Implication des monocytes et des récepteurs CCR2 et CX3CR1 dans la réponse immunitaire innée suite à l'infection du système nerveux central par le virus herpès simplex 1 (VHS-1)

Implication des monocytes et des récepteurs CCR2

et CX3CR1 dans la réponse immunitaire innée suite

à l’infection du système nerveux central par le virus

herpès simplex 1 (VHS-1)

Thèse

Rafik Menasria

Doctorat en microbiologie-immunologie

Philosophiae doctor (Ph. D.)

Québec, Canada

© Rafik Menasria, 2017

Implication des monocytes et des récepteurs CCR2

et CX3CR1 dans la réponse immunitaire innée suite

à l’infection du système nerveux central par le virus

herpès simplex 1 (VHS-1)

Thèse

Rafik Menasria

Sous la direction de :

Guy Boivin, directeur de recherche

Jocelyne Piret, codirectrice de recherche

Résumé

L’infection du système nerveux central (SNC) par le virus herpès simplex 1 (VHS-1) peut mener au développement d’une encéphalite herpétique qui représente l’infection cérébrale sporadique la plus répandue dans les pays développés. Cette infection dévastatrice a une prévalence de 1/250 000 individus, et atteint un taux de mortalité de 30% malgré l’administration d’un traitement antiviral à base d’acyclovir. De plus, la majorité des patients qui survivent à l’infection conservent des séquelles neurologiques graves et permanentes.

Il est suggéré, qu’en plus des dommages causés par la réplication virale, la réponse immunitaire inflammatoire induite par l’infection serait responsable de l’exacerbation de l’encéphalite herpétique. Cette réponse inflammatoire est initiée par les macrophages résidents du SNC, nommés microglies. Dans certains désordres neurologiques, Il est proposé qu’en plus des microglies, les monocytes sanguins pourraient infiltrer le SNC et participer à la réponse immunitaire. Les connaissances concernant le recrutement des monocytes périphériques au SNC et leur rôle dans l’élaboration de la réponse immunitaire durant l’encéphalite herpétique sont très limitées. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans cette réponse dirigée contre l’infection du cerveau par le VHS-1 pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et mener au développement de nouvelles stratégies combinant des antiviraux et des agents immunomodulateurs pour contrôler à la fois la propagation du virus et l'état inflammatoire dans le SNC.

Les travaux présentés dans le cadre de cette thèse s’intéressent à l’implication des monocytes périphériques recrutés au niveau du cerveau dans la réponse immunitaire innée développée dans un modèle murin d’encéphalite herpétique. Pour atteindre nos objectifs, nous avons d’abord utilisé des souris chimériques dont les précurseurs myéloïdes dérivés de la moelle osseuse et les leucocytes sanguins expriment la protéine fluorescente verte (GFP pour «green fluorescent protein»). Ce modèle nous a principalement permis de distinguer les macrophages d’origine hématopoïétique des microglies résidentes du SNC car il n’existe aucun marqueur naturel permettant de différencier ces deux populations cellulaires. Cette stratégie nous a aidé à mieux caractériser la cinétique d’infiltration des monocytes, leur localisation dans le cerveau, et leur participation à la réponse immunitaire suite à l’infection du SNC par le VHS-1. La deuxième partie des travaux porte sur les mécanismes impliqués dans

le recrutement de ces monocytes et dans le contrôle de l’état inflammatoire au niveau du SNC durant l’encéphalite herpétique. Plus précisément, les expériences réalisées s’intéressent aux rôles de la signalisation via les récepteurs de chimiokines CCR2 et CX3CR1, exprimés à la surface des monocytes sanguins et des microglies, dans la protection ainsi que dans le recrutement des deux sous-types de monocytes sanguins, soient les monocytes «inflammatoires» et «patrouilleurs», au cours de l’encéphalite herpétique.

Nos résultats ont montré pour la première fois que les monocytes sanguins infiltraient le SNC pour donner naissance à des macrophages ayant le même profil que les microglies résidentes et que ces cellules participaient à la réponse immunitaire suite à l’infection par le VHS-1. Nous avons également démontré, en utilisant des souris chimériques ayant des déficiences compartimentées en récepteurs CX3CR1 et CCR2 au niveau du SNC au niveau du système hématopoïétique, que les voies de signalisation via CX3CR1 au niveau des cellules résidentes du cerveau et de CCR2 au niveau des cellules hématopoïétiques étaient importantes pour la survie des souris, pour le contrôle de la réplication virale ainsi que pour contenir la réponse inflammatoire cérébrale durant l’encéphalite herpétique expérimentale.

Abstract

Herpes simplex virus 1 (HSV-1) is the main cause of sporadic viral encephalitis in developed countries with an annual incidence of 1/250 000 individuals per year. Despite the use of acyclovir that aimed at blocking virus replication, the mortality rate associated with HSV encephalitis (HSE) is still high (i.e., 30%), with the majority of surviving patients developing severe neurological sequelae.

It is believed that the high mortality rate and neurological disorders attributable to HSE could involve both virally- and immune-induced damages of the central nervous system (CNS). The inflammatory response is initiated by the resident macrophages of the brain, namely microglia. In addition, blood leukocytes, particularly monocytes, are thought to infiltrate the CNS and contribute to the control of viral infection together with microglia. However, it is also argued that these cells may also amplify the inflammatory response, thereby contributing to brain damages. Knowledge concerning the recruitment of peripheral monocytes to the CNS and their role in the immune response during HSE is limited. A better understanding of the mechanisms involved in their dynamic of recruitment might lead to the identification of new therapeutic targets and the development of new strategies combining antiviral agents and immunomodulatory molecules to better control both HSV replication as well as the inflammatory environment in the CNS.

The studies presented in this thesis are intended to better evaluate the involvement of monocytes-derived macrophages, together with microglia, in the cerebral innate immune response during experimental HSE. To achieve our goals, we first used chimeric mice in which bone marrow progenitor cells and blood leukocytes express the green fluorescent protein (GFP). This model allowed us to better characterize the kinetics of infiltration of blood monocytes into the CNS, their distribution in different anatomical areas of the brain and their involvement in the immune response during experimental HSE. The second part of the work focuses on the mechanisms involved in the recruitment of monocytes into the CNS and in the control of the inflammatory state in mouse brain following HSV-1 infection. More precisely, experiments aimed at characterizing the role of signaling pathways through chemokine receptors CCR2 and CX3CR1, expressed on the surface of blood monocytes and microglia, in protecting and modulating the recruitment of the two blood monocytes subtypes, namely the

"inflammatory" and "patrolling" monocytes, during HSE. To achieve this aim, we used chimeric mouse models of CCR2- and CX3CR1-deficient animals, in which the lack of either receptor was restricted to the hematopoietic system (blood monocytes) or the CNS (microglia).

Our results showed that blood monocytes are recruited to the CNS following HSV-1 infection and give rise to microglia-like macrophages. These cells are involved in the immune response together with microglia by performing immunological functions including phagocytosis and antigen presentation. Furthermore, we showed that CX3CR1 and CCR2 expressed on cells of the CNS and in the hematopoietic system, respectively, are important for mouse survival, viral replication control and in maintaining an appropriate inflammatory response during experimental HSE.

Tables des matières

Résumé ... iii

Abstract ... v

Tables des matières ... vii

Liste des tableaux ... xiii

Liste des figures ... xv

Liste des abréviations ... xvii

Remerciements ... xxiii

Avant-propos ... xxv

1. Chapitre I: introduction ...1

1.1. Historique de l’infection par le virus herpès simplex ...1

1.2. Caractéristiques des virus herpétiques ...2

1.3. Caractéristiques générales et classification des virus herpétiques infectant l’humain ...3

1.4. Le virus herpès simplex 1 ...7

1.4.1. Description de la particule virale ... 7

1.4.1.1. Le génome et le noyau ... 7

1.4.1.2. La capside ... 8

1.4.1.3. Le tégument ... 9

1.4.1.4. L’enveloppe ... 9

1.4.2. Le cycle de réplication virale ... 11

1.4.2.1. Entrée du virus ... 12

1.4.2.2. La transcription des gènes viraux ... 13

1.4.2.3. La réplication de l’ADN viral ... 14

1.4.2.5. Le bourgeonnement de la particule virale ... 18

1.4.3. Propriétés biologiques spécifiques du VHS ... 19

1.4.3.1. La latence ... 19

1.4.3.2. La neurovirulence... 22

1.5. La pathologie du VHS ... 23

1.6. La transmission et la pathogénèse du VHS ... 24

1.7. L’épidémiologie du VHS ... 25

1.7.1. L’infection herpétique oropharyngée primaire et récurrente ... 25

1.7.2. L’infection herpétique génitale primaire et récurrente ... 26

1.7.3. L’infection génitale chez les femmes enceintes ... 27

1.7.4. Épidémiologie de l’encéphalite herpétique ... 27

1.8. Les manifestations cliniques ... 28

1.8.1. Les infections oropharyngées ... 28

1.8.2. Les infections génitales ... 29

1.8.3. Les infections néonatales ... 30

1.8.4. Les infections oculaires (kératoconjonctivites) ... 30

1.8.5. Les infections cutanées ... 31

1.8.6. Les infections chez les patients immunosupprimés ... 31

1.8.7. La méningite de Mollaret ... 32

1.8.8. L’encéphalite herpétique ... 32

1.9. Le diagnostic des infections herpétiques ... 33

1.9.1. Les tests par culture cellulaire ... 33

1.9.2. Les tests sérologiques ... 34

1.9.3. Les tests PCR ... 35

1.10. Les agents antiviraux, les traitements et la prévention ... 37

1.10.1. Les principaux agents antiviraux ... 37

1.10.2. Les traitements antiviraux des infections au VHS ... 39

1.10.2.1. Traitement de l’encéphalite herpétique ... 40

1.10.3. La résistance aux antiviraux ... 43

1.10.4. Le développement de vaccins dans le contexte des infections au VHS ... 44

1.11. Les caractéristiques de la réponse immunitaire dirigée contre le VHS ... 46

1.11.1. La réponse immunitaire innée ... 46

1.11.1.1. La reconnaissance du VHS par le système immunitaire inné ... 46

1.11.1.2. Le déclenchement de la réponse immunitaire innée avant la synthèse des produits viraux ... 47

1.11.1.3. Le déclenchement de la réponse immunitaire innée suite à la synthèse des produits des gènes viraux ... 49

1.11.2. L’élaboration de la réponse immunitaire de l’hôte contre l’infection au VHS ... 52

1.11.3. La réponse immunitaire à une infection récurrente au VHS ... 55

1.11.4. Les mécanismes d’évasion du VHS ... 56

1.12. Prédispositions génétiques à développer l’encéphalite herpétique chez l’humain ... 59

1.13. Modèles expérimentaux pour l’étude de l’encéphalite herpétique ... 60

1.13.1. Variabilité de la réponse immunitaire selon les modèles murins d’encéphalite herpétique ... 62

1.13.2. Implication des leucocytes sanguins dans la réponse immunitaire cérébrale au VHS dans les modèles expérimentaux ... 64

1.14. Les cellules phagocytaires mononucléaires... 66

1.14.1. Les monocytes : origine et développement... 67

1.14.2. Les sous-types de monocytes ... 69

1.14.4. Extravasation des monocytes aux tissus en inflammation ... 74

1.14.5. Les macrophages tissulaires ... 76

1.15. Les systèmes de défense du SNC ... 79

1.15.1. Les barrières physiques ... 79

1.15.2. Les macrophages résidents du SNC... 80

1.15.2.1. Les microglies ... 81

1.15.3. Les modèles animaux utilisés pour l’étude du recrutement des monocytes au SNC 84 2. Chapitre II : Hypothèses et objectifs ... 89

2.1. Mises en contexte et problématique pour le chapitre 3 ... 89

2.2. Hypothèse pour le chapitre 3 ... 90

2.3. Objectifs ... 91

2.4. Mise en contexte et problématique des chapitres 4 et 5 ... 92

2.5. Hypothèse pour les chapitres 4 et 5 ... 93

2.6. Objectifs ... 94

3. Chapitre III : Caractérisation du recrutement spatiotemporel des monocytes sanguins au SNC et leur contribution à la réponse immunitaire cérébrale dans un modèle murin d’encéphalite herpétique ... 95 Avant-propos ... 95 3.1. L’article scientifique ... 96 3.2. Résumé ... 97 3.3. Abstract ... 99 3.4. Introduction ... 100

3.5. Materials and methods ... 102

3.6. Results ... 107

3.7. Discussion... 111

3.9. References ... 116

3.10. Figures ... 123

4. Chapitre IV : l’importance de la signalisation via le récepteur de chimiokine CX3CR1 durant l’encéphalite herpétique expérimentale ... 135

Avant-propos ... 135 L’article scientifique ... 136 4.1. Résumé ... 137 4.2. Abstract ... 138 4.3. Introduction ... 139 4.4. Results ... 141 4.5. Discussion ... 148

4.6. Materials and Methods ... 153

4.7. Acknowledgments ... 158

4.8. References ... 158

4.9. Figures ... 169

5. Chapitre V: L’importance de la signalisation via le récepteur de chimiokine CCR2 durant l’encéphalite herpétique expérimentale ... 179

Avant-propos ... 179

L’article scientifique ... 180

5.1. Résumé ... 181

5.2. Abstract ... 182

5.3. Introduction ... 183

5.4. Material and Methods ... 185

5.5. Results ... 189

5.6. Discussion ... 195

5.8. References... 199

5.9. Figures ... 207

6. Chapitre VI : Discussion ... 215

6.1. Discussion et perspectives du Chapitre 3 ... 215

6.1.1. Discussion de l’approche expérimentale utilisée ... 215

6.1.2. L’implication des monocytes dans la réponse immunitaire innée durant l’encéphalite herpétique ... 217

6.2. Discussion et perspectives du chapitre 4 ... 222

6.2.1. Discussion de l’approche expérimentale utilisée ... 222

6.1.1. L’impact de la déficience en CX3CR1 sur la susceptibilité des souris à l’infection intranasale par le VHS-1 ... 225

6.3. Discussion et perspectives du chapitre 5 ... 229

6.4. Conclusion ... 233

Liste des tableaux

Tableau 1. La classification, les principales manifestations cliniques et les sites de latence des virus de la famille des Herpesviridae. ... 6 Tableau 2. Résumé des principales thérapies antivirales des infections au VHS ... 43 Tableau 3. Différents types de monocytes chez la souris et chez l’humain ... 70

Liste des figures

Figure 1. Structure du VHS et de son génome ... 10

Figure 2. Illustration représentant des modèles de capside du VHS. ... 10

Figure 3. Représentation d’une infection productive par le VHS-1 dans la cellule hôte ... 11

Figure 4. Mécanisme de réplication de l’ADN du VHS. ... 15

Figure 5. Illustration des protéines impliquées dans la maturation de la capside du VHS. ... 17

Figure 6. Représentation des stratégies de sortie du VHS-1 des cellules infectées. ... 19

Figure 7. Illustration de l’établissement de la latence et de la réactivation du VHS. ... 21

Figure 8. Mécanismes d’actions des principales classes d’antiviraux. ... 42

Figure 9. Représentation schématique des principaux PRRs impliqués dans la reconnaissance du VHS ... 51

Figure 10. Illustration schématique de la voie d’entrée du VHS-1 dans le SNC suite à une infection des souris par voie intranasale. ... 64

Figure 11. Schéma représentant les grandes étapes de l’hématopoïèse menant à la production des monocytes/macrophages. ... 68

Figure 12. Représentation des profils de migration des monocytes murins et de leurs rôles. . 71

Figure 13. Migration des monocytes de la moelle osseuse. ... 73

Figure 14. Extravasation des monocytes. ... 76

Liste des abréviations

α-TIF de l’anlglais «α trans-inducing factor» ACV Acyclovir

ADAM-10 de l’anglais «A disintegrin and metalloproteinase» ADN Acide désoxyribonucléique

ADNdb ADN double brin ADNsb ADN simple brin ADN pol ADN polymérase

AIM2 de l’anglais «absent in melanoma 2»

Akt de l’anglais «Serine threonine tyrosine kinase» ARN Acide ribonucléique

ARNdb ARN double brin

ARNm Acide ribonucléique messager ARN pol ARN polymérase

ARNsb ARN simple brin ATP Adénosine triphosphate BHE Barrière hématoencéphalique C+G Cytosine + guanosine

CAN de l’anglais «canonical»

CCL de l’anglais «chemokine (C-C motif) ligand» CCR de l’anglais «chemokine (C-C motif) receptor» CDV Cidofovir

CD4 de l’anglais «cluster of differenciation 4» CD8 de l’anglais «cluster of differenciation 8» CHO de l‘anglais «Chinese hamster ovary» CHUL Centre Hospitalier de l’Université Laval CMH Complexe majeur d’histocompatibilité

cMoP de l’anglais «common monocytes/macrophages progenitors» CMP de l’anglais «common myeloid progenitors»

CPA Cellule présentatrice d’antigènes CpG Cytosine-phosphate-guanosine CTLs de l’anglais «cytotoxic T lymphocytes» CX3CL de l’anglais «chemokine (CX3C) ligand» CX3CR de l’anglais «chemokine (CX3C) receptor»

DAI de l’anglais «DNA-dependent activator of interferon-regulatory factors»

db Double brin

DC Cellule dendritique de l’anglais «dendritic cell» dUTP Deoxyuridine 5'-triphosphate

EAE Encéphalite autoimmune expérimentale EBV Virus Epstein-Barr

eIF2 de l’anglais «eukaryotic Initiation Factor 2» FCV Famciclovir

FOS Foscarnet g Glycoprotéine GAG glycosaminoglycanes GCs Glucocorticoïdes

GFAP de l’anglais «Glial fibrillary acidic protein» GFP de l’anglais «green fluorescent protein»

GMP de l’anglais «granulocytes/macrophages progenitors»

h heure

HCF-1 de l’anglais «host cell factor 1» Hep de l’anglais «Human epithelioma» HHV de l’anglais «human herpesvirus» Hrl de l’anglais «herpes resistance locus» HSCs de l’anglais «hematopietic stem cells» HSP de l’anglais «heat shock protein» Hve de l’anglais «herpesvirus entry protein» HVEM de l’anglais «herpesvirus entry mediators» (ICAM1) de l’anglais «intercellular adhesion molecule 1» ICP de l’anglais «infected cell protein»

IFI16 de l’anglais «interferon gamma-inducible protein 16» IFN Interféron

IFNAR de l’anglais «interferon-α/β receptor»

Iκ-Bα de l’anglais «nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha»

Ig Immunoglobuline IL Interleukine I.N. Intranasale

IPS-1 de l’anglais «interferon-β promoter stimulator» IRAK-4 de l’anglais «IL-1 receptor-associated kinase 4» IRF de l’anglais «interferon regulatory factor» IRM Imagerie par résonnance magnétique IRL de l’anglais «internal repeat long» IRS de l’anglais «internal repeat short»

ISRE de l’anglais «IFN-stimulated response elements» IV Intraveineux

JAK de l’anglais «janus kinase» Kb Kilo-base

Kg kilogramme

LATs de l’anglais «latency-associated transcripts» LCR Liquide céphalo-rachidien

LFA-1 de l’anglais «lymphocyte function-associated antigen 1» LPS Lipoplysaccharides

Ly6C de l’anglais «lymphocyte antigen 6 complex» LSD1 de l’anglais «lysine-specific demethylase 1» MAC-1 de l’anglais «macrophage receptor 1»

MAPK de l’anglais «mitogen-activated protein kinases» MCP-1 de l’anglais «monocyte chemoattractant protein-1» m-CSF de l’anglais «macrophage colony-stimulating factor»

m-CSFR de l’anglais «macrophage colony-stimulating factor receptor» MDA-5 de l’anglais «melanoma differentiation-associated protein 5»

MDP de l’anglais «macrophages/dendritic cells progenitors» Mg Milligramme

µl microlitre mm millimètre

MyD88 de l’anglais «myeloid differenciation factor 88» NAP Nucléoside acyclique-phosphonate

ND10 de l’anglais «nuclear domain10»

NF-κB de l’anglais «nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells» NK de l’anglais «natural killer»

NLRs de l’anglais «nucleotide oligomerization domain-like receptors» nm Nanomètre

NO de l’anglais «nitric oxide»

NOD de l’anglais «nucleotide oligomerization domain»

Nr4a1 de l’anglais «nuclear receptor subfamily 4 group A member 1» NUP de l’anglais «nucleoporin»

Oct 1 de l’anglais «octamer-binding protein 1» Ori Origine de réplication

P Phosphate

PAMPs de l’anglais «pathogen-associated molecular pattern» Pb Paires de bases

PCR de l’anglais «polymerase chain reaction» PCV Penciclovir

PDCD4 de l’anglais «the cellular programmed cell death protein 4» PECAM1 de l’anglais «platelet endothelial cell adhesion molecule 1» PKR de l’anglais «protein kinase RNA-dependent»

PML de l’anglais «Promyelocytic leukemia protein» PRR de l’anglais «pattern recognition receptors» PSGL-1 de l’anglais «P-selectin glycoprotein ligand 1» RANbp de l’anglais « RAN binding protein»

RIG-I de l’anglais «retinoic-acid-inducible gene 1» Rhs1 de l’anglais «resistance to herpes simplex virus 1»

RLRs de l’anglais «retinoic-acid-inducible gene-1-like receptors» ROS de l’anglais «Reactive oxygen species»

SK Syndrome de Kaposi SNC Système nerveux central

SPM Système phagocytaire mononucléaire

STAT de l’anglais «signal transducer and activator of transcription» TAP de l’anglais «transporter of antigen presentation»

TBK-1 de l’anglais «TANK-binding kinase 1» TF de l’anglais «transcriptional factor» TIR de l’anglais «Toll/IL-1 receptor»

TIRAP de l’anglais «Toll/IL-1 receptor (TIR)-associated protein» TK Thymidine kinase

TLRs de l’anglais «toll-like receptors» TNF de l’anglais «tumor necrosis factor»

TRIF de l’anglais «TIR domain containing adaptor inducing interferon» TRL de l’anglais «terminal repeat long»

TRS de l’anglais «terminal repeat short» UL de l’anglais «unique long»

μm Micromètre

US de l’anglais «unique short» VHS Virus herpès simplex

vhs de l’anglais «virus host shutoff»

VCAM de l’anglais «vascular cell adhesion molecule 1» VIH Virus de l’immunodéficience humaine

VLA4 de l’anglais «very late antigen 4» VLP de l’anglais «virus-like particles» VP de l’anglais «virus protein» VVZ Virus Varicelle-Zona WT de l’anglais «wild-type»

Remerciements

Sans l’énorme soutien de plusieurs personnes œuvrant de près ou de loin, les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse n’auraient jamais pu aboutir. Tout d’abord, je tiens à remercier mon directeur de recherche, le Dr Guy Boivin, qui m’a accueilli dans son laboratoire et qui m’a procuré toutes les conditions nécessaires au bon déroulement de mon doctorat. Il m’est difficile de trouver les mots pour signifier toute la gratitude que je lui porte. Sa passion, sa générosité et son humanisme m’ont inspiré et motivé tout au long de mon parcours au sein de son laboratoire. Je lui suis également reconnaissant pour son encadrement scientifique rigoureux, sa disponibilité, et les efforts incommensurables qu’il fournit pour ses étudiants et son personnel de recherche. Je tiens également à remercier ma codirectrice Dr Jocelyne Piret qui m’a encadré, soutenu, aidé et encouragé durant ces dernières années. Je la remercie notamment pour sa disponibilité et les nombreuses discussions que nous avons partagé. Ces directives et conseils judicieux ont énormément contribué à la réussite des différents projets que j’ai entrepris. Je te suis très reconnaissant Jocelyne, mille mercis.

Je voudrais également remercier Dr Serge Rivest et toute son équipe pour leur étroite collaboration et dont le support était décisif pour la réussite de mes travaux. Je remercie aussi Dr Jean Gosselin et son équipe qui ont contribué grandement à la réalisation de mes expériences.

Je remercie Nicolas Boivin qui m’a formé, accompagné et conseillé tout au long de ma maitrise et au début de mon doctorat. Merci Nicolas pour ta générosité hors du commun. Je remercie également Coraline qui était d’un grand support et d’une aide précieuse.

Je voudrais également remercier toute mon équipe qui a été extraordinaire et si agréable durant toutes ces années passées au laboratoire. Sans elle, la vie et le travail n’auraient pas été aussi plaisants. La liste est longue car plusieurs personnes ont quitté parce qu’elles ont fini leur cursus ou parce qu’elles ont tout simplement changé de vie. Alors merci à tous, particulièrement Chantal Rhéaume, Nathalie Goyette, Yacine Abed et ma gaspésienne préférée Julie Carbonneau.

Finalement, je remercie les membres du jury qui ont accepté d’évaluer ma thèse : Dr Jérôme Estaquier, Dr Ayman Elali et Dr Pierre-Yves Bochud.

Avant-propos

La présente thèse de doctorat porte sur l’implication des monocytes sanguins dans la réponse immunitaire innée durant l’encéphalite herpétique expérimentale et les mécanismes qui modulent leur recrutement au SNC. Elle est subdivisée en 6 chapitres. Le premier chapitre consiste en une introduction qui traite des connaissances reliées aux virus herpétiques, plus particulièrement au VHS-1, qui est l’agent étiologique principal de l’encéphalite herpétique. Cette section aborde notamment l'historique et la classification de ces virus, leurs caractéristiques biologiques incluant l’épidémiologie, la pathogénèse et la transmission du VHS, les manifestations cliniques des infections herpétiques ainsi que leur diagnostic et leurs traitements. Cette partie traite également des différents concepts en lien avec la réponse immunitaire qui sont requis pour la compréhension de la thématique étudiée. Le deuxième chapitre présente la mise en contexte et la problématique du sujet, les hypothèses et les objectifs des travaux. Les résultats obtenus sont présentés dans les chapitres 3, 4 et 5.

Le chapitre 3 correspond à un article scientifique dont je suis le premier auteur et qui s’intitule «Infiltration Pattern of Blood Monocytes into the Central Nervous System during Experimental Herpes Simplex Virus Encephalitis». Cet article a été publié dans la revue «PLoSOne» le 23 décembre 2015.

Le chapitre 4 correspond à un article scientifique dont je suis le premier auteur et qui s’intitule «Protective Role of CX3CR1 Signaling in Resident Cells of the Central Nervous System during Experimental Herpes Simplex Virus Encephalitis». Ce manuscrit a été publié dans la revue «Journal of General Virology» le 30 novembre 2016.

Le Chapitre 5 correspond également à un article scientifique dont je suis le premier auteuret qui s’intitule «Both Cerebral and Hematopoietic Deficiencies in CCR2 Result in Uncontrolled Herpes Simplex Virus Infection of the Central Nervous System in Mice». Ce manuscrit a été publié dans la revue «PLoSOne» le 8 décembre 2016.

Finalement, le chapitre 6 traite de la discussion des résultats, des perspectives et de la conclusion.

Durant mon doctorat, j’ai également réalisé des travaux de recherche sur des projets reliés à l’encéphalite herpétique expérimentale qui ont été publiés sous forme d’articles scientifiques. Cependant, les résultats de ces travaux n’ont pas été inclus dans cette thèse. À titre informatif, voici, ci-dessous, les références de ces publications.

Canivet C, Menasria R, Rhéaume C, Piret J, Boivin G. Valacyclovir combined with

artesunate or rapamycin improves the outcome of herpes simplex virus encephalitis in mice compared to antiviral therapy alone. Antiviral Res. 2015 Nov;123:105-13. PMID: 26374952.

Boivin N, Menasria R, Piret J, Rivest S, Boivin G. The combination of valacyclovir with an

anti-TNF alpha antibody increases survival rate compared to antiviral therapy alone in a murine model of herpes simplex virus encephalitis. Antiviral Res. 2013 Dec;100(3):649-53.PMID: 24416771.

Menasria R, Boivin N, Lebel M, Piret J, Gosselin J, Boivin G. Both TRIF and IPS-1 adaptor

proteins contribute to the cerebral innate immune response against herpes simplex virus 1 infection. J Virol. 2013 Jul;87(13):7301-8. PMID: 23596298.

Boivin N, Menasria R, Piret J, Boivin G. Modulation of TLR9 response in a mouse model of

1.

_{Chapitre I: introduction}

1.1.

_{Historique de l’infection par le virus herpès simplex}

La reconnaissance officielle du virus herpès simplex (VHS) comme agent infectieux ayant satisfait aux exigences des postulats de Koch date d’une centaine d’années. En revanche, il est suggéré que les lésions causées par ce virus pourraient avoir été décrites dans la littérature quelques millénaires avant aujourd’hui. En effet, une description des lésions génitales qui ressembleraient à celles causées par le VHS ont été décrites dans des tablettes sumériennes du troisième millénaire avant J-C. Plus tard, Hippocrate avait utilisé le mot grec «herpes» pour décrire des lésions qui s’étalaient sur la peau. Par contre, les lésions décrites dans ces premiers rapports pourraient être attribuées à des infections fongiques, virales ou parasitaires. Celsius avait par la suite décrit une infection herpétique comme étant ronde et se développant le long de la ceinture abdominale, une description qui concorderait avec les signes du zona. Au 17ème _{siècle, John Astruc, médecin du roi Louis XVI, gardait sous}

surveillance des prostituées Françaises qui développaient des infections génitales caractérisées par des récurrences. Ces dernières ont été clairement rapportées par Unna en 1883. En 1896, Fournier avait écrit sur le diagnostic et le traitement des infections herpétiques. Ses conseils portaient sur l’importance de l'hygiène, de l’abstinence, de l’alcool, du tabac et des excès sexuels. Finalement, c’est Vidal qui a mis en évidence la transmission de l’herpès d’un humain à l’autre, démontrant ainsi sa nature infectieuse. Durant les années 1930, Doerr avait suggéré que l’infection par le VHS résultait d’une production endogène par les cellules suite à des stimuli. Une vision plus moderne a été proposée par Burnet et Williams décrivant l’herpès comme étant un agent qui persistait toute la vie dans les cellules et qui pouvait s’activer suite à des stress tels que la fièvre. Le VHS est le premier des virus herpétiques infectant l’humain à avoir été découvert et parmi les plus étudiés. Cet intérêt particulier est dû à la variété des infections causées par les virus de la famille des Herpesviridae, leur capacité à établir la latence et leur réactivation pour déclencher des lésions au site d’’infection initial. Plus de 40 ans après l’isolation du VHS, Schneweis a démontré qu’il existait deux sérotypes de ce virus, soit le VHS-1 et le VHS -2 [1, 2].

1.2.

_{Caractéristiques des virus herpétiques}

Les virus herpétiques ont été classifiés selon l’architecture particulière de leur particule virale. Cette dernière est constituée d’un ADN double brins (db) linéaire (d’une longueur de 124-295 kb), une capside icosaédrique d’environ 125 nm de diamètre contenant 162 capsomères. Leur capside baigne dans une substance amorphe asymétrique portant le nom de tégument qui est entourée d’une enveloppe lipidique contenant des glycoprotéines. Les virus herpétiques ont été classifiés en trois familles en fonction de l’hôte qu’ils infectent : les Herpesviridae (virus infectant les mammifères, les oiseaux et les reptiles), les Halloherpesviridae (infectant les poissons et les amphibiens) et les Malacoherpesviridae (infectant les mollusques) [1, 3, 4].

Les virus herpétiques sont très répandus dans la nature. En effet, la majorité des animaux seraient infectés par au moins un virus herpétique mais il est rare qu’un virus infecte naturellement plus d’une espèce animale. Jusqu’à présent, plus de 200 virus herpétiques ont été identifiés dont 9 infectent l’humain: le virus herpès simplex 1 (VHS-1 ou HHV-1 pour «human herpesvirus-1»), 2 (VHS-2 ou HHV-2), le virus de la varicelle-zona (VVZ ou HHV-3), le virus Epstein-Barr (EBV ou HHV-4), le cytomégalovirus (CMV ou HHV-5), les virus herpès 6A, 6B et 7 (HHV-6A, HHV-6B et HHV-7) ainsi que le HHV-8 associé au sarcome de Kaposi [5].

Les virus de la famille des Herpesviridae pouvant infecter l’humain partagent 4 propriétés biologiques importantes: 1) ils contiennent de nombreuses enzymes impliquées dans le métabolisme des acides nucléiques (thymidine kinase (TK), thymidylate synthétase, dUTPase et ribonucléotide réductase) et de synthèse d’ADN (ADN polymérase (pol), hélicase et primase); 2) la transcription des gènes viraux, la synthèse d’ADN et l’assemblage de la nucléocapside se déroulent dans le noyau; 3) la production de particules virales est généralement accompagnée par la lyse des cellules infectées; 4) les virus de cette famille établissent la latence afin de persister dans leurs cellules hôtes [1].

1.3.

_{Caractéristiques générales et classification des virus}

herpétiques infectant l’humain

Les infections causées par le VHS-1 et le VHS-2 seront développées en détails à la section 1.8.

À la fin des années 1970, avant que les séquences d’ADN et d’acides aminés soient connues, les virus de la famille des Herpesviridae ont été divisés en trois sous-familles connues sous les noms d’Alpha-, Beta- et Gammaherpesvirinae selon certaines différences dans leurs propriétés biologiques. Cette classification est toujours en vigueur et défini la sous-famille des Alphaherpesvirinae comme comprenant le VHS-1, le VHS-2 et le VVZ. Les virus de cette sous-famille se distinguent par un cycle réplicatif relativement court, une propagation rapide en culture, une lyse efficace de la cellule infectée et une capacité à établir une infection latente principalement dans les ganglions sensitifs [3].

L’infection primaire au VVZ résulte en une varicelle qui touche particulièrement les enfants en bas âge. Ce virus établit ensuite la latence principalement dans les ganglions sensitifs crâniens et dorsaux. Chez les personnes âgées ou immunosupprimées, le VVZ peut se réactiver suite à un déclin de la réponse immunitaire à médiation cellulaire. La réactivation cause généralement un zona, une infection qui provoque des lésions cutanées pouvant être accompagnées de fortes douleurs chroniques (douleurs post-herpétiques) chez les personnes atteintes. La réactivation du VVZ peut également résulter en une méningo-encéphalite, une myélite, une vasculopathie ainsi que des lésions oculaires [6].

La sous-famille des Betaherpesvirinae est composée du CMV et des roséolovirus (HHV-6A et 6B ainsi que le HHV-7). La réplication du CMV est plus lente et l’infection en culture cellulaire progresse lentement. Les cellules infectées peuvent prendre de l’expansion en s’élargissant (cytomégalie). La latence du CMV s’établit possiblement dans les cellules hématopoïétiques mais peut aussi se produire dans les cellules endothéliales, les cellules des muscles lisses et les fibroblastes. Ce virus peut causer différentes infections qui sont généralement asymptomatiques chez les personnes immunocompétentes. En revanche, parmi les patients immunosupprimés ayant subi une transplantation, l’infection par le CMV peut

provoquer des maladies très sévères. Les plus communes sont des pneumonies, des infections gastro-intestinales, des atteintes du système nerveux central (SNC) ainsi que des rétinites.

Les HHV-6A et 6B sont généralement contractés durant l’enfance. Ils peuvent être transmis par la salive et les secrétions nasales des personnes infectées durant la période post-natale. De plus, l’ADN du HHV-6 est détectable au niveau des voies vaginales dans les stades tardifs de la grossesse, suggérant une possible transmission aux nouveau-nés durant l’accouchement. Il a été démontré que ces virus peuvent infecter un grand éventail de cellules in vitro telles les cellules T «cluster of differentiation» (CD) 4 (principalement le HHV-6B) et CD8 (HHV-6A), les cellules «natural killer» (NK), les cellules hépatiques, les cellules gliales (HHV-6A et HHV-6B), les cellules épithéliales, les glandes salivaires et les cellules endothéliales. Ces virus sont difficiles à cultiver in vitro et ne produisent pas d’effets cytopathiques importants [7, 8]. In vivo, les HHV-6A et HHV-6B infectent également différentes cellules telles que celles du cerveau, des amygdales, du foie, des reins, mais peuvent aussi infecter les monocytes/macrophages. Globalement, les sites préférentiels où les HHV-6A et HHV-6B établissent la latence sont les cellules T CD4 et les cellules des glandes salivaires.

Les infections primaires au HHV-6 (particulièrement le sous-type B) chez les enfants âgés de 6 mois à 2 ans peuvent causer la roséole. De plus, elles peuvent provoquer des atteintes gastro-intestinales, respiratoires, hépatiques et des syndromes mononucléosiques. La réactivation des HHV-6A et HHV-6B occasionne également des pathologies similaires, particulièrement chez les patients immunosupprimés. Par exemple, autant l’infection primaire que récurrente par ces deux virus peut causer des encéphalites et des méningo-encéphalites. En revanche, il est suggéré que le HHV-6A serait responsable de la majorité des cas d’encéphalites sévères [9-11].

Le HHV-7 infecte les cellules T CD4, qui sont aussi soupçonnées d’être le site de latence, ainsi que les cellules des glandes salivaires. Ce virus se retrouve dans différents organes tels que les poumons, la peau, les reins et le foie. Il est également responsable de certains cas de roséole chez les enfants. De plus, il a été démontré que le HHV-7 pouvait infecter le SNC causant ainsi des encéphalites, particulièrement chez les patients ayant reçu une transplantation de cellules souches hématopoïétiques [12].

Finalement, la sous-famille des Gammaherpesvirinae regroupe le virus EBV et le HHV-8. Ces virus ont un cycle réplicatif lent et infectent principalement les lymphocytes. Le virus EBV est impliqué dans le développement de mononucléose et de maladies lympho-prolifératives des cellules B après une infection primaire s’établissant dans les cellules de la gorge et du pharynx. Dans les pays en voie de développement, la majorité des enfants sont infectés par voie orale au cours de leurs trois premières années de vie, probablement par contact avec les membres de leurs familles et la majorité des infections sont asymptomatiques. Le HHV-8 est un virus oncogène qui peut causer des tumeurs en infectant les cellules endothéliales ainsi que les cellules du tractus gastro-intestinal, les poumons et le larynx (Tableau 1). L’infection par ce virus survient à différents âges commençant à l’enfance, spécialement dans les régions endémiques telles que les pays d’Afrique subsaharienne et du bassin méditerranéen. Les modes de transmission de ce virus ne sont pas complètement élucidés mais il est proposé que la voie orale soit privilégiée. Contrairement aux pays endémiques, il est connu que ce virus se transmet plutôt par la voie sexuelle dans les pays occidentaux, plus particulièrement dans la population homosexuelle masculine. La majorité des infections sont observées chez les personnes immunosupprimées qui développent des tumeurs connues sous le nom de «sarcome de Kaposi» (SK) [7, 13]. Le SK est une pathologie considérée comme étant une maladie angiogénique affectant principalement les cellules endothéliales. Il existe 4 formes cliniques associées au SK : (1) classique ou sporadique, (2) endémique, (3) iatrogénique ou reliées à l’immunosuppression (4) associées aux patients sidéens ou épidémique. Parmi ces types, c’est les formes observées chez les personnes sidéennes qui sont les plus agressives. L’incidence au sein de la population séronégative pour le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) est d’environ 1/100 000 individus alors qu’elle est de 1/20 chez les patients sidéens. De plus, il est décrit que certains patients ayant subi une transplantation d’organes solides peuvent également développer un sarcome de Kaposi en raison du traitement immunosuppresseur. En revanche, la majorité des infections primaires au HHV-8 n’induisent pas de signes cliniques et les cancers qui en résultent ne se manifestent qu’après quelques décennies de latence. Les présentations cliniques les plus souvent associées au sarcome de Kaposi se manifestent sous forme de lésions cutanées. De plus, des lésions peuvent être observées au niveau de la cavité orale, du tractus gastro-intestinal et des poumons.

Tableau 1. La classification, les principales manifestations cliniques et les sites de latence des virus

de la famille des Herpesviridae.

(adapté de [5])

Sous-famille/type de virus Manifestations cliniques Site de latence

Alphaherpesvirinae VHS-1 (HHV-1) VHS-2 (HHV-2) VVZ (HHV-3) Betaherpesvirinae CMV (HHV-5) HHV-6A, HHV-6B et HHV-7 Gammaherpesvirinae EBV (HHV-4) HHV-8 -Infections oropharyngées -Infections oculaires -Encéphalite -Infections génitales -Infections génitales -Infections néonatales -Encéphalite -Méningite -Varicelle -Zona -Syndrome mononucléosique -Rétinite

-Encéphalite chez les fœtus -Pneumonie -Hépatite -Roséole -Pneumonie -Syndrome mononucléosique -Hépatite -Encéphalite (HHV-6A, HHV-6B et HHV-7) -Mononucléose -Lymphome de Burkitt -Carcinome nasopharyngé -Sarcome de Kaposi -Maladie de Castleman

-Lymphome des cavités corporelles

-Nerfs sensitifs et ganglions trijumeaux

-Neurones et ganglions trijumeaux -Ganglions sacrés

-Ganglions sacrés

-Neurones et ganglions trijumeaux

-Ganglions dorsaux -Nerfs crâniens -Cellules endothéliales -Cellules hématopoïétiques -Muscles lisses

-Épithélium des glandes salivaires

-Cellules T CD4

-Cellules myéloïdes progénitrices -Épithélium des glandes salivaires -Poumons

-Monocytes sanguins (HHV-6A)

-Lymphocytes B

-Cellules endothéliales -Lymphocytes B

1.4.

_{Le virus herpès simplex 1}

1.4.1.

_{Description de la particule virale}

Le VHS-1 est considéré comme un gros virus de forme sphérique dont le diamètre est estimé à environ 186 nm mais qui pourrait atteindre 225 nm avec les projections de son enveloppe. Il comporte, de l’intérieur vers l’extérieur, 4 éléments distincts: (a) une copie de l’ADN viral linéaire qui se trouve au centre de la particule virale, (b) une capside icosaédrique composée de 162 capsomères, (c) le tégument, une substance amorphe qui entoure la capside et (d) une bicouche lipidique qui enveloppe toute la particule virale et qui contient 11 glycoprotéines (Figure 1A). Des observations en microscopie électronique ont démontré que la nucléocapside est excentrée avec une partie proche de l’enveloppe et un pôle distal se trouvant à 35 nm de distance de l’enveloppe. Le tégument adopte également une conformation disposée inégalement à l’intérieur de l’enveloppe avec des liens ou «linkers» de 4 nm qui le connectent à cette dernière [1, 5, 13].

1.4.1.1. _{Le génome et le noyau}

Le noyau de la particule du VHS-1 contient l’ADNdb linéaire de 152 260 pb dont le pourcentage en C+G est de 68,3%. Ce génome peut contenir des petites fractions d’ADN circulaire [14-17]. Le noyau contient également des polyamines (spermidines) et des spermines qui pourraient neutraliser jusqu’à 40% des phosphates de l’ADN viral [18]. L’homologie des séquences entre différentes souches de VHS-1 dépasse les 99% pour la majeure partie du génome alors qu’elle n’est que de 83% entre le VHS-1 et le VHS-2. Le génome se présente sous la forme d’une hélice torsadée dont les deux extrémités sont dans une disposition qui favorise leur proximité. Il s’organise en deux segments liés de façon covalente qui sont nommés, selon leurs longueurs, segment «unique long» (UL) et segment

«unique court» (US) (Figure 1B) [19-21]. Ces segments possèdent à leurs extrémités des

séquences inversées et répétées en nombre variable [20]. Lors de la réplication virale, ces répétitions peuvent s’inverser produisant 4 isomères linéaires présents en concentrations équimolaires [22, 23]. Le génome du VHS-1 comporte au moins 77 cadres de lectures ouverts. Il code pour environ 90 transcrits dont 84 sont traduits en protéines. Ces protéines sont

classées en trois groupes selon la chronologie de la transcription de leurs gènes respectifs : (α) codées par les gènes immédiats précoces (2 à 4 h suivant l’infection) [24], (β) codées par les gènes immédiats (4 à 8 h suivant l’infection) et (γ) codées par les gènes tardifs et exprimés suite à la réplication de l’ADN viral (> 8 h post-infection) [1, 25, 26].

Le génome du VHS-1 contient trois origines de réplication nommées oriL et oriS selon la région dans laquelle elles sont localisées [27]. OriL est présente en une seule copie dans le segment UL entre le gène «infected-cell protein» (ICP) 8 et celui de l’ADN pol alors que oriS

est présente en deux copies dans le segment US. Les séquences constituant les origines de

réplication ont une forte affinité pour la protéine virale UL9, aussi nommée «origin binding

protein». Cette protéine est impliquée dans l’initiation de la réplication continue sous forme de cercle roulant produisant des longs concatémères qui seront ensuite coupés durant le processus d’assemblage de la nucléocapside [28-30].

1.4.1.2. La capside

Comme pour tous les virus herpétiques, l’ADN du VHS-1 est empaqueté dans une structure cristalline ressemblant à la capside d’un phage. La capside est composée de 162 capsomères protéiques comprenant 150 hexons, 11 pentons et un portail protéique icosaédrique sous une conformation T=16 qui, une fois assemblés, forment une structure ayant un diamètre d’environ 100 nm [31-33]. La couche extérieure de la capside contient 4 protéines virales principales, VP5, VP26, VP23 et VP19C. VP5, la protéine majeure de la capside est présente en 5 copies dans chaque penton et en 6 copies dans chaque hexon. La protéine VP26 est présente en 6 copies dans chaque hexon et s’agence en forme de cercle localisé sur les pointes de VP5 [1, 34, 35].

Les hexons forment les 20 faces de la particule virale alors que les pentons s’assemblent pour constituer les 12 sommets, donnant ainsi la forme icosaédrique à la capside. Un des sommets est constitué de 12 copies de la protéine codée par le gène UL6 et

constitue le portail par lequel l’ADN viral est encapsidé. Des triplex protéiques formés d’une copie de VP19C et de deux copies de VP23 lient les capsomères adjacents contribuant ainsi au maintien de la forme icosaédrique de la capside [1, 36-38]. Ces triplex sont associés aux protéines de soutien UL25 et UL17 (Figure 2) [38].

1.4.1.3. Le tégument

Le tégument occupe l’espace se trouvant entre la capside et l’enveloppe lipidique [33, 39]. Il est généralement non structuré excepté à quelques endroits tels qu’autour des pentons de la capside. Il contient au moins 18 protéines virales. Les plus étudiées incluent VP16 (aussi connue sous le nom de «α-trans-inducing factor» (α-TIF)) et VP22 qui jouent un rôle dans l’initiation de la transcription des gènes viraux. Certaines protéines (VP1/2) semblent jouer un rôle dans le relâchement de l’ADN aux abords des pores nucléaires [40]. Parmi les protéines tégumentaires, on retrouve aussi UL41, UL17, VP11/12, US9, US10 et US11. UL41 jouerait un

rôle dans la diminution de l’expression des gènes de la cellule hôte favorisant ainsi celle des gènes viraux lors d’une infection productive [41]. En effet, il a été démontré que la protéine du gène UL41, produite lors de la transcription des gènes tardifs (γ) et introduite dans le tégument,

est impliquée dans la dégradation des ARNm des gènes ménagers «housekeeping genes» tels que ceux de l’α-actine et de la β-tubuline ainsi que ceux de la protéine de choc thermique «HSP pour heat shock protein» 70 produite naturellement suite à l’infection. Il a également été démontré que des virions hautement purifiés pouvaient contenir des transcrits cellulaires et viraux. Ces ARNs sont empaquetés au sein du tégument par l’intermédiaire des protéines US11, UL47 et UL49 [1, 42, 43].

1.4.1.4. L’enveloppe

L’enveloppe du VHS-1 est constituée d’une bicouche lipidique d’un diamètre de 170 à 200 nm. Les lipides de l’enveloppe proviennent essentiellement des membranes de la cellule hôte (nucléaire et/ou cellulaire). L’enveloppe contiendrait au moins 11 protéines virales : gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gK, gL, gM, gJ et gN. Il est aussi suggéré que d’autres protéines non glycosylées telles qu’UL20, US9, UL24, UL43 et UL34 seraient présentes dans la partie

intrinsèque de la bicouche lipidique. La glycoprotéine gB possède des séquences d’acides aminés spécifiques qui permettent de différencier le VHS-1 et le VHS-2. La glycoprotéine gC joue un rôle dans l’attachement initial du virion à la cellule hôte. Les glycoprotéines gL, gH, gB et gD sont impliquées dans l’entrée du virus dans la cellule par un mécanisme de fusion. Les glycoprotéines gI et gE lient la portion Fc de l’immunoglobuline G, ce qui a pour but de favoriser la propagation du virus d’une cellule à l’autre [1, 21].

Figure 1. Structure du VHS et de son génome

(A)Structure de la particule virale du VHS-1 et (B) organisation du génome (adaptées de [24] et de [44]).TRL, régions terminales répétées longues; UL, région unique longue; IRL, régions internes

répétées longues; IRS, régions internes répétées courtes; US, région unique courte; TRS, régions

terminales répétées courtes.

Figure 2. Illustration représentant des modèles de capside du VHS.

Les triplex sont en vert, VP5 est en violet clair dans les hexons et en bleu dans les pentons. Les complexes vertex de la capside composés de UL17 et UL25 sont en magenta. L’insert de droite montre

un agrandissement d’un penton (en bleu) entouré par des hexons et les protéines de soutien reliant des triplex adjacents (verts). Adaptée de [38].

1.4.2. _{Le cycle de réplication virale}

L’infection d’une cellule par le VHS-1 se déroule en quatre étapes principales: 1) l’entrée du virus, 2) l’expression des gènes viraux, 3) la réplication de l’ADN et 4) l’assemblage et la sortie des particules virales. Il est à noter que deux étapes successives peuvent se chevaucher chronologiquement. Pour initier l’infection, le virus s’attache à des récepteurs spécifiques à la surface de la cellule provoquant la fusion de l’enveloppe et de la membrane cellulaire. Le complexe tégument-capside est par la suite transporté vers le noyau où l’ADN viral est relâché. La transcription du génome viral, la réplication de l’ADN et l’assemblage de la particule virale se passent dans le noyau. La particule virale acquiert son enveloppe à partir de la membrane nucléaire ou suite à la transition par l’appareil de Golgi. Finalement, le VHS-1 sort de la cellule infectée par bourgeonnement pour infecter des cellules avoisinantes (Figure 3). Toutes ces étapes seront discutées plus en détail dans les prochaines sections [1].

Figure 3. Représentation d’une infection productive par le VHS-1 dans la cellule hôte (adaptée de [45]).

1.4.2.1. Entrée du virus

Des observations en microscopie électronique ont démontré que l’entrée du virus dans la cellule est le résultat de la fusion de l’enveloppe virale et de la membrane plasmique. Cette fusion a été mise en évidence en étudiant l’infection des cellules Vero, des cellules HEp-2 et des cultures primaires de cellules neuronales [46]. D’un autre côté, il a été mis en évidence que le virus pouvait entrer par endocytose dans des lignées cellulaires telles que les cellules HeLa et les cellules des ovaires du hamster de Chine (CHO pour «Chinese hamster ovary») [47-50]. Il existe des éléments déterminants qui peuvent influencer le mode d’entrée du VHS. L’expression de l’intégrine αvβ3 à la surface des cellules CHO permet l’entrée du virus par

endocytose dépendante des radeaux lipidiques et de la dynamine 2 [51]. De plus, les propriétés des récepteurs de la glycoprotéine gD et des nectines influencent également l’entrée du VHS-1. En présence de ces dernières, le virus entre dans la cellule par un mécanisme d’endocytose indépendant des radeaux lipidiques. La nucléocapside emprunte ensuite la voie des phagosomes pH-dépendante et clathrine-indépendante qui est dirigée par le cytosquelette d’actine de la cellule infectée pour finalement aboutir dans le cytosol [52-54].

L’entrée du VHS-1 dans une cellule requiert l’interaction des glycoprotéines gB, gC, gD, gH et gL, qui sont présentes au niveau de l’enveloppe virale, avec des récepteurs membranaires tels que les glycosaminoglycanes (GAG), les nectines, les HVEM pour «herpesvirus entry mediators» et les résidus d’héparane sulfate [1]. La première étape est initiée par l’attachement de gB et gC aux GAG à la surface de la cellule hôte. L’attachement de la particule virale est ensuite renforcé par l’interaction de gD avec des récepteurs HVEM qui appartiennent à la famille des «tumor necrosis factors» (TNF), avec les nectines-1 et -2, qui appartiennent à la famille des immunoglobulines, ainsi qu’aux chaines héparane sulfate [53-61]. Par la suite, l’internalisation du virus commence par la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane cellulaire via un mécanisme qui implique les glycoprotéines gB, gH et gL. Ces deux dernières se lient aux intégrines ou aux récepteurs α de type 2 appartenant à la famille des immunoglobulines pour réguler et contrôler la pénétration du VHS-1 [62]. Cependant, les détails de ce mécanisme ne sont pas bien élucidés. Il est suggéré que ces trois protéines forment un complexe avec gD afin de permettre la fusion complète de la particule virale avec la membrane de la cellule [63]. Suite à la fusion, la capside virale et le tégument sont relâchés

dans le cytoplasme. La nucléocapside migre jusqu’au noyau à l’aide des microtubules par la liaison des protéines du tégument à la dynéine présente sur les microtubules [64-66]. L’ADN viral est ensuite relâché aux abords des pores nucléaires grâce à l’action coordonnée des protéines virales UL36 (VP1/2), UL25 et UL6 et des protéines nucléaires importine-β,

Nup358/RanBP2 et Nup214/CAN [67-69].

1.4.2.2. La transcription des gènes viraux

L’expression des gènes viraux lors d’une infection par le VHS-1 est très bien régulée et s’effectue de façon séquentielle. Plusieurs protéines produites ont un impact sur l’expression des gènes viraux de la séquence suivante ainsi que sur ceux de la cellule hôte. Une fois relâché dans le noyau, l’ADN viral est transcrit par l’ARN pol II de l’hôte dans un ordre chronologique en 5 étapes qui impliquent les gènes immédiats précoces (α), les gènes immédiats (β1 et β2) et les gènes tardifs (γ1 et γ2) [1, 25, 26]. Les gènes immédiats précoces

sont les premiers à être exprimés et sont transcrits en l’absence de protéines virales nouvellement synthétisées. Les protéines produites jouent un rôle important dans les premières étapes de l’infection en préparant l’expression des autres gènes viraux, plus particulièrement, les gènes immédiats. La plupart des protéines α ont des fonctions transcriptionnelles et post-transcriptionnelles régulatrices. En effet, les gènes α codent pour 6 protéines : ICP0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47 et US1.5. Il a été démontré que les protéines

tégumentaires VP16 et VP22 étaient importantes pour l’initiation de l’expression des gènes α en favorisant le recrutement du facteur de transcription «lysine-specific demethylase 1» (LSD1). Plus précisément, VP16 et VP22 forment un complexe avec les protéines «octamer-binding protein 1» (Oct-1), et «host cell factor 1» (HCF-1) [70, 71]. Ce complexe recrute par la suite LSD1 qui déméthyle les histones autour des prometteurs des gènes α permettant leur transcription [72]. La deuxième étape de la transcription des gènes α consiste à recruter des facteurs de transcription cellulaires comme le «transcriptional factor» (TF) II-B et TFII-H et les «TATA-binding protein» par le complexe VP16/VP22 afin d’assurer l’accès de l’ARN pol II et l’initiation de la transcription [73].

Les gènes β1 et β2 tels que UL29, UL23 et UL30 qui codent pour ICP8, la TK et l’ADN

pol virale, respectivement, sont généralement impliqués dans différentes étapes de la synthèse de l’ADN viral. Les protéines produites suite à la traduction de ces gènes servent

aussi à arrêter la transcription des gènes α. Le déclenchement de la réplication de l’ADN viral provoque également la diminution de l’expression des gènes précoces et l’augmentation de l’expression des gènes tardifs qui codent principalement pour les protéines nécessaires à l’empaquetage et à l’assemblage de la particule virale ainsi que les protéines de surface insérées dans l’enveloppe. Les plus importantes parmi ces dernières sont gC, gL, gH, gB et gD [1, 13].

Deux groupes de gènes γ, soit γ1 (ICP5, gB et gD) et γ2 (gC et UL41) ont été

caractérisés en se basant sur la cinétique de leur transcription. Ces deux groupes de gènes sont transcrits successivement durant et après la réplication du génome viral, respectivement. Il a été démontré que la production des protéines γ était dépendante de l’étape de réplication de l’ADN et des protéines ICP4, ICP22, ICP27 et ICP8. Les produits des gènes γ sont habituellement les protéines de structure impliquées dans l’assemblage de la capside. La plus étudiée est la protéine majeure VP5 [1, 74].

1.4.2.3. La réplication de l’ADN viral

La production de nouvelles particules virales suite à l’infection requiert une amplification de l’ADN du VHS-1 dans le noyau de la cellule. Plusieurs protéines issues de la traduction des gènes β préparent la cellule infectée et sont aussi directement impliquées dans la réplication de l’ADN viral en s’assemblant dans le noyau pour former des complexes protéiques nécessaires à l’initiation de la réplication. Le mécanisme par lequel l’ADN du VHS se réplique n’est pas complètement élucidé malgré le fait que l’origine de réplication et les protéines virales impliquées soient bien connues [75]. Les produits majeurs de réplication sont de longs concatémères contenant les séquences UL et Us sous différentes orientations. Il est

généralement accepté que la réplication de l’ADN du VHS-1 soit un processus en deux étapes [29, 76]. Au départ, la protéine UL9 se lie à l’origine de réplication sur le génome viral induisant

ainsi une conformation θ [29]. Dans la deuxième étape, il a été proposé que la réplication s’effectue par un mécanisme de cercle roulant [77]. Les protéines virales impliquées dans le processus de réplication sont UL30/UL42 (l’ADN pol et son facteur de processivité),

UL5/UL8/UL52 (le complexe hélicase-primase) et ICP8, une protéine qui se lie à l’ADN simple

brin (ADNsb) [1, 78-81]. La réplication du virus débute à l’une des trois origines de réplication après la liaison de la protéine UL9 à la protéine ICP8 qui active la fonction hélicase d’U 9. La

liaison d’UL9 conduit à la formation d’une boucle dans l’ADN viral. UL9 et ICP8 forment un

complexe qui s’attache à l’ADNsb et participe au recrutement du complexe hélicase-primase [28, 82-84]. Après le recrutement de ce complexe à l’origine de réplication, ICP8 induit la synthèse d’une amorce à partir de laquelle l’ADN pol synthétise le brin complémentaire (Figure 4). D’autres protéines telles que la TK, la ribonucléotide réductase et l’uracile ADN glycosylase sont importantes pour une réplication efficace in vivo. Il semblerait que des protéines de la cellule hôte telles que l’ADN ligase, la topoisomérase II et l’α-primase seraient aussi impliquées [1, 28, 75].

Figure 4. Mécanisme de réplication de l’ADN du VHS.

Représentation schématique de la réplication de l’ADN du VHS-1 utilisant une conformation en cercle roulant (adaptée de [28]). 1) La protéine UL9 se lie à l’origine de réplication virale et initie la séparation

des brins d’ADN. 2) La protéine ICP8 est recrutée et se lie sur l’ADN simple brin. 3) Le complexe ICP8 et UL9 recrute les autres protéines requises pour la réplication (hélicase-primase et ADN pol). 4) La

réplication est initiée sous forme de boucle (θ). 5) la réplication virale se poursuit par l’adoption d’une configuration en cercle roulant.

1.4.2.4. _{L’assemblage de la capside et l’encapsidation du génome}

L’assemblage de la capside virale se déroule principalement dans le noyau. Il est généralement accepté que la formation de la capside commence par l’assemblage du portail de l’ADN formé par 12 copies d’UL6 et de la protéine d’échafaudage pre-VP22a [31, 85, 86].

La formation de ce portail permet par la suite l’intégration des pentons et des hexons ainsi que des triplex formés par VP19C et VP23 [34, 85]. La protéine majeure de la capside, VP5, ne possède pas le signal lui permettant de se relocaliser dans le noyau et nécessite l’association de VP22 pour y arriver. C’est également le cas de la protéine VP23 qui doit s’associer avec VP19C pour entrer dans le compartiment nucléaire. En effet, les triplex, les pentons et les hexons doivent être pré-assemblés avant de pouvoir s’intégrer à la capside en formation (pro-capside) [86, 87].

Dans le noyau, les protéines VP5, VP19C et VP23 s’intègrent sur la partie externe des protéines d’échafaudage VP21, VP22, VP24 et VP26. VP21 et VP26 sont par la suite clivées par l’activité protéase des produits des gènes UL26 et UL26.5 et formeront des capsides de

type-B. Cette activité clive également la protéine d’échafaudage pre-VP22A, ce qui conduit à la dégradation de celle-ci et à la formation des capsides de type-A. L’incorporation de l’ADN viral dans la pro-capside par les protéines virales telles que le complexe de la terminase (UL15, UL28 et UL33), UL17 et UL25, conduit à la production de capside de type-C (Figure 5)

[88]. Le complexe de la terminase reconnait les séquences de terminaison des concatémères accumulés dans le noyau et les scinde en segments de longueur précise. L’ADN est ensuite incorporé dans la pro-capside, par des portails protéiques grâce à l’activité ATPase du complexe de la terminase. Le complexe ADN/pro-capside est ensuite stabilisé par les protéines codées par les gènes UL6, UL15, UL17, UL25 et UL28 [1, 31, 87].

Figure 5. Illustration des protéines impliquées dans la maturation de la capside du VHS. (Adaptée de [38]).

La procapside sphérique est le précurseur des autres formes de capsides (A, B et C). Elle est constituée de VP5 agencée en pentons (en bleu foncé), en hexons (en bleu clair) qui sont reliés par les triplex (en verts). La procapside contient aussi des anneaux constitués de 12 copies d’UL6 qui

formeraient le portail de la capside. Les protéines d’échafaudage internes incluent la protéase UL26 qui,

une fois clivée, produit VP24 et VP21. L’activité protéase clive également une partie de VP22a, ce qui détache l’échafaudage de la couche supérieure (en rouge). Par la suite, le complexe d’échafaudage peut être maintenu (capside B), perdue (capside A) ou remplacé par l’ADN (capside C).

1.4.2.5.Le bourgeonnement de la particule virale

Le mécanisme de sortie de la particule virale à l’extérieur de la cellule hôte n’est pas complètement élucidé. Il est suggéré que le VHS peut sortir de la cellule par trois mécanismes. La première hypothèse suggère que les virions fusionneraient avec la membrane nucléaire interne pour être dé-enveloppés au contact de la membrane nucléaire externe. La nucléocapside est ensuite relâchée dans le cytoplasme et transportée jusqu’à l’endosome et/ou à l’appareil de Golgi [89]. Les particules virales nouvellement enveloppées empruntent le circuit de l’exocytose pour être finalement relarguées à l’extérieur de la cellule (Figure 6). Le premier enveloppement au niveau de la membrane interne du noyau requiert les protéines virales UL31 et UL34 [90, 91] et l’incorporation des protéines du tégument VP1/2, UL37 et

VP16. La fusion avec la membrane périnucléaire, quant à elle, nécessite les protéines gB et gH/gL [1, 92-96].

Le deuxième modèle suggère que la nucléocapside est doublement enveloppée dans la membrane nucléaire formant des vésicules qui sont ensuite transportées vers la membrane plasmique pour être relâchées. Ce modèle n’est pas unanimement accepté étant donné que la composition de l’enveloppe des particules virales ressemblerait plus à celle de la membrane cytoplasmique qu’à celle de la membrane nucléaire [1, 97, 98].

Le dernier modèle stipule que la nucléocapside sortirait à travers les pores nucléaires et serait transférée à l’appareil de Golgi où elle acquerrait sa nouvelle membrane. Par la suite, la particule virale serait transportée via le système vésiculaire vers la membrane cellulaire pour être relarguée par exocytose [1, 99, 100].

Figure 6. Représentation des stratégies de sortie du VHS-1 des cellules infectées. (Adaptée de [1]).

1.4.3.

_{Propriétés biologiques spécifiques du VHS}

1.4.3.1. _{La latence}

La capacité du VHS-1 à établir la latence dans les ganglions sensitifs est l’une des caractéristiques spécifiques de ce virus [1, 101]. Suite à la réplication virale dans les cellules du site d’infection initial, le virus infiltre les nerfs sensitifs au niveau de leur terminaison axonale par un mécanisme de fusion. La nucléocapside migre ensuite par transport rétrograde jusqu’aux ganglions sensitifs (Figure 7) [102-106]. L’ADN viral persiste dans le noyau des cellules des ganglions sous forme épisomale proche du nucléosome [1]. La modification des