L’exon 11 représente à lui seul plus de 60% de la séquence codante. L’exon 5 est une séquence Alu répétée. Les deux premiers exons du gène sont non codants (l’exon la et exon Ib) et peuvent être épissés de manière alternative (Xu et ai, 1995). Ce gène est transcrit en un ARNm de 7.8 kb et code une phosphoprotéine nucléaire de 1863 acides aminés (Miki et al, 1994). Cette protéine possède 4 domaines qui présentent des identités de séquences avec des motifs polypeptidiques connus. Une représentation schématique de ces domaines est présentée dans la figure 4. Le premier est un motif situé en position N-terminale de la protéine constitué de résidus cystéine et histidine adoptant une conformation structurelle conservée dite en doigt de zinc (Saurin et al, 1996). Chez d’autres protéines, ce domaine est responsable d’interactions protéine-protéine ou protéine-ADN. Il a été montré des interactions entre ce domaine et la protéine BARDl qui est impliquée dans l’induction de l’apoptose (Irminger- Finger et al, 1999; Irminger-Finger et ai, 2001), de même qu’avec la protéine BAPl (5RCA1 Associated Protein) dont le rôle reste à déterminer (Jensen et al, 1998). Le deuxième motif, situé en position C-terminale, est constitué de deux régions riches en acides
13
aminés hydrophobes appelées domaine BRCT pour " Breast Cancer C-Terminal Comme le domaine en doigt de zinc, ces deux régions semblent représenter une surface d’interaction avec d’autres protéines. Plusieurs protéines telles que la RNA hélicase, le coactivateur transcriptionnel CBP/p300, la protéine BRCA2 et des histones désacétylases interagissent avec la protéine BRCAl via le domaine BRCT (Anderson et al., 1998 ; Yarden and Brody, 1999; Pao et al., 2000 ). Ce domaine qui a été caractérisé pour la première fois chez BRCAl, est également présent dans des protéines impliquées dans la synthèse ou la réparation de l’ADN (Callebaut and Momon, 1997 ; Saka et al., 1997; Thomton et al., 1999 ). Un troisième domaine est une région riche en résidus acides située en position C-terminale qui correspond à un domaine transactivateur retrouvé dans des protéines régulatrices de la transcription. Le dernier domaine est un motif analogue au motif consensus des protéines de la famille granine qui sont des protéines riches en acides aminés acides et qui sont impliquées dans le transport vésiculaire (Jensen et ai, 1996 ; Steeg, 1996). Le rôle de ce motif dans la protéine BRCAl n’est pas encore élucidé. Hormis ces différents domaines, la protéine BRCAl ne possède aucune similarité avec d’autres protéines connues.
Cependant, d’autres domaines semblent être importants pour les interactions protéine- protéine. Il s’agit en particulier d’un domaine localisé dans la portion centrale de la protéine (figure 4). La structure précise de ce domaine n’est pas bien définie néanmoins on sait que des protéines telles que la protéine p53 et les protéines RAD50 et RAD51 (impliquées dans la réparation de l’ADN, Trujillo et al., 1998) interagissent avec la protéine BRCAl via cette région (Zhang et al., 1998 ; Zhong et ai, 1999). C’est également dans cette portion de la protéine que se trouvent deux signaux de localisation nucléaire (figure 4).
Au cours de l’évolution, la protéine BRCAl ne s’exprime que chez les mammifères où
sa conservation de séquence est assez faible par rapport à d’autres protéines. En effet, la
protéine BRCAl murine ne présente que 58% d’identité de séquence avec la protéine
humaine. Le domaine en doigt de zinc et les domaines BRCT sont quant à eux bien conservés
avec 83 et 91 % d’identité de séquence (Szabo et ai, 1996).
-BRCA2 : du gène à la protéine
Ce gène, organisé en 27 exons, s’étend sur plus de 70 kpb. Les exons 1 et 27 sont non codants. Les exons 10 et 11 représentent 60% de la séquence codante. Le transcrit de 11 kb code une phosphoprotéine nucléaire de 3418 acides aminés (Wooster et ai, 1995).
Comme BRCAl, la protéine BRCA2 ne présente que peu de ressemblance avec des protéines connues. Elle possède un motif, situé dans la région N-terminale présentant une similarité de séquence avec le domaine d’activation de la transcription du facteur de transcription c-JUN (figure 4). A l’extrémité C-terminale de la protéine se trouve également un motif granine dont le rôle reste à déterminer. Le signal de translocation nucléaire se trouve aussi dans cette région (figure 4).
La protéine BRCA2 est caractérisée par 8 motifs de 30 à 80 acides aminés répétés dans l’exon 11, Ces motifs ^ont appelés BRCl à BRC8. Les motifs BRCl, BRC2, BRC3, BRC4, BRC7 et BRC8 sont responsables de l’interaction de la protéine BRCA2 avec la protéine RAD51, impliquée dans les mécanismes de réparation de l’ADN (Wong et ai, 1997 ; Chen et al, 1998 ). Le rôle des motifs BRC5 et BRC6 est inconnu.
De la même manière que BRCAl, la protéine BRCA2 n’a été identifiée que chez les mammifères où sa conservation de séquence est également assez faible. En effet, la protéine BRCA2 murine ne présente que 59% d’identité de séquence avec la protéine humaine. Des régions de la protéine sont quant à elles mieux conservées. C’est le cas des motifs BRC interagissant avec la protéine RAD51 que l’on trouve chez la protéine de singe, de souris, de porc et de hamster. Les motifs BRC5 et BRC6 dont le rôle n’est pas connu, sont moins conservés (Bignell et al, 1997 ; McAllister et al, 1997 ). Le domaine homologue au domaine de transactivation de la protéine c-JUN est également bien conservé. Comme nous le verrons par la suite, ce domaine est capable d’activer la transcription lorsqu’il est fusionné au domaine de liaison à l’ADN de la protéine GAL4.
2.3.4. Expression des transcrits brcal et brca2
Le messager du gène brcal et de celui du gène brca2, ont une taille respective à 7.8 kb et 11 kb. De manière générale, ces deux messagers possèdent le même schéma d’expression au cours de l’embryogenèse et chez l’adulte.
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Figure 5: Etude par RNAse protection de l’expression des ARNmessagers brcal et brca2 durant le développement embryonnaire chez la souris.
Cette étude a été effectuée aux jours 6.5, 13.5 et 18.5 du développement embryonnaire (Marquis et al, 1995).
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Figure 6: Etude de l’expression des ARNmessagers brcal et brcal dans les tissus murins adultes par RNAse protection (Marquis et al., 1995).
Les ARNmessagers ont été testés par Northern blot et sont représentés en bas.
•Expression durant l’embryogenèse
Une seule étude de l’expression du transcrit brcal a été effectuée chez l’embryon humain. Cette étude a été réalisée sur la glande mammaire de foetus âgés de 15 à 33 semaines.
Les résultats de cette expérience montrent une diminution du niveau d’expression du transcrit avec l’âge du fœtus (Magdinier et al, 1999).
Les autres études d’expression des gènes brcal et brca.2 durant l’embryogenèse ont été effectuées chez la souris dont le développement embryonnaire dure 21 jours. Les résultats d’une étude effectuée en 1995 montrent que les messagers brcal et brcal sont exprimés faiblement durant tout le développement embryonnaire. Le niveau d’expression maximal est atteint au jour 13.5 de développement (figure 5) (Marquis et ai, 1995 ; Rajan et ai, 1997).
Concernant les territoires d’expression, ces deux transcrits s’expriment généralement dans des tissus présentant des processus de prolifération et de différenciation intense tels que le foie,
»
les glandes salivaires, le thymus, etc... (Lane et ai, 1995 ; Marquis et ai, 1995 ; Rajan et ai, 1997). Mis à part le cerveau dans lequel seul brcal s’exprime, le schéma d’expression des deux transcrits est donc le même durant le développement embryonnaire murin.
-Expression chez l’adulte
Les études de l’expression des messagers brcal et brca2 chez l’adulte ont été effectuées tant chez l’homme que chez la souris. Dans ces deux espèc'es, le schéma d’expression est pratiquement identique pour les deux messagers. Le transcrit de chacun des gènes est faiblement détecté dans tous les tissus (mis à part le cerveau où seul brcal s’exprime) avec des taux d’expression cependant plus marqués dans les testicules, le petit intestin, le thymus et la rate (figure 6). Ces organes sont caractérisés par des processus de prolifération et de différenciation intenses (Marquis étal, 1995 ; Rajan et ai, 1997).
Dans la glande mammaire, l’expression est principalement épithéliale. C’est ainsi que la tumorigenèse mammaire, due à des mutations dans ces gènes de susceptibilité, touche principalement l’épithélium. Le niveau d’expression des transcrits dans la glande mammaire de souris nullipares immatures de 2 à 5 semaines (les glandes mammaires sont en développement) est significativement plus élevé que chez les souris vierges matures de 10 à 15 semaines (figure 7). En ce qui concerne les territoires d’expression, les transcrits sont
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