In vivo, CIITA permet l’induction des molécules CMH de classe I et de classe II

Examiner l’expression du transgène est une étape cruciale dans toute étude en transgénie. Dans le cas de CIITA, la question a été approchée à deux niveaux : expression de l’ARN de CIITA transgénique et effet sur l’expression des gènes CMH endogènes. Les huit lignées transgéniques ont été étudiées par la préparation d’ARN à partir des organes suivants : cerveau, muscle, foie, rein, poumon, rate et dans certains cas estomac et cœur. Par RPA, l’expression de CIITA endogène et transgénique, et de TBP comme contrôle, a été analysée comme précédemment (voir partie 3). Les gènes cibles que sont I-Eα et I-Aα sont inclus dans cette série de RPA. L’expression des gènes CMH de classe I K et β2microglobuline a aussi été étudiée.

L’expression du transgène CIITA, clairement distinguée de celle du gène endogène, est présente dans chacune des huit lignées à des degrés variables (Figure 5.3).

Les deux souris des lignées CC50 et CC54 exprimant CIITA sous le contrôle du

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promoteur CMV montrent un profil différent : celle de la lignée CC50 exprime le transgène uniquement dans le rein, tandis que celle de la lignée CC54 montre une expression large à l’exclusion de la rate. Les six lignées MC présentent un profil d’expression similaire. Tous les organes sont positifs pour l’expression du transgène MC selon l’ordre suivant : poumon, rein, rate > foie > muscle >cerveau.

MW Sp Li Ki lu Mu Br Li Ki Lu Mu Br Sp Br Li Ki Lu Mu Sp Br Li Ki Lu Mu Sp Br Li Ki Lu Mu Sp St Br Ki Mu Sp He St Br Li Ki Lu Mu Sp He StBrBalb/c CC54 tg+

MC25 tg- CC54 tg-

tg-CC50 tg+

MC52 tg+

MC42 tg+

MC25 tg+ MC varia tg+

CIITA endo

I-E α

CIITA tg

TBP

I-A α 367

242

190

147

118

Figure 5.3. Expression de CIITA et des gènes CMH-II dans les lignées MT-SRα-mCIITA et CMV-mCIITA. A partir de chacune des huit lignées transgéniques, une souris positive pour le transgène a été analysée ; en plus deux souris négatives de même portée ont été utilisées comme contrôles négatifs. Seules cinq des huit lignées sont représentées. L’ARN total a été préparé depuis le cerveau (Br), foie (Li), rein (Ki),poumons (Lu), muscle (Mu), rate (Sp), cœur (He), estomac (St). Entre 10 et 25 µg ont été utilisés pour chaque réaction de RPA. L’expression des gènes suivants a été examinée : CIITA endogène, CIITA transgénique, I-Eα, I-Aα et mTBP.

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L’expression de CIITA transgénique et endogène a été quantifiée (Figures 5.4 et 5.5). La même méthode a été utilisée ici que dans les parties précédentes de ce travail. La construction transgénique MT-SRα-mCIITA est nettement plus exprimée que la construction CMV-mCIITA dans la plupart des organes. Le profil similaire d’expression du transgène MC dans les différentes lignées de souris est confirmé par la quantification.

Ainsi les poumons, les reins et la rate sont un territoire où le transgène MC est bien exprimé. Ces résultats permettent de classer les souris MC selon un niveau d’expression global pour la souris entière. On peut ainsi les regrouper entre trois collectifs : celles qui expriment le plus haut niveau MC29 (A), MC41 (B), MC42 (C), un niveau intermédiaire MC52 (D) et un niveau plus faible MC25 (E), MC30 (F). Globalement, ces analyses montrent que le promoteur SRα associé au locus MT est efficace pour exprimer CIITA en transgénie.

Le niveau de l’ARNm du gène I-Eα a aussi été quantifié. Une claire induction de I-Eα est observée dans le foie, les reins et aussi les poumons (Figure 5.4). Trois cas de figure apparaissent selon l’état d’expression de CIITA. Première situation : lorsque CIITA est peu exprimé (ni le transgène ni le gène endogène ne sont fortement exprimés), l’expression de I-Eα reste faible. Le cerveau présente ce profil. Deuxième situation : CIITA transgénique est bien exprimé dans un organe non lymphoïde où CIITA endogène est peu exprimé. Dans ce cas, on observe une augmentation de l’expression de I-Eα dans le foie, le rein, ou le poumon. Le niveau de I-Eα monte de dix fois ou plus dans les deux premiers organes et de trois fois dans les poumons. Dernière et troisième situation : CIITA endogène est déjà fortement exprimé, comme dans la rate. Malgré la bonne expression du transgène CIITA dans la rate grâce au promoteur SRα, il n’y a pas d’augmentation nette de l’expression de I-Eα. Dans le cas du muscle, malgré le bruit de fond élevé de la mesure, I-Eα semble aussi être induit. Ces résultats montrent que le transgène CIITA peut induire in vivo l’expression des gènes CMH-II.

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brain muscle liver spleen kidney lung

ABCDEFGHI J ABCDEFGHIJ ABCDEFGHIJ ABCDEFGHIJ ABCDEFGHI J ABCDEFGHIJ

* *

*

* * *

CIITA transgene

brain muscle liver spleen kidney lung

ABC DEFGHI J ABCDEFGHIJ ABCD EFGHI J ABCD EFGHI J ABC DEFGHI J ABCDEFGHIJ

I-Eα

brain muscle liver spleen kidney lung

ABC DEF GHIJ ABCDEFGHIJ A BCD EF GHIJ ABCD EFGHIJ A BC DEF GHIJ ABCDEFGHIJ -1

Figure 5.4. Quantification de l’expression de CIITA endogène, CIITA transgénique et de I-Eα dans les lignées transgéniques CIITA.

L’analyse de l’expression a été effectuée avec de l’ARN issu des organes des lignées MT-SRα-mCIITA (gris), CMV-mCIITA (blanc) et non transgéniques (noir). A partir du gel présenté dans la figure 5.3. et

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de nouvelles analyses RPA pour le cerveau et le muscle, la quantification a été effectuée selon la procédure habituelle. Les unités arbitraires représentent le rapport entre le signal du gène étudié et le signal pour mTBP. Les lignées transgéniques sont présentées ainsi : A) MC29, B) MC41, C) MC42, D) MC52, E) MC25, F) MC30, G) CC54, H) CC50, I) transgenic minus littermate MC25, J) transgenic minus littermate CC54. L’absence de données est marquée par une étoile.

Diverses corrélations ont été établies entre l’expression de CIITA transgénique et endogène et celle des gènes CMH-II. En premier, un effet dose-réponse, entre CIITA et I-Eα, prédit selon les données présentées dans le chapitre 3, a été recherché. Pour cela, seule une partie des organes a été considérée : celle où le transgène CIITA est bien exprimé en absence d’expression forte de CIITA endogène. Ainsi, l’analyse a été ciblée sur les organes où l’action du transgène peut être séparée de celle du gène endogène. Le foie et les reins sont dans cette situation. Dans une certaine mesure, une corrélation, entre le niveau d’expression de CIITA et celui de I-Eα peut être mise en évidence dans le foie (Figure 5.5) et dans les reins (données non montrées). En second, l’induction de I-Aα, qui est normalement corrégulé avec I-Eα a été corrélée de manière quantitative avec celle de I-Eα dans le foie et dans les reins et les poumons (Figures 5.3 et 5.5). Cette corrélation suggère que CIITA transgénique, comme l’endogène, corrégule les gènes CMH-II. En troisième, une régulation de CIITA de type feedback négatif ou positif a été examinée dans tous les organes. A l’exception du foie, le niveau d’expression de l’ARN du gène CIITA n’est pas modifié par la surexpression du transgène CIITA. Dans ce cas, la surexpression de CIITA transgénique pourrait être corrélée avec une hausse de l’expression de CIITA endogène. Ces résultats ne sont pas en faveur d’une importante régulation de type feed back pour CIITA.

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Figure 5.5. Corrélation entre les niveaux d’expression de CIITA endogène, CIITA transgénique, de I-Eα et de I-Aα dans le foie. La quantification des divers ARNm (Figure 5.4) a permis d’établir des corrélations entre ceux-ci. Les valeurs sont issues des analyses des souris transgéniques MC (losange gris), CC50 (losange blanc) et des deux souris non transgénique (carré noir).

L’expression de H2-K et de β2 microglobuline a été étudiée dans les organes suivant : cerveau, muscle, foie, rein, rate et poumon (Figure 5.6). Le gène contrôle utilisé dans ce cas est GAPDH. Ce gène a l’avantage d’être exprimé à un niveau plus élevé que TBP mais malheureusement son expression n’est pas uniforme dans les différents organes L’expression a été quantifiée ensuite de manière semblable aux analyses précédentes. Seules deux des trois lignées souris qui expriment le plus fortement le transgène CIITA induisent nettement H-2K. Dans les deux lignées MC41 et MC42, H-2-K est induit de plus de dix fois dans plusieurs organes. Dans la souris de lignée MC29, on trouve une expression de H-2K à peine supérieure aux contrôles (moins de deux fois de variation). L’expression de la β2 microglobuline ne varie pas dans les tissus à forte

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expression en CMH-I, comme la rate, le poumon et le foie. Dans les tissus, comme le cerveau, le muscle et le rein, plusieurs souris transgéniques montrent au plus une expression de la β2 microglobuline marginalement augmentée. Ces données in vivo suggèrent que CIITA peut effectivement augmenter l’expression des gènes CMH-I lors de certaines situations.

ABCDEF GHIJ A BCDE FGHI J

spleen lung

Figure 5.6. Expression des gènes H-2 K et β2 microglobuline dans les lignées MT-SRα-mCIITA (gris), CMV-mCIITA (blanc) et les contrôles non transgéniques (noir). A partir des mêmes échantillons déjà présentés dans la figure 5.4, l’expression des gènes CMH-I a été étudiée par RPA avec comme gène contrôle la GAPDH. 25 µg d’ARN purifié à partir des organes décrits ont été utilisés pour chaque réaction.

L’absence de données est marquée par une étoile.

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5.5. Le locus artificiel métallothionine confère un effet LCR dans de