Thesis
Reference
Étude du transactivateur CIITA souris : de l'isolement de l'ADN complémentaire à la souris transgénique
OTTEN, Luc Alain Jean
Abstract
La présentation d'antigènes par les molécules CMH-II aux lymphocytes T CD4+ est essentielle pour l'immunité. L'expression des molécules CMH-II est contrôlée surtout au niveau transcriptionnel par CIITA (class II transactivator), qui est lui-même différentiellement exprimé. Ce travail a visé à étudier CIITA chez la souris. La recherche de l'ADNc de CIITA souris a conduit à l'isolement de multiples formes de CIITA. La diversité des ARN messager CIITA provient de divers mécanismes dont celui de l'expression de premiers exons distincts.
Les diverses extrémités 5' résultent de l'activation différentielle de multiples promoteurs du gène CIITA. La modulation artificielle in vitro et in vivo de CIITA et la corrélation in vivo entre l'expression de CIITA et celle des gènes CMH-II montrent que CIITA régule quantitativement l'expression des gènes CMH-II. Ces résultats sur les différentes formes de CIITA et la modulation des gènes CMH-II apportent une meilleure compréhension du rôle de CIITA in vivo.
OTTEN, Luc Alain Jean. Étude du transactivateur CIITA souris : de l'isolement de l'ADN complémentaire à la souris transgénique. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2000, no. Sc.
3146
DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:153799
Available at:
http://archive-ouverte.unige.ch/unige:153799
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UNIVERSITE DE GENEVE
Département de zoologie et biologie animale FACULTE DES SCIENCES Professeur P. Spierer
Département de génétique et microbiologie FACULTE DE MEDECINE Professeur B. Mach
_____________________________________________________________________
Etude du transactivateur CIITA souris :
De l’isolement de l’ADN complémentaire à la souris transgénique
THESE
présentée à la Faculté des Sciences de l’Université de Genève pour obtenir le grade de Docteur ès sciences, mention biologique
par
Luc Alain Jean OTTEN de
Genève (GE)
Thèse N° 3146
GENEVE
2000
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Remerciements
Je tiens à remercier toutes les personnes qui m’ont apporté leur soutien pendant cette thèse. En premier, mes parents et mon frère pour l’aide directe apportée à la réalisation de ce travail. Ensuite, le docteur Claude Bernheim et le professeur Francis Waldvogel qui m’ont encouragé à faire les premiers pas dans une formation scientifique ; Viktor Steimle, qui m’a fourni un suivi global tant pour le travail quotidien que pour la conception de nombreuses expériences ; Bernard Conrad pour les très nombreuses discussions scientifiques et son enthousiasme. Catherine Ucla, Madeleine Zufferey, Samuel Marguerat et Séverine Bontron pour leur aide et leurs encouragements ; Michel Loche, Isabelle Braun et les personnes du laboratoire déjà citées pour une inoubliable atmosphère dans la salle “7148” ; Walter Reith et Michel Strubin et les autres membres du département, pour leurs conseils ; Shozo Izui, Dominique Belin et Joachim Huarte qui m’ont aidé au-delà de leur département respectif . Enfin, je remercie Bernard Mach de m’avoir accueilli dans son laboratoire et d’avoir dirigé cette thèse.
If you can look into the seeds of time And say which grain will grow and which will not.
Speak then to me…
Macbeth. Acte 1, Scène 3
Si vous êtes capables de trouver dans les semences du temps La graine qui va germer Instruisez-moi…
On n’affirme jamais tant de vérités que son caractère
André Gide
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Résumé
La présentation d’antigènes par les molécules CMH-II (complexe majeur d’histocompatibilité de classe II) aux lymphocytes T CD4+ joue un rôle central dans le système immunitaire. Cette interaction est primordiale pour la formation du répertoire des cellules T CD4+ ainsi que pour le contrôle des réponses immunes. Le profil d’expression des molécules CMH-II est extrêmement complexe et résulte d’un fin système de régulation. L’expression des molécules CMH-II est contrôlée surtout au niveau transcriptionnel par CIITA (class II transactivator), qui est lui-même différentiellement exprimé. Chez l’homme, une absence héréditaire de CIITA cause une immunodéficience congénitale. Le facteur CIITA est donc un élément clé de la réponse immune. Contrairement aux autres facteurs nécessaires à l’expression des gènes CMH-II, CIITA ne semble pas lier l’ADN mais fonctionnerait comme coactivateur transcriptionnel. Ce travail a visé à étudier CIITA chez la souris.
La recherche de l’ADNc de CIITA souris a conduit à l’isolement de multiples formes de CIITA. La diversité des ARN messager CIITA provient de divers mécanismes : un épissage différentiel, une polyadénylation sur plusieurs sites et surtout l’expression de premiers exons distincts. Les diverses extrémités 5’ résultent de l’activation différentielle de multiples promoteurs du gène CIITA selon le type cellulaire. Ces multiples transcripts présentent différents cadres de lecture dans leur premier exon et codent pour des protéines CIITA avec des extrémités N-terminales différentes. La modulation artificielle in vitro du niveau d’expression de CIITA et la corrélation in vivo entre l’expression de CIITA et celle des gènes CMH-II ont permis de montrer que CIITA régule quantitativement l’expression des gènes CMH-II. Cette régulation quantitative des gènes CMH-II semble varier selon la forme protéique de CIITA. Ces résultats sur les différentes formes de CIITA souris et la transactivation modulée des gènes CMH-II apportent une meilleure compréhension du rôle de CIITA in vivo. Dans cette ligne, plusieurs souris transgéniques exprimant CIITA dans de multiples tissus ont été générées et sont en cours d’analyse.
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Table des matières
1. INTRODUCTION ...8
1.1. Les molécules CMH... 8
1.1.1 Les molécules CMH classiques... 8
1.1.2 Les molécules CMH non classiques... 9
1.1.3 Génétique des molécules CMH ... 9
1.2. Biologie des molécules CMH ... 10
1.2.1 Fonctions biologiques des molécules CMH ... 10
1.2.2 Synthèse des molécules CMH ... 11
1.2.3 Expression des molécules CMH... 12
1.3. Régulation de l’expression des gènes CMH ... 14
1.3.1 Régulation transcriptionnelle des gènes CMH-II ... 14
1.3.2 Elément en cis : les promoteurs des gènes CMH-II ... 15
1.3.3 Les facteurs en trans : les complexes impliqués ... 16
1.3.4 Etude des patients BLS, une étape essentielle dans le clonage des facteurs régulateurs... 17
1.3.5 Régulation de l’expression des gènes CMH-I ... 19
1.4. CIITA : le modulateur de l’expression des gènes CMH-II ... 20
1.4.1 CIITA régulateur clef des gènes CMH-II... 20
1.4.2 Structure primaire et mode d’action de CIITA... 21
1.4.3 Régulation de CIITA et expression des gènes CMH-II :... 24
1.5. Déficiences des gènes CMH-II chez l’homme et la souris:... 25
2. LES MULTIPLES TRANSCRIPTS DE CIITA CHEZ LA SOURIS ...27
2.1. Isolement de multiples formes d’ADNc CIITA souris ... 27
2.2. Description de la structure primaire de CIITA souris... 29
2.3. ARTICLE : Les multiples promoteurs du gène CIITA ... 34
2.3.1 Résumé de l’article ... 34
2.3.2 Article... 35
2.4 Résultats supplémentaires : Analyse de l’expression du CIITA murin... 36
2.4.1 Détermination des sites d’initiations de transcription du gène CIITA murin... 36
2.4.2 Expression différentielle des multiples formes de CIITA murin... 39
3. ACTION QUANTITATIVE DE CIITA SUR LES GENES CMH-II ...43
3.1. ARTICLE: Contrôle quantitatif de l’expression des molécules CMH-II par CIITA ... 43
3.1.1 Résumé de l’article ... 43
3.1.2 Article... 44
3.2. Approches techniques et mises au point ... 45
3.2.1 Système d’expression de CIITA... 45
3.2.2 Système de mesure de l’activité de CIITA:... 48
6
3.3. Résultats supplémentaires : Modulation fine, in vitro, de l’expression... 49
des CMH-II par CIITA... 50
4. ACTIVITE DES DIFFERENTES FORMES PROTEIQUES DE CIITA ...51
4.1. Expression de multiples formes protéiques de CIITA ... 52
4.2. Comparaison de l’activité des formes protéiques CIITA ... 54
5. ETUDE DE L’ACTION DE CIITA IN VIVO PAR TRANSGENESE ...58
5.1. Introduction ... 58
5.2. Approche et mise au point ... 60
5.3. Etablissement de lignées transgéniques CIITA sous le contrôle d’un promoteur ubiquitaire ... 63
5.4. In vivo, CIITA permet l’induction des molécules CMH de classe I et de classe II... 63
5.5. Le locus artificiel métallothionine confère un effet LCR dans de nombreux tissus ... 70
5.6. Expression de molécules CMH à la surface cellulaire et étude histologique dans les souris transgéniques CIITA... 71
6. DISCUSSION...75
6.1. Structure primaire de CIITA souris... 75
6.2. RACE-PCR et sites d’initiation de transcription ... 77
6.3. Régulation et promoteurs multiples de CIITA ... 78
6.4. Induction de l’expression de CIITA par l’ IFN-γ... 79
6.5. Régulation quantitative des gènes CMH-II par CIITA ... 80
6.6. Multiples formes protéiques de CIITA... 82
6.7. Expression de CIITA in vivo par transgénèse ... 84
7. CONCLUSION...89
8. MATERIELS ET METHODES ...91
Culture des lignées cellulaires, transfection, analyse en FACS... 91
criblage de banque d’ADNc : ... 92
préparation d’ADN de phage : ... 92
Isolation des extrémités 5’ des ARNm CIITA souris par RACE-PCR : ... 93
Numéro des séquences dans Genbank :... 95
Primers : ... 95
Constructions... 96
7
Western CIITA:... 99
Préparations d’ARN : ... 100
Minigel d’agarose pour ARN. ... 102
RNase protection assay (RPA): ... 102
Reverse transcription-PCR ... 105
Préparation de l’insert pour les injections d’ovocytes... 105
Screening des souris transgéniques. ... 106
VII. REFERENCES ...108
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1. Introduction
1.1. Les molécules CMH
1.1.1 Les molécules CMH classiques
Les lymphocytes T reconnaissent des antigènes à la surface des cellules par leurs récepteurs αβ (T cell receptor : TCR αβ). Ces antigènes sont en fait des peptides issus de protéines présentés par des molécules codées par le Complexe Majeur d’Histocompatibilité (CMH ou MHC en anglais)[1]. Les molécules CMH humaines sont nommées HLA (human leucocyte antigen.). Chez la souris, le locus CMH est nommé H-2
[2]. Il existe deux types de molécules CMH classiques, celles de classe I (CMH-I) interagissant avec des lymphocytes T cytotoxiques (CD8+) et celles de classe II (CMH- II) interagissant avec des lymphocytes T auxiliaires (CD4+) (Figure 1.1).
CD8 TCR
CD8+
MHC class I 2 α β αα
MHC class II
CD4
CD4+
APC
TCR
α β β αα
Figure 1.1. Représentation des molécules CMH-I et CMH-II. Les molécules CMH-I, formées d’une chaîne α transmembranaire (α) et de la β-2 microblobuline (2), lient un peptide (trait ondulé). Le lymphocyte T CD8+ reconnaît ce complexe CMH-I/peptide par son récepteur (TCR composé des chaînes α et β) et par son corécepteur CD8. Les molécules CMH-II, à la surface de cellules présentatrices d’antigène (APC), sont composées d’une chaîne α et d’une chaîne β. Les lymphocytes CD4+
reconnaissent ce complexe CMH-II/peptide par leur TCR et leur corécepteur CD4. Chaque domaine Ig est représenté par une ellipse.
Les molécules CMH des deux classes sont des glycoprotéines de surface dotées d’une structure semblable [3]. Ce sont des hétérodimères comportant au total quatre domaines immunoglobulines (Ig). Les molécules CMH-I sont formées d’une chaîne α
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transmembranaire avec trois domaines Ig et d’une chaîne β-2 microglobuline (β2m) soluble avec un domaine Ig. Les molécules CMH-II sont formées de deux chaînes transmembranaires α et β, chacune avec deux domaines Ig. Les deux domaines Ig les plus éloignés de la surface cellulaire lient le peptide et interagissent avec un TCR. Un sillon de la molécule CMH, formé de ces deux domaines Ig, lie le peptide. Malgré une structure générale identique partagée par les molécules CMH-I et CMH-II, il existe des différences importantes dans la forme de leur sillon. Les molécules CMH-II ont par exemple la capacité de lier des peptides plus longs que ne le font les molécules CMH-I.
1.1.2 Les molécules CMH non classiques
En plus des molécules CMH de classe I et II, il existe des molécules analogues peu polymorphiques [1]. Il est possible de les séparer en deux groupes, un premier dont les molécules ont une fonction résidant dans le cytoplasme et le second qui comprend des protéines de surface. Le premier groupe contient les molécules CMH-II “non classiques”
ou “non polymorphiques” (HLA-DM, chaîne Ii et HLA-DO chez l’homme). Ces molécules sont essentielles pour une présentation normale des antigènes par les molécules CMH-II classiques à la surface membranaire [4]. Les structures de la chaîne Ii, de HLA-DM et de H2-M ne possèdent pas de sillon permettant de lier les peptides [5;6]. Ces molécules CMH-II non classiques n’effectuent pas une reconnaissance directe et spécifique des antigènes peptidiques.
Le second groupe est composé des molécules membranaires ressemblant aux molécules CMH-I classiques [7]. Une partie de ces molécules est capable de présenter des antigènes dans leur sillon. Parmi elles, on trouve les CMH de classe Ib [8] et les molécules CD1 [9]. Les antigènes présentés sont des peptides formylés [8] ou des molécules hydrophobes de mycobactéries [10]. Au contraire, les molécules ne possédant pas de sillon fonctionnel ne semblent pas être directement impliquées dans la présentation d’antigène.
On trouve dans ce cas le récepteur néonatal Fc liant les immunoglobulines maternelles, la protéine HFE dont la mutation est reliée à l’hémochromatose et aussi la protéine virale m144 [7].
1.1.3 Génétique des molécules CMH
Les molécules CMH possèdent une diversité élevée, qui concerne essentiellement les molécules CMH classiques. En particulier, les sillons des molécules CMH sont
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extrêmement variés et sont capables de présenter un large éventail de peptides aux récepteurs TCR αβ (revue :[11;12]). Plusieurs facteurs expliquent cette diversité [1]. Premièrement, chaque individu possède plusieurs classes de molécules CMH, qui sont elles-mêmes divisées en isotypes. Ainsi, il existe plusieurs isotypes pour les CMH-I (HLA-A, B, et C chez l’homme ; H-2 K, D, L chez la souris) comme pour les CMH-II (HLA-DR, DP, et DQ chez l’homme ; I-E et I-A chez la souris). Deuxièmement, ces isotypes sont extrêmement polymorphiques et de nombreux allèles ont été décrits.
Toutefois les différents locus codant pour les divers isotypes n’ont pas la même diversité allélique. Ainsi la chaîne α CMH-II d’isotype DR (I-Eα chez la souris) n’est pas polymorphique, tandis que 122 allèles ont été décrits pour DRB. Ces phénomènes expliquent une variété élevée des molécules CMH au niveau de la population et des individus qui sont le plus souvent hétérozygotes pour les gènes CMH.
Les différents gènes CMH-I et CMH-II sont regroupés dans un complexe situé dans le chromosome 6 chez l’homme et 17 chez la souris. Ce complexe est d’une taille considérable et comprend aussi des gènes non apparentés. Le locus CMH-II s’étend sur 1000 kilobases (kb) chez l’homme.
1.2. Biologie des molécules CMH
1.2.1 Fonctions biologiques des molécules CMH
La capacité des lymphocytes de monter une réponse immunitaire spécifique contre un antigène dépend des molécules CMH. L’ontogénie comme la fonction des lymphocytes T dépend de molécules CMH fonctionnelles [13;14]. Dans le thymus, l’interaction CMH classique-peptide-TCR est à la base de la sélection des lymphocytes T CD4 et CD8 qui aboutit aux phénomènes de restriction et de distinction soi/non-soi par les lymphocytes. Il faut souligner le fait que les peptides issus du soi sont présentés par les molécules CMH et participent à la génération d’un répertoire normal des lymphocytes T [15;16]. La présentation de peptides nécessite un « processing » des protéines du soi.
Ainsi, tant les molécules CMH-II classiques que les molécules non classiques impliquées dans le « processing » participent à la sélection thymique des lymphocytes T CD4+. En périphérie, l’expression des molécules CMH est nécessaire pour le maintien d’une population complète de lymphocytes [17-19]. De plus, la réponse des lymphocytes T naïfs à un antigène découle de deux signaux [20] : le stimulus spécifique de l’antigène (signal 1) et une costimulation efficace (signal 2). Le signal 1 dépend strictement de la présence des molécules CMH. Dans des modalités complexes, ces deux signaux vont générer divers
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types de réponses qui peuvent coexister, comme par exemple une stimulation antigénique, une anergie ou encore une délétion.
Les molécules CMH sont impliquées dans des interactions avec d’autres cellules que les lymphocytes T. Un développement normal et une fonction efficace des lymphocytes B dépend des molécules CMH, en particulier la molécule CMH cytoplasmique, la chaîne Ii [21] et probablement du niveau d’expression des molécules CMH-II de surface [22]. La génération des lymphocytes NK respecte le soi grâce aux molécules CMH-I [23]. Il faut de plus mentionner que les molécules CMH-II ne sont pas seulement des ligands : elles joueraient un rôle dans l’activation des cellules APC elles- mêmes, par leur capacité de transmission d’un signal transmembranaire [24].
Les lymphocytes T CD4+ et CD8+ exercent des fonctions différentes dans les réponses immunitaires spécifiques contre un antigène [1]. Les cellules CD8+ effectrices sont les acteurs de la réponse cellulaire cytotoxique. Les lymphocytes CD4+ interagissent avec des cellules présentatrices d’antigène (antigen presenting cell = APC) et sont capables de fournir une fonction d’aide aux lymphocytes CD8+ et aux lymphocytes B.
Ces cellules sont au cœur des processus aboutissant à une non-réponse, une tolérance ou une réponse antigénique. Au vu de leur fonction différente, il n’est guère surprenant de constater que les cellules « partenaires » de ces deux types de lymphocytes sont différentes. Les lymphocytes CD8+ peuvent contacter la vaste majorité des cellules de l’organisme, qui expriment les molécules CMH-I pour la plupart. Au contraire, les lymphocytes CD4+ contactent une minorité de cellules, les cellules APC, qui expriment les molécules CMH-II.
1.2.2 Synthèse des molécules CMH
Il existe des différences majeures entre les molécules CMH-I et CMH-II dans leur structure, dans leur expression et dans leur synthèse, objet de cette partie. La production des molécules CMH classiques chargées de peptides à la surface cellulaire doit être conçue comme la rencontre de deux voies cellulaires : celle de la synthèse des protéines CMH et celle de la dégradation de protéines source de peptides.
Les molécules CMH-I présentent essentiellement des peptides provenant de protéines cytosoliques [25]. Ces protéines appartiennent au soi comme au non-soi comme les protéines virales. Le mécanisme de protéolyse implique le protéasome, un méga complexe de protéines dont certaines sont codées par des gènes situés dans le complexe CMH. Ces peptides, une fois générés dans le cytosol, sont transportés dans le réticulum endoplasmique par un transporteur composé des protéines TAP1 et TAP2. A la suite de
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cette liaison avec les peptides, les molécules CMH-I sont dirigées vers le Golgi puis la surface membranaire.
Les chaînes CMH-II α et β, après leur synthèse dans le réticulum endoplasmique, s’assemblent à la chaîne invariante Ii et traversent le Golgi pour être retrouvées dans un compartiment endosomial. Là, après la protéolyse de la chaîne Ii, les molécules HLA- DM (H2-M chez la souris) catalysent l’échange entre le reste de la chaîne Ii et les peptides destinés au sillon [26]. La fonction de HLA-DM semble être contrôlée par les molécules HLA-DO [27;28]. Après la séparation avec HLA-DM, les molécules CMH-II classiques chargées avec leur peptide arrivent à la surface membranaire. Les peptides présentés sont issus de la dégradation endosomiale de protéines de plusieurs origines : des protéines de surfaces comme les molécules CMH elles-mêmes, des protéines solubles ou des protéines issues d’agents microbiens entiers.
1.2.3 Expression des molécules CMH
Les molécules CMH-I sont exprimées par la plupart des cellules de l’organisme
[29]. Le niveau physiologique varie de manière importante selon le type cellulaire. Dans le système nerveux central, les neurones et les astrocytes n’expriment pratiquement pas de molécules CMH-I. D’autres cellules sont dans la même situation : les cellules du pancréas exocrine, les myocytes et les cellules germinales. A l’opposé, les cellules du système lymphoïde expriment les molécules CMH-I à un niveau élevé. Par rapport aux molécules CMH-I, celles de classe II ont un profil d’expression réduit à une minorité de cellules [30]. Le territoire d’expression des gènes CMH-II comporte des cellules présentatrices d’antigène dérivées de la moelle (APC) et aussi plusieurs types épithéliaux
[31]. L’expression complexe des molécules CMH-II peut être représentée par deux notions
[32]. En premier, deux modes d’expression sont caractérisés : l’expression constitutive trouvée dans un nombre réduit de cellules et l’expression inductible dans la plupart des cellules. En second, les deux modes d’expression ont une importance variable selon le type cellulaire et la combinaison exacte des stimulus.
L’expression constitutive des molécules CMH-II est trouvée dans des types cellulaires de plusieurs origines. Parmi les cellules issues du système hématopoïétique, on trouve les lymphocytes B, les cellules dendritiques et les cellules de la lignée monocytaire résidant en périphérie [32]. Toutes ces cellules sont présentées de manière collective comme APC. L’expression constitutive des molécules CMH-II varie selon le stade de différenciation. Ainsi les lymphocytes B matures expriment fortement les gènes CMH-II mais leurs précurseurs, les cellules pro-B précoces, et leurs descendants, les
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plasmocytes, sont négatifs pour les molécules CMH-II. De manière similaire, les cellules dendritiques varient le niveau et le taux de synthèse des molécules CMH-II selon leur stade de maturation. Même à un stade donné de différenciation, l’expression des molécules CMH-II peut être modulée comme dans les lymphocytes B (voir plus bas).
Parmi les cellules non hématopoïétiques, on trouve plusieurs types cellulaires qui expriment les molécules CMH-II de manière constitutive. Ainsi, selon une étude exhaustive par immunohistologie chez l‘homme [31], les cellules épithéliales des systèmes digestif, respiratoire et urinaire sont positives. Les vaisseaux lymphatiques et capillaires, à l’exception de ceux du cerveau, des testicules et du placenta, sont nettement positifs. La fonction des molécules CMH-II dans ces cellules n’est pas connue.
Un nombre élevé de facteurs peut moduler l’expression des gènes CMH-II. On trouve des facteurs solubles comme les cytokines mais aussi des contacts cellules- cellules, des virus et des facteurs physiques comme les UV. Une vision détaillée de ces multiples facteurs testés sur de nombreux types cellulaires et en combinaison est publiée dans plusieurs revues [30;33]. Quelques points saillants sont détaillés ici. L’interferon- gamma (IFN-γ) est un inducteur puissant dans la plupart des cellules et représente la cytokine principalement étudiée ces dernières années dans la régulation des gènes CMH- II. Quelques cellules semblent ne pas répondre à l’IFN-γ comme les neurones et les cellules endocrines β du pancréas [34]. L’effet de l’IFN-γ peut être modulé par d’autres cytokines comme le TGF-β1 et l’IL-1 qui inhibent son action [35;36], le TNF-α qui l’augmente [34]. L’Il-4 augmente l’expression des molécules CMH-II dans des lymphocytes B. De manière surprenante, cette induction par l’Il-4 peut être inhibée par l’
IFN-γ. Les cellules NK peuvent induire l’expression des molécules CMH-II [37;38]. Des virus comme le CMV peuvent inhiber l’induction des gènes CMH-II [39], d’autres semblent l’induire [40].
Finalement en plus de ces observations effectuées souvent in vitro, il faut noter que l’expression des molécules CMH-II varie selon les situations in vivo [30]. Ainsi, dans le système reproductif, cette expression peut varier selon la période du cycle menstruel ou de lactation. L’activation des lymphocytes T humains (mais pas ceux de la souris) conduit à l’induction des molécules CMH-II. Dans des situations pathologiques, on trouve aussi une altération de l’expression des molécules CMH-II. Cette expression est souvent augmentée dans des cellules constitutivement positives ou même induite lors de rejet de greffe, d’inflammations. Dans les tumeurs, l’expression des molécules CMH-II peut être augmentée ou diminuée et est difficilement corrélée avec la différenciation ou la survie du malade. Pour conclure, il existe des déficiences dans l’expression des molécules CMH-II « MHC class II deficiency » selon la terminologie de l’OMS [32] ou communément appelée Bare Lymphocyte Syndrome (BLS) [41].
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1.3. Régulation de l’expression des gènes CMH
1.3.1 Régulation transcriptionnelle des gènes CMH-II
L’expression des molécules CMH-II est régulée de manière prépondérante au niveau transcriptionnel [33]. Ainsi, l’expression à la surface des molécules CMH-II corrèle avec le niveau d’ARN messager (ARNm) des gènes CMH-II, lui-même déterminé surtout par le taux de transcription des gènes CMH-II. A cette vision de la régulation des gènes CMH-II, il faut ajouter l’importance du trafic cellulaire des molécules CMH-II. Le niveau à la surface comme la demi-vie des complexes CMH-II/peptide peut varier de manière significative par rapport au niveau d’ARNm. Ainsi, l’Il-10 diminue le niveau des molécules CMH-II à la surface cellulaire par augmentation du recyclage [42]. La capture d’antigènes par des cellules APC a été décrite comme aboutissant à une baisse du nombre de molécules CMH-II à la surface. La maturation des cellules dendritiques s’accompagne par un accroissement considérable de la ½ vie des complexes CMH-II/peptides [43].
Les différents gènes CMH-II sont exprimés généralement de manière coordonnée dans de multiples situations [30]. Pour autant, le niveau d’expression des différents gènes n’est pas le même. Chez l’homme, le niveau d’expression est dans l’ordre décroissant : DR > DP > DQ. De manière étonnante, la comparaison du niveau de transcription des différents gènes CMH-II n’a été effectuée que chez la souris : seul le gène I-Aα montre un niveau plus élevé [44]. En dehors de cette expression coordonnée des différents gènes CMH-II qui est la règle, plusieurs cas d’expression non coordonnée de ces différents gènes ont été décrits [45;46].
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1.3.2 Elément en cis : les promoteurs des gènes CMH-II
Les régions régulatrices essentielles des gènes CMH-II sont connues par la combinaison de plusieurs approches : la comparaison des séquences des multiples gènes CMH-II, l’étude fonctionnelle en transfection transitoire des séquences régulatrices CMH-II fusionnées à un gène rapporteur, et finalement la génération de souris transgéniques. Il en découle que l’élément essentiel de la régulation des gènes CMH-II est situé dans les 150 pb en amont du site d’initiation de la transcription.
Les éléments conservés de différents promoteurs CMH-II ont été considérés très tôt comme essentiels à la corrégulation des gènes CMH-II (revues : [32;33;47]). Néanmoins, d’autres éléments spécifiques à certains gènes CMH-II ont été décrits, comme par exemple une boîte oct dans le gène HLA-DRA. Dans les 150 bp proximales, quatre régions conservées sont présentes dans tous les gènes CMH-II étudiés : les boîtes S, X1, X2 et Y (Figure 1.2). La disposition spatiale de ces éléments est remarquablement conservée : l’orientation, l’ordre et la distance entre les boîtes sont retrouvés dans les différents promoteurs. Dans les gènes CMH-II non classiques, une disposition semblable est retrouvée. La boîte X originalement décrite a été redéfinie en deux parties : une boîte X1 (ou X), un palindrome imparfait, et un élément X2 ressemblant aux éléments de réponse à l’AMPc ou au TPA nommés CRE et TRE. La boîte Y contient une séquence CCAAT inversée.
En transfection transitoire, la région promotrice de 150 pb est suffisante pour reproduire l’expression constitutive et inductible des gènes CMH-II. En plus de cette région proximale, des éléments régulateurs plus distants ont été mis en évidence par des études en transgénie. L’importance fonctionnelle des boîtes individuelles X1, X2 et Y a été montrée dans de multiples situations par transfection transitoire. De la même manière, on a montré l’importance de leur espacement respectif. De ces études, il ressort que ces trois boîtes se comportent comme une seule unité fonctionnelle et qu’elles sont essentielles pour l’expression des gènes CMH-II. D’un autre côté, l’importance de la boîte S n’est pas clairement définie. Ces résultats concernant les éléments cis X1, X2 et Y suggèrent que d’importants facteurs trans s’y lient.
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X X2 Y
S
CIITA
X2BP NF-Y
RFX
GGACCTY--13--RTYNCYnNRGYAAY-4-TGACGT--15--ATTGG
MHC class II DM, Ii
Figure 1.2. Les promoteurs des gènes CMH-II : éléments cis et facteurs trans. La région proximale comprise dans 150 pb est suffisante pour le contrôle de l’expression (triangles). Les boîtes S, X, X2 et Y sont conservées dans les promoteurs des divers gènes MHCII (consensus indiqués en bas). La boîte X1 (ou X) trouvée dans d’autres gènes est appelée dans ces cas EF-C ou MDBP. La boîte X2 est similaire à un élément CRE ou TRE et la boîte Y est une séquence CCAAT inversée.
Les complexes RFX, X2BP, et NF-Y lient l’ADN de manière coopérative (doubles flèches). Le transactivateur CIITA, également nécessaire à l’expression, ne lie pas l’ADN.
1.3.3 Les facteurs en trans : les complexes impliqués
La recherche de protéines liant les différentes boîtes conservées des promoteurs CMH-II a été menée par des tests de liaisons in vitro de protéines sur ces éléments cis.
De nombreux complexes ont été ainsi trouvés [33]. Parfois, l’expression différentielle du complexe a pu être mise en corrélation avec celle des gènes CMH-II. Malheureusement, l’importance fonctionnelle de la plupart de ces complexes n’a pas pu être mise en évidence par ces approches [32].
Trois de ces complexes sont réellement essentiels pour l’expression des gènes CMH-II : RXF, X2BP et NFY (Figure 1.2) [32]. Paradoxalement, ces trois complexes sont exprimés de manière ubiquitaire. NFY, composé de trois sous-unités clonées, est impliqué dans l’activation de plusieurs gènes dont les CMH-II [48;49]). Ce complexe lie la boîte Y. X2BP lie la boîte X2 et semble être équivalent à CREB selon une récente publication [50]. RFX, qui lie la boîte X1, est composé de trois sous-unités RFX5, RFXAP et RFXANK [51-53]. Ces trois sous-unités synthétisées in vitro sont suffisantes pour reconstituer l’activité de liaison du complexe RFX [53]. Ceci suggère que le complexe
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RFX est composé uniquement de ces trois unités. RFX5 contient un domaine de liaison à l’ADN et est probablement la sous-unité de RFX qui lie le promoteur CMH-II.
L’existence de ce domaine permet d’inclure le gène RFX5 à la famille des gènes RFX
[54]. Les sous-unités RFXAP et RFXANK ne possèdent pas d’homologie avec la famille RFX ni de site de liaison à l’ADN. Trois motifs « ankirin » présents dans la dernière sous-unité pourraient moduler l’action de RFX.
Les arguments en faveur de l’importance fonctionnelle de ces trois complexes sont basés sur plusieurs types d’expérience. En premier, ces trois complexes lient les boîtes X1, X2 et Y de manière coopérative [55;56]. Ces interactions protéine-protéine sont révélées par une importante augmentation de la ½ vie de liaison in vitro. L’association de ces trois complexes explique l’unité fonctionnelle en cis formée par les trois boîtes X, X2 et Y. En second, RFX et NFY sont nécessaires pour la transcription in vitro de gènes CMH-II [48;49;57]. En troisième, il existe des mutations des gènes codant pour les trois sous-unités de RFX et pour CREB qui abolissent l’activité des gènes CMH-II.
La régulation de l’expression des gènes CMH-II passe essentiellement par l’expression différentielle du transactivateur CIITA (MHC class II transactivator) [58;59]. Une déficience de CIITA abolit l’expression des gènes CMH-II dans la plupart des types cellulaires [60]. Une fois exprimé, CIITA est suffisant pour l’activation spécifique des gènes CMH-II. Son mode action semble être celui d’un coactivateur de transcription [58]. CIITA interagit probablement avec les complexes liant les promoteurs CMH-II et avec la machinerie générale de transcription [61-63]. En conclusion, le modèle actuel de régulation des gènes CMH-II comprend une partie constitutive et une autre qui est régulatrice. Du côté constitutif, on trouve donc sur le promoteur CMH-II les complexes RFX, X2BP et NFY. De l’autre côté, on situe CIITA, qui ne lie pas l’ADN et qui est l’élément régulateur de l’expression des gènes CMH-II.
1.3.4 Etude des patients BLS, une étape essentielle dans le clonage des facteurs régulateurs
La compréhension de la régulation des gènes CMH-II a largement bénéficié de l’étude de patients atteints du syndrome BLS. Le syndrome, présenté plus longuement dans le chapitre 1.5, est caractérisé par l’absence d’expression de tous les gènes CMH-II en mode constitutif ou après induction à l’IFN-γ [64]. Il s‘agit d’une maladie héréditaire autosomale récessive non liée au complexe CMH, ce qui indique que le défaut réside dans l’absence de facteur(s) essentiel(s) agissant en trans [65]. Grâce aux lignées dérivées de ces patients comme de lignées dérivées in vitro, il fut possible d’établir l’existence de
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quatre groupes de complémentation A, B, C et D[66;67]. Le syndrome BLS fut donc supposé avoir différentes causes génétiques. De manière intéressante, ces quatre groupes de complémentation peuvent être distingués par des études cellulaires et biochimiques (revue [68]) [69]. D’un côté, dans les lymphocytes B des groupes B, C et D, on constate l’
absence d’occupation in vivo des promoteurs CMH-II, au niveau des boîtes X, X2 et Y (Figure 1.3) [70;71]. Aucune liaison du facteur RFX ne peut être constatée in vitro[72]. Au contraire dans le groupe A, l’occupation des promoteurs CMH-II est normale in vivo
[70;71]
et la liaison de RFX in vitro est normale aussi.
X X2 Y
S
X2BP NF-Y
RFX
MHC class II DM, Ii
CIITA
CIITA
RFX5 RFXANK
RFXAP
MHC class II DM, Ii
X Y
S X2
A
B
Figure 1.3. Occupation du promoteur dans les différents groupes de complémentation BLS. La transcription des gènes CMH-II est abolie dans le syndrome BLS. Partie A : Le groupe de complémentation A caractérisé par une mutation dans le gène CIITA montre une occupation normale des promoteurs CMH-II par les facteurs RFX, X2BP et NFY.
Partie B : Une absence du complexe RFX est causée par des mutations dans les sous-unités RFX-ANK (groupe B), RFX5 (groupe C) ou RFX- AP (groupe D). Dans ces groupes de complémentation, les promoteurs CMH-II ne sont pas occupés.
La combinaison d’approches génétiques et biochimiques a permis l’isolation des quatre gènes déficients dans le syndrome BLS. La complémentation de lignées BLS par
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transfection de banque d’ADNc a permis d’isoler deux gènes : CIITA (groupe A) et RFX5 (groupe C)[51;58]. Les gènes RFX-AP (groupe D)[52] et RFX-ANK (groupe B)[53]
ont été isolés à la suite de la purification des sous-unités du complexe RFX, dans lequel RFX5 a aussi été retrouvé[52]. La preuve formelle de l’implication de ces quatre gènes comme causes du syndrome BLS vient de deux expériences suivantes : la complémentation des lignées BLS par les ADNc clonés en transfection et la mise en évidence des mutations dans les gènes correspondants des patients. Le syndrome BLS est donc causé par une déficience de CIITA ou par l’absence du complexe RFX. L’absence d’occupation des promoteurs CMH-II dans trois des groupes de complémentation est expliquée par l’atteinte du complexe RFX. Il faut souligner que l’atteinte d’un seul facteur RFX empêche la liaison des autres complexes X2BP et NFY in vivo, ce qui montre l’importance de la coopérativité entre ces complexes. En conclusion, le syndrome BLS est causé par divers défauts dans les facteurs régulant les promoteurs des gènes CMH-II, facteurs qui sont ubiquitaires ou régulés.
1.3.5 Régulation de l’expression des gènes CMH-I
Le profil d’expression des molécules CMH-I est plus large que celui des molécules CMH-II [29;31]. Les éléments régulateurs des gènes CMH-I, qui sont partagés avec divers autres gènes dont les gènes CMH-II [73], vont être brièvement décrits [74-76]. Plusieurs facteurs solubles induisent l’expression des gènes CMH-I dont les interférons de type I et II. Les gènes CMH-I et β2m sont régulés de manière coordonnée. Comme les gènes CMH-II, il existe des éléments régulateurs dans les promoteurs CMH-I qui sont conservés entre les différents isotypes et espèces. Parmi ceux-là, on trouve dans les 200 pb proximaux des éléments tels que les sites NF-κB et ISRE. Récemment, les éléments entre –130 et –100 dénommés site α et enhancer B ont été alignés avec les boîtes S, X, X2 et Y des promoteurs CMH-II [73]. L’espacement typique des gènes CMH-II est conservé. L’expression des gènes CMH-I classiques est partiellement dépendante du complexe RFX. Quoique CIITA ne semble pas nécessaire à cette expression CMH-I, celle-ci peut être induite par CIITA par transfection [77;78]. Ces récentes expériences montrent que les gènes CMH de classe I et II partagent certains éléments régulateurs et expliquent la déficience partielle en molécules CMH-I des patients BLS.
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1.4. CIITA : le modulateur de l’expression des gènes CMH-II
1.4.1 CIITA régulateur clef des gènes CMH-II
Une approche par complémentation génétique a permis de cloner CIITA [58]. Cette technique réside dans la restauration du phénotype sauvage par le gène recherché dans une lignée cellulaire mutante. En pratique, la lignée mutante lymphocytaire B RJ2.2.5 appartenant au groupe A de complémentation et n’exprimant pas les gènes CMH-II a été transfectée par une banque d’expression d’ADNc. Les rares cellules devenues positives en CMH-II furent sélectionnées et permirent d’isoler l’ADNc responsable de la complémentation. L’ADNc ainsi obtenu, lorsqu’il fut à nouveau transfecté dans des cellules RJ2.2.5, permit la ré expression des tous les isotypes HLA classe II. Cet ADNc fut nommé CIITA. La mutation dans RJ2.2.5, un mutant obtenu in vitro, réside dans de larges délétions génomiques dans le gène CIITA. Les patients BLS2 et BCH produisent des protéines CIITA non fonctionnelles présentant des délétions dans la région C terminal [58;79]. Le gène CIITA est situé dans le chromosome 16p13.1-13.2 dans une région synthétique avec celle de la souris.
Parmi les quatre gènes pouvant causer le syndrome BLS, CIITA est le seul gène qui montre un profil d’expression correspondant à celui des gènes CMH-II [58;59] (Figure 1.4). Son rôle essentiel dans l’induction des gènes CMH-II a été établi par les deux expériences que voici. En premier, CIITA est nécessaire car une lignée fibroblastique dérivée d’un patient du groupe A n’est pas capable d’induire les gènes CMH-II en réponse à l’ IFN-γ [59]. En second, la seule induction de CIITA est suffisante pour induire les gènes CMH-II, car la simple transfection de CIITA active l’expression de ces gènes
[59]. Toutes ces données indiquent que CIITA est un régulateur clé de l’expression des gènes CMH-II. Par la suite, le rôle de CIITA dans la régulation de l’expression des gènes CMH-II a été montré dans de multiples autres situations (voir partie 1.4.3). En conclusion, il faut retenir de ces études le rôle essentiel de CIITA dans la modulation de l’expression des gènes CMH-II dans la vaste majorité des situations. Logiquement, la problématique de la régulation des gènes CMH-II s’est déplacée actuellement sur celle de CIITA.
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CIITA
activated T cells B cells
DCs
IFN-γ plasma cells
X X2 Y
S
MHC class IIDM, Ii
X2BP NF-Y RFX
Figure 1.4. Contrôle de l’expression des gènes CMH-II par CIITA.
CIITA est le régulateur de l’expression des gènes CMH-II. La présence de CIITA est suffisante pour induire l’expression des gènes CMH-II.
CIITA est lui-même régulé, exprimé constitutivement dans les cellules B et les cellules dendritiques (DC), induit par l’IFN-γ dans de nombreux types cellulaires, et activement réprimé dans les plasmocytes.
1.4.2 Structure primaire et mode d’action de CIITA
Le mode d’action de CIITA n’a pas encore été élucidé avec certitude. Dès le clonage réalisé, quelques pistes furent ouvertes telles que l’activation du promoteur proximal HLA-DRA par CIITA et la structure primaire de la protéine CIITA ressemblant à celle d’un coactivateur de la transcription [58]. La structure primaire de la protéine CIITA humaine d’une taille de 1130 acides aminés ne montre pas d’homologie avec d’autres facteurs (Figure 1.5). Elle contient des domaines d’activation de la transcription dans la région N-terminale avec un domaine acide et trois domaines riches en prolines, sérines et thréonines. Un motif tripartite de liaison à l’ATP/GTP ainsi que deux régions riches en leucine (LRR, leucine rich repeat) sont aussi présents dans CIITA [58;80]. CIITA ne possède aucun domaine de liaison à l’ADN. Ces éléments suggèrent que CIITA puisse agir comme coactivateur de transcription. Dans ce chapitre, nous allons présenter les données expérimentales en faveur de cette hypothèse.
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1130 aa
30-160
acidic
162-322
P/S/T ATP/GTP LRR
420-7; 461-4; 558-61 1014-1073
Figure 1.5. Structure primaire de CIITA humain. La séquence en acides aminés fait ressortir plusieurs motifs, un domaine acide, un domaine riche en prolines, sérines et thréonines (PST) qui est composé de trois régions, un motif tripartite de liaison à l’ATP/GTP, et deux régions riches en leucine (LRR).
Suite à l’analyse de la structure primaire, on mena des études de structure/fonction avec des mutants perte de fonction, des mutants dominants négatifs et des protéines de fusion [80-83]. Le domaine acide délimité originalement aux positions 30 à 160 a été testé fonctionnellement. Fusionné à un domaine hétérologue de liaison à l’ADN, le domaine minimal gardant une activité transcriptionnelle dans des cellules humaines est limité aux positions 1-125 [62;82]. Ce domaine, exprimé dans le contexte de CIITA a aussi été muté et testé fonctionnellement sur des promoteurs CMH-II en transfection [62] : les positions 124-138 ne sont pas essentielles. La région riche en P/S/T est composée de trois domaines parmi lesquels le premier est dispensable à l’action de CIITA [80]. Cette région est capable d’activer la transcription de gènes CMH-II endogènes en l’absence du domaine acide [83]. La comparaison de divers mutants dominant négatifs suggère que ces deux domaines N-terminaux sont fonctionnellement différents[83]. Par ailleurs, ces deux régions de CIITA ont été remplacées par un domaine hétérologue d’activation de transcription [81]. Cette protéine de fusion garde une capacité partielle d’activer les gènes CMH-II endogène. Ces résultats suggèrent que CIITA agit comme un transactivateur. La partie N-terminale composée des régions acides et P/S/T pourrait agir comme un domaine d’activation. La partie C-terminale pourrait interagir avec les facteurs liés au promoteur proximal.
Deux fonctions de CIITA ont été tout récemment décrites : la capacité de lier le GTP par le domaine tripartite ATP/GTP [84] et la localisation nucléaire de CIITA. Cette localisation nucléaire est corrélée avec la fonction de CIITA dans des mutants de deux régions : la région du consensus ATP/GTP et la région C-terminale [84;85]. Bien que la preuve formelle par l’adjonction d’un domaine NLS exogène manque, il est probable que la fonction de CIITA nécessite sa localisation dans le noyau.
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Plusieurs études in vitro ont désigné des protéines partenaires de CIITA. Ainsi, on trouve plusieurs TAFs [62;63], OBF-1 [86], CBP [87;88] et une protéine spécifique des gènes CMH-II, RFX5[61]. Les interactions sont suggérées par des expériences de cotransfection suivie d’essai de gène rapporteur [86-88]. L’interaction directe est suggérée par des liaisons in vitro par le système GST [62;63] ou par des co-immunoprécipitations dans le cas de CBP
[88]. Les domaines nécessaires à ces synergies ou interactions in vitro ont été déterminés dans certaines cas. Par exemple, le domaine de CIITA impliqué dans la liaison avec CBP est situé dans les 102 premiers acides aminés [87]. Ces expériences sont à considérer avec prudence. Ainsi, la perte d’OBF-1 dans la souris ne semble pas diminuer l’expression des gènes CMH-II [89]. De plus, aucune de ces expériences ne permet d’affirmer avec certitude que CIITA contacte un ou plusieurs de ces complexes sur un promoteur CMH- II.
Dans une situation normale, l’occupation des promoteurs CMH-II par des facteurs de transcription est corrélée à l’état de l’activation de ces promoteurs. Le rôle de CIITA dans l’occupation de ces promoteurs est peu clair, car la situation varie selon le type cellulaire. De manière peu surprenante, la transfection de CIITA dans des cellules inductibles à l’IFN-γ provoque l’occupation des promoteurs CMH-II en même temps que l’activation de ces gènes [90;91]. L’interprétation de cette expérience par le groupe de J.P.
Ting fut que CIITA possède une capacité d’induction de l’occupation des promoteurs CMH-II. A l’opposé, l’occupation des promoteurs CMH-II ne dépend pas de CIITA dans les lymphocytes B [70;71]. En effet, dans les cellules B déficientes en CIITA, l’occupation des promoteurs CMH-II est présente et n’est pas suivie par l’activation transcriptionnelle.
Le mécanisme par lequel CIITA induit l’occupation des promoteurs CMH-II n’est pas connu. Une action directe sur les facteurs RFX, X2BP et NFY semble peu probable car ni l’expression de ceux-ci ni leur capacité de liaison aux promoteurs CMH-II n’est affecté par CIITA [91;92].
Finalement, à l’heure actuelle, on doit conclure que l’effet de CIITA sur les promoteurs CMH-II reste mal connu. Il est possible que cet effet passe par la formation d’un complexe associé à RFX dont les constituants ne sont pas connus [82]. Seule certitude : les boîtes des promoteurs CMH-II S, X, X2 et Y et les complexes associés sont essentiels à l’action de CIITA. Tant le mode d’action que les cibles de CIITA doivent encore être étudiés. Une avancée à ce sujet pourrait être la purification de CIITA en association avec d’autres complexes ou la détermination d’une fonction biochimique in vitro pour CIITA.
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1.4.3 Régulation de CIITA et expression des gènes CMH-II :
La régulation de l’expression des gènes CMH-II est principalement déterminée par celle de CIITA [58;59]. L’expression régulée de CIITA, très vite reconnue, a été corrélée avec celle des gènes CMH-II dans de très nombreuses études. Cette corrélation a été établie dans les lymphocytes B [58] et T [93], les plasmocytes [94], les monocytes [60] et les cellules dendritiques [60]. Le rôle de CIITA dans l’induction des gènes CMH-II par l’IFN-γ a été confirmé dans un bon nombre de types cellulaires par transfection. On trouve des fibroblastes [95], lignées épithéliales (issues du système urinaire [96], du sein
[97], etc), cellules gliales [98] et des trophoblastes [99]. L’importance de CIITA dans de nombreux tissus a été confirmée par la génération de souris knock-out pour CIITA [60]. A l’exception de rares cellules dont des cellules épithéliales thymiques, CIITA est indispensable à l’expression des gènes CMH-II dans de nombreux types cellulaires.
L’induction des gènes CMH-II par différents facteurs solubles a été réexaminée en tenant compte de CIITA [59;95]. L’action de l’IFN-γ sur les gènes CMH-II est modulée par plusieurs facteurs. Cette modulation semble s’exercer souvent sur l’expression de CIITA. Ainsi, le TGF-β [100;101], l’IL-1β [102], le dextran sulfate [103], et le virus CMV [104]
réduisent l’induction de l’ARNm de CIITA par l’IFN-γ. L’induction de CIITA par d’autres facteurs que l’exposition à IFN-γ a été peu étudiée. Dans ce cas, on trouve seulement un modèle d’atteintes rénales par ischémie et médicament [105].
Le modèle actuel de la régulation des gènes CMH-II inclut comme essentiels les facteurs liant le promoteur proximal et CIITA comme régulateur. Il existe quelques exceptions. D’abord, certains types cellulaires étudiés semblent pouvoir exprimer les gènes CMH-II en absence de RFX ou CIITA [60;106;107]
. Ainsi, certaines cellules dans le thymus de souris déficientes en CIITA continuent d’exprimer des molécules I-A [106]. De manière intéressante, l’induction des molécules CMH-II par des les lymphocytes NK ne nécessite pas CIITA [38]. Plusieurs types cellulaires sont ainsi capables d’induire l’ARNm des gènes CMH-II sans induire CIITA.
La cascade d’activation de l’expression de CIITA par l’IFN-γ a été étudiée plus récemment. Plusieurs types de kinases dont des kinases sérine/thréonine sont impliquées.
A la suite de la liaison de l’IFN-γ à son récepteur, la voie Jak/Stat est activée avec l’activation de Jak1, Jak2 et de Stat1 [108]. L’induction de CIITA nécessite l’expression de Jak-1 [95] et deux facteurs en aval : Stat-1 [109;110] et IRF-1 [111;112]. Au niveau du gène CIITA, trois facteurs importants ont déjà été caractérisés par A. Muhlethaler-Mottet [112] : Stat1, IRF-1 deux facteurs inductibles et USF qui n’est pas induit au contraire des deux premiers facteurs.
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1.5. Déficiences des gènes CMH-II chez l’homme et la souris:
La déficience en CMH-II est un syndrome d’immunodéficience primaire définie en médecine clinique par l’absence d’expression des molécules CMH-II et une réponse antigénique anormale (revue :[64]). Le terme de déficience en CMH-II officialisé par l’OMS remplace l’expression « bare lymphocyte syndrome » [41] qui comprend les situations de réductions d’expression des gènes CMH-I et CMH-II sans référence à une immunodéficience . L’absence d’expression des gènes CMH-II, élément clé du diagnostic, est évidente dans les lymphocytes périphériques. On y trouve en plus une réduction partielle et variable de l’expression des molécules CMH-I [41;113]. Chez certains patients, une expression résiduelle en CMH-II dans le stroma thymique [114] et dans les cellules de Langerhans [64] a été décrite . Le nombre des lymphocytes CD4+ est réduit.
Les immunoglobulines sériques de tout isotype sont réduites comme les anticorps spécifiques à un challenge antigénique. Cette maladie rare débute dans les premiers mois par des infections récurrentes des voies digestives et aériennes. L’origine est variée : bactérienne, virale, fongique et parasitaire. L’immunodéficience conduit à d’inexorables infections virales qui aboutissent au décès avant l’âge adulte. La greffe de moelle, le seul traitement curatif, est moins efficace que dans d’autres cas d’immunodéficiences.
Les souris déficientes dans l’expression des gènes CMH-II ont été générées de trois manières. Il existe des souris déficientes dans les gènes structuraux CMH-II [115-117]. D’autres souris sont dépourvues des facteurs régulateurs RFX-5 [106] ou CIITA [60;107;118]
. L’expression constitutive et inductible des gènes CMH-II dans des souris déficientes en CIITA ou en RFX5 est absente dans la plupart des tissus. Pourtant, il existe une expression résiduelle qui est différente selon le gène régulateur atteint. Dans les souris CIITA-/-, c’est le cas des cellules épithéliales thymiques dans le cortex et la medulla [60]. Un second knock-out de CIITA [107], qui n’est pas une mutation nulle (seul le second ATG subit une délétion qui conserve la phase de lecture), induit un phénotype avec une expression résiduelle plus importante dans les cellules dendritiques et les lymphocytes B des centres germinatifs. Dans les souris RFX5 -/-, ce sont une partie des cellules dendritiques de la rate et les lymphocytes B activés qui expriment encore des molécules CMH-II. L’expression des différents gènes CMH de classe I et II est altérée à des degrés divers. L’expression des gènes CMH-II classiques est la plus réduite et celle des gènes H2-M et de l’Ii ne l’est que partiellement [60]. L’expression de H2-O n’est pas altérée.
L’expression de gènes CMH-I est réduite dans les lymphocytes T dans les souris RFX-5 - /- [119]. Cette atteinte de l’expression des gènes CMH-I est retrouvée chez l’homme dans des lignées déficientes dans différentes sous-unités de RFX [120]. L’absence de CIITA ne
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semble pas avoir de répercussions sur l’expression des gènes CMH-I [59;60]. Toutes ces données montrent l’importance de CIITA et de RFX-5 pour une expression normale des gènes CMH-II chez l’homme et la souris. Les différences observées entre les knock-out RFX-5 et CIITA ne sont pas en faveur d’une interaction exclusive entre CIITA et RFX.
De manière inattendue, ces résultats révèlent une régulation partiellement partagée des diverses classes de gènes CMH et l’existence de voies alternatives dans la régulation des gènes CMH-II. Les mécanismes moléculaires de ces voies alternatives sont à découvrir.
Malgré l’existence d’une expression résiduelle des CMH-II, toutes ces souris montrent un phénotype de type BLS. Le nombre des lymphocytes CD4+ périphériques est fortement restreint. Ces quelques lymphocytes CD4+ ont des marqueurs d’activation augmentés [60;107] et ne donnent pas une fonction d’aide normale aux lymphocytes B [106]. Le transfert de moelle de souris CIITA -/- dans une souris receveuse sauvage permet de produire des cellules CD4+ normales [60]. Cette expérience indique que la réduction des lymphocytes CD4+ est liée à une expression anormale des molécules CMH-II par des cellules non dérivées de la moelle dans le cortex thymique et peut-être aussi en périphérie. Les lymphocytes B CIITA-/- se différencient normalement au contraire des cellules B sans chaîne Ii [121]. Selon une toute récente étude utilisant des souris CIITA -/- exprimant des molécules CMH-II sous le contrôle d’un promoteur CMH-I, les lymphocytes T CIITA -/- montreraient une différenciation Th1/Th2 anormale avec une absence de répression de la réponse Th2 [122]. En conclusion, les études par transgénèse des facteurs régulateurs des gènes CMH-II fournit un modèle animal pour le syndrome BLS et un moyen d’étudier de nouvelles fonctions de ces facteurs.
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2. Les multiples transcripts de CIITA chez la souris
A la suite du clonage de CIITA chez l’homme, l’isolation de l’équivalent souris fut le point de départ de cette thèse. De manière inattendue, plusieurs types d’ARNm de CIITA souris furent isolés. L’explication réside dans l’existence de multiples promoteurs dans le gène CIITA et la mise en œuvre d’épissage différentiel. Ces découvertes sont présentées sous la forme de résultats non publiés et d’un article dans le journal EMBO.
2.1. Isolement de multiples formes d’ADNc CIITA souris
A partir d’une banque amplifiée d’ ADNc de rate de souris Balb/c [123], 1,1 x 106 clones furent étalés et criblés à basse stringence avec l’ADNc complet CIITA humain.
Après trois cycles de sélection, les clones positifs pour CIITA furent sous-clonés dans Bluescript. Par l’établissement de carte de restriction et par hybridation, il fut déduit que 5 clones indépendants avaient été isolés. Ils présentent tous des séquences qui se chevauchent. Un seul clone, numéroté 4B, possède un cadre de lecture fonctionnel commençant au deuxième ATG [58]. En amont de cet ATG, aucune identité n’avait été retrouvée avec l’extrémité 5’ du ADNc original de CIITA humain. Par analyse par RNase protection assay (RPA) du clone 4B, il fut déduit que celui-ci possédait une partie 5’
incomplète et partiellement épissée (Figure 2.1). Les autres clones commencent au minimum 1 kb plus en aval et possèdent plusieurs types d’extrémités 3’ non traduites (voir suite du chapitre). Après ce criblage et ces RPA, l’isolement des transcripts CIITA souris (mCIITA) a été poursuivie du côté 5’et dans la région codante. Le côté 3’, déjà isolée plusieurs fois par ces clones, n’a pas bénéficié d’une recherche systématique.
L’étude de côté 5’ a montré l’existence de transcripts avec trois types d’extrémités 5’.
Ces ARNm décrits comme type I, III et IV sont issus de multiples promoteurs du gène CIITA (voir les points 2.2. et 2.3).
Une région de 147 pb chez l’homme (positions nucléotidiques 597 à 743) code pour la première région riche en proline/sérine/thréonine de CIITA. L’absence de cette région dans le clone 4B a motivé une recherche d’épissage alternatif dans les deux espèces. La région correspondante chez la souris a été étudiée par RT-PCR. Seuls des transcripts sans cette région de 147 pb ont été détectés dans les cellules induites à l’IFN-γ et une rate de souris Balb/c. Par ailleurs, au niveau du gène CIITA, aucune région correspondante aux 147 pb humain n’a été retrouvée dans un clone génomique issu de la souche 129 par Catherine Ucla [124]. Chez l’homme, la RT-PCR dans la lignée Raji a permis de détecter à la fois la forme longue contenant ces 147 pb et la courte (données non montrées). Par RPA, l’existence d’une forme courte a été montrée dans les
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lymphocytes B soit en lignées soit dans des tissus (Figure 2.2). Cette forme courte représente une minorité des transcripts de CIITA dans les diverses situations étudiées ; le rapport en les deux formes ne varie guère dans les diverses cellules. En conclusion, la région de 147 pb codant pour le premier domaine P/S/T est présente dans la majorité des transcripts CIITA humain dans divers types cellulaires. Ces résultats sont en accord avec les données du laboratoire de J. Boss [125]. Chez la souris, ce domaine est absent dans le gène CIITA de plusieurs souches différentes.
4B AAA
1 2 3 4 5
0
2 AAA
1 AAA
h I AAA
ATG ATG
ATG
3
7 AAA
6
Figure 2.1. Clones ADNc CIITA souris.
L’ ADNc CIITA humain de type I (hI) est montré comme référence. Sa partie codante comprend 2 ATG, une partie spécifique issue de l’exon 1 forme I (gris foncé) et un exon de 147 pb soumis à l’épissage alternatif (gris clair). Les parties non traduites sont en blanc. La partie 3’
comporte un élément ALU (rayé) et un poly A (AAA).
Le clone ADNc numéro 4B possède une partie codante partant depuis le second ATG et ne possède pas la région correspondant à l’exon de 147 pb chez l’homme. L’extrémité 5’ est incomplète et comporte une partie de l’exon 1 de type I (gris foncé) et le début de l’intron attenant (blanc).
Le clone 2 possède une partie 3’ non traduite avec une séquence répétitive riche en A (rayé). Le clone 1 possède une partie 3’ non traduite différente. Dans la partie partagée, avec les clones 4B et 2, 107 bp sont absents suite à un probable épissage alternatif. La partie plus en 3’ diverge des clones 4B et 2 (gris) et présente une séquence répétitive riche A différente directement suivie par un poly A. Le clone 3 est formé dans sa partie 3’ d’un intron. Le clone 7 partiellement séquencé montre lui aussi une extrémité 3’ totalement différente avec une séquence répétée CA6 (rayé) directement suivi d’un poly A.
