CONCLUSION - Étude du transactivateur CIITA souris : de l’isolement de l’ADN complémentaire à l

Ce travail, qui a débuté par l’isolement de l’ADNc CIITA, a disséqué de nombreuses étapes intermédiaires menant à l’expression des gènes CMH-II : la régulation de la transcription de CIITA par sa multiples promoteurs, la régulation quantitative de l’expression de CIITA par l’IFN-γ, la régulation quantitative de l’expression des gènes CMH-II par CIITA, les différentes formes de protéine CIITA et le potentiel de transactivation de ces différentes formes sur les gènes CMH-II. Finalement, une approche par transgénie visant à étudier l’action de CIITA in vivo est en cours.

La comparaison entre des gènes homologues de différentes espèces est un complément des études structure-fonction. Les études délimitant les domaines fonctionnels tels que les régions acide, P-S-T et C-terminale [80;81;125]

forment un tout cohérent avec le degré de conservation de ces domaines entre l’homme et la souris.

L’absence du premier domaine P-S-T comme la moindre conservation de la fin du domaine acide appuient la notion d’un domaine d’activation de CIITA qui est en fait séparé en deux parties : la partie acide et la partie P-S-T ^[83]. Malheureusement, toutes ces données au sujet de la structure-fonction de CIITA n’ont toujours pas permis d’éclaircir de manière définitive le mode d’action de CIITA.

L’utilisation spécifique de différents promoteurs CIITA régule l’expression de ce gène à la fois chez l’homme et la souris. L’activation de ces promoteurs CIITA s’effectue en plusieurs modes qui sont liés soit à des états de différenciation cellulaire soit de simples inductions. La synthèse de plusieurs ARN de CIITA avec des codons d’initiation différents est le résultat direct de l’utilisation de plusieurs promoteurs CIITA.

Fonctionnellement, il faut noter que CIITA est le facteur quantitativement limitant pour l’expression des gènes CMH-II et que les différentes protéines CIITA ne possèdent probablement pas la même capacité d’activer les gènes CMH-II. La synthèse de ces données suggère que des protéines CIITA différentes par leur extrémité N-terminale sont exprimées selon le promoteur en action. De simples enhancers agissant sur un seul promoteur ne donneraient pas cette régulation supplémentaire au niveau protéique. On peut ajouter que le profil d’utilisation des divers promoteurs CIITA corrèle avec l’existence de différents compartiments fonctionnels CMH-II. A ce jour, il n’existe pas de données corrélant l’utilisation d’un promoteur particulier de CIITA avec une fonction immunologique précise. Considérés ensemble, tous ces éléments suggèrent que la régulation complexe de CIITA s’effectue à plusieurs niveaux : les promoteurs multiples, les ARNm avec des premiers exons distincts et les protéines avec leurs différentes extrémités N-terminales. Pour finir, la complexité de ce système apparaît comme paradoxale et intrigante si on regarde le nombre limité de gènes cibles de CIITA. En

effet, la plupart des facteurs de transcription ont un nombre élevé de gènes cibles.

Pourtant, la régulation de leur propre expression n’est souvent pas modulaire et complexe comme celle de CIITA. Cette complexité de CIITA est peut-être le reflet de la grande nécessité d’adaptation des fonctions immunitaires dépendantes des gènes CMH-II.

L’étude de la biologie de CIITA peut être englobée dans des sujets bien plus larges comme celui du système immunitaire adaptatif. En immunologie expérimentale, l’isolation du gène CIITA souris permet d’envisager plusieurs expériences axées sur la biologie des molécules CMH-II. Les promoteurs multiples représentent des outils pour des études par recombinaison homologue pour inactiver in vivo la capacité de présentation d’un compartiment CMH-II donné. L’activation des gènes CMH-II par un transgène CIITA permettra de présenter des peptides et des superantigènes, qui ne nécessitent pas de processing ^[148]. La probable incapacité de CIITA d’activer le processing d’antigènes est un point essentiel à aborder par les études fonctionnelles in vivo. Enfin, l’utilisation en transgénie d’un promoteur CIITA permettant l’expression d’un ADNc d’intérêt permet de poser des questions dépassant vraiment le cadre de la biologie de CIITA ou des gènes CMH-II.

Les cas cliniques de l’immunodéficience congénitale causée par le « Bare lymphocytes syndrome »^[64] ont été le primum movens du clonage de CIITA ^[58]. Une absence de CIITA fonctionnel est une des causes de ce syndrome. CIITA n’a pas été impliqué dans d’autres pathologies héréditaires chez l’homme ou la souris. Son implication dans des pathologies acquises n’est pas exclue. En effet, la fonction de CIITA pourrait être altérée, sans qu’un allélisme soit en cause. D’ailleurs, des études ont déjà montré que la fonction de CIITA peut être inhibée par des virus ^[104]. On pouvait craindre qu’une activation inadéquate de CIITA, dont l’action est finement contrôlée, pourrait causer certaines pathologies comme des maladies autoimmunes ou autres.

L’absence de pathologie décelée dans les souris transgéniques MT-SRα-mCIITA éloigne cette crainte et permet d’envisager avec plus de confiance d’éventuelles thérapies géniques utilisant CIITA ^[174].

En conclusion, l’isolation de l’homologue souris du CIITA humain a permis de fournir un outil en immunologie expérimentale chez la souris. De manière imprévue, un système de régulation complexe de CIITA composé de multiples promoteurs et de plusieurs formes protéiques a aussi été découvert.

8. Matériels et méthodes

Ce chapitre va détailler les méthodes utilisées qui présentent des particularités.

Les méthodes courantes qui ne sont donc pas décrites ici peuvent être trouvées dans les recueils classiques de méthodes ^[130].

Culture des lignées cellulaires, transfection, analyse en FACS

Culture. Les lignées Raji, et RJ2.2.5, sont cultivées dans du RPMI 1640 (GibcoBRL), 10% sérum de veau fœtal (FCS) (Inotech), 100 U pénicilline/streptomycine / ml, 2mM L-glutamine, à 37°C , 5% de CO2. Les lignées Hela, HtTA (dérivée de Hela, exprimant l’activateur tTA), LMTK sont cultivées dans du DMEM et MEMa avec les mêmes conditions par ailleurs.

Transfections. Les lignées Raji et RJ2.2.5 sont transfectées par électroporation Dans ces lignées, la sélection antibiotique se fait à une concentration d’hygromycine (Calbiochem) de 200 µg/ml dès la reprise de la croissance vers le deuxième jour. Les lignées Hela, HtTA et LMTK sont transfectées par précipitation au calcium phosphate et sélectionnées de manière similaire avec l’hygromycine (100 et 400 µg/ml).

Protocole d’électroporation :

- récolter 5 à 10 x 10⁶ cellules en croissance, centrifuger - reprendre les cellules dans 750 µl de RPMI sans FCS - ajouter 20 µg d'ADN, 200 µg d'ARNt, incuber sur glace 10’

- électroporer à 250 Volts, 960 µFA (GenePulser, BioRad) - reprendre immédiatement dans RPMI complet

Inductions. Les transfectants HtTA tet-op/mCIITA induisent l’expression des molécules CMH-II après l’arrêt de la doxycycline hydrochloride (SIGMA). Les transfectants fraîchement sélectionnés par billes (Dynal) pour l’expression en CMH-II, sont soumis à la doxycycline 10 ng/ml (renouvelée tous les deux jours) pendant 2 semaines pour obtenir des cellules négatives en CMH-II. L’induction maximale est observée après 4 jours d’arrêt de la dox. Une induction de 50% est observée après 4 jours de dox à 80 pg/ml.

L’expression du CIITA endogène dans les cellules HtTA a été obtenue par une exposition de deux jours à une dose unique d’IFN-γ produit en E. Coli (GIBCO BRL).

Site Internet sur le système tetracycline :

Un site comportant d’utiles informations a été ouvert et permet d’obtenir plus de données : http://www.zmbh.uni-heidelberg.de/bujard/.

Anticorps pour FACS. Les anticorps utilisés sont les suivants : l’anticorps spécifique pour les molécules MHCII DR est le 2.06, pour DP le B7/21, pour DQ le Tü22. Pour les références de ces anticorps voir ^[58]. Le deuxième marquage se fait avec l’anticorps lapin anti-IgG souris couplé au FITC (fluorescéine isothiocyanate) (Serotec). Pour les analyses dans les cellules souris, l’anticorps reconnaissant les molécules MHCII I-E est le 14-4-4S (anti I-E^k) (Pharmingen), et celui reconnaissant les MHCII A le MKD6 (anti I-A^d) ou le SN82 (don de H.R. MacDonald) ont été utilisés ^[175]. Ces anticorps sont couplés à la biotine, et le second marquage est fait avec le conjugué streptavidine-FITC STAR2B (Serotec).

Procédure de marquage de FACS :

- laver 300’000 cellules au 2 ml PBS-BSA (solution à +4°C), centrifuger

- incuber avec 1er anticorps 30’ à 4°C, centrifuger - laver au PBS-BSA, centrifuger

- incuber avec le second anticorps ou avidine fluorescent 30’ à 4°C, centrifuger - reprendre en 300 µl de PBS-BSA.

- exclure les cellules mortes par incorporation iodure de propidium juste avant l’analyse en FACS

criblage de banque d’ADNc :

La banque ADNc souris a été fabriquée à partir d’ARN de rate de souris Balb/c inséré par un linker EcoRI dans le phage λgt10 (banque amplifiée fabriquée par E. Barras). Le criblage se fait en trois cycles afin d’obtenir des clones isolés de phages. Les phages positifs ainsi obtenus ont été amplifiés par culture sur boîte (plate stock pouvant être stocké à +4^o).

Procédure d’un cycle de criblage :

- titrer, par dilution sérielle, la banque d’ADNc de rate de souris Balb/c - étaler 1,1 x 10⁶pfu sur boîtes de Petri

- répliquer sur filtres nitrocelluloses (BA85, Schleicher&Schuell) - préparer les filtres selon la technique de Benton Davis, fixer 2h 80^oC - hybrider les filtres :

a) mouiller les filtres en 6x SSC

b) préhybrider: 4x SSC, 5x Denhardt, 0,1% SDS, 5 mM EDTA, 200 µg/ml ADN de hareng dénaturé, 4 h. à 60°C

c) hybrider: renouveler le mixe, ajouter 1x10⁶ cpm/ml de sonde dénaturée, O/N à 60°C.

NB : La sonde hCIITA ADNc complet a été marquée par random priming.

- laver les filtres dans chacun des bains suivant 1x 30 min à 60°C:

- 3x SSC, 1x Denhardt, 0,1% SDS - 3x SSC, 0,1% SDS

- 2x SSC, 0,1% SDS - 1,5x SSC, 0,1% SDS - 1x SSC, 0,1% SDS

- dès le deuxième cycle de criblage : 0,5x SSC, 0,1% SDS

- exposition par autoradiographie de films Kodak XAR au minimum O/N avec écran - repiquage des clones

préparation d’ADN de phage :

Après la préparation d’ADN, l’analyse des inserts des phages a été faite par enzymes de restriction et par hybridation dans le gel d’agarose avec comme sonde l’ADNc CIITA humain. Les clones indépendants ont été sous-clonés dans BS dans le site EcoRI.

préparation des phages : - 10 ml plate stock de phages

- ajouter 10 ml de 20% PEG 600/2M NaCl dans tampon SM, 1 h sur glace, centrifuger 20 min à 3000 rpm, enlever tout le surnageant (Kimwipe).

- resuspendre le culot dans 2 ml de LB, ajouter 2 ml de DE52 froid (en LB), mélanger en inversant les tubes 30 fois, centrifuger 5 min à 4000 rpm, transférer le surnageant dans un tube propre

- ajouter 1 vol. de DE52 (env. 1,8 ml), mélanger en inversant les tubes 30 fois, centrifuger 5 min à 4000 rpm, transférer le surnageant dans un tube propre (2x)

purification de l’ADN : ajouter pour 2 ml de surnageant :

- 17,5 µl de Protéinase K (0,1 mg/ml) et 85 µl de SDS 10%

- incuber 10 min à RT

- ajouter 346 µl de KAc 3M, 25 min à 88°C, 20 min sur glace - centrifuger 15 min à 4 °C à 4000 rpm, récupérer le surnageant - extraire au phénol/chloroforme, puis au chloroforme

- ajouter 1 vol. d'isopropanol froid, 30 min à -70°C, laisser remonter la température à 20°C - centrifuger 15 min à 10’000 rpm, laver à l’éthanol 70 %

- resuspendre le culot dans 50 µl de TE pH 8.0

Isolation des extrémités 5’ des ARNm CIITA souris par RACE-PCR :

Les réactions de RACE PCR ont été effectuées à partir d’ARN total de rate Balb/c et la lignée macrophage MT2 induite avec de l’IFN-γ (J. Philipp, Zürich). Les conditions générales sont détaillées dans le kit RACE-PCR (GIBCO BRL) (24). Différents couples de primers ont permis l’isolation des diverses extrémités. L’utilisation des primers 5’ADXSC et mR16 primers a permis d’isoler les exons 1III and 1IV. La partie 5' de l’exon 1I a été amplifiée par le primer mR3 situé dans l’exon 1I (séquence à partir du clone 4B isolé de la banque d’ADNc). La jonction exon1I-exon 2 fut amplifiée par une PCR standard avec les primers mF2 and mR16.

Synthèse du 1^er brin de l'ADNc : - mélanger :

2 µl oligo mR13 (50 ng/µl) 1 µl ARN total (1µg/µl) 11 µl H2O

- incuber 10 min à 70 °C, puis sur glace 1 min - ajouter:

4 µl tampon de RT 5x (Gibco BRL) 1 µl 10 mM dNTPs

2 µl 0,1 M DTT 0,5 µl RNase Inhibitor

- mélanger doucement, incuber 2 min à 42°C

- ajouter 1 µl Superscript RT RnaseH minus (200 U) (Gibco BRL) - Incuber 30 min à 42°C, puis évent. 5 min à 55°C

- ajouter 1 µl RNaseH (2U), centrifuger 5 sec.

- incuber 10 min à 55°C, centrifuger 5 sec., mettre sur glace Purification de l'ADNc

Utilisation des colonnes Qiaquick PCR purification kit ou "Glass Max DNA isolation spin cartrige" (Gibco BRL), protocole ci-dessous :

- chauffer 100 µl H₂O à 65°C/tube

- ajouter au 1er brin d'ADNc 95 µl de solution de liaison (NaI) (équilibrée à température ambiante) - transférer le mélange ADNc/NaI dans une colonne Glass Max, centrifuger 20 sec. à 13'000 g - laver 3x avec 400 µl éthanol 70% (4°C), centrifuger 20 sec. à 13'000 g

- enlever tout résidu : jeter le liquide de lavage, centrifuger 1 min à 13'000 g - transférer la colonne dans un nouveau tube

- éluer l'ADNc avec 50 µl H₂O (à 65°C), centrifuger 20 sec. à 13'000 g Adjonction d'une queue de poly dA à l'ADNc

- lyophiliser l'ADNc, puis resuspendre dans 16,5 µl H₂O - incuber 10 min à 70 °C, puis 1 min sur glace, centrifuger 5 sec.

- ajouter:

5 µl tampon de synthèse 5x 2,5 µl 2 mM dATP

1 µl TdT (Boehringer, 10 U/µl)

- incuber 10 min à 37°C, puis 10 min 70 °C, centrifuger 5 sec., mettre sur glace Amplification par PCR

1) Première PCR

- préparer un mélange sur glace : 11.75 µl H2O

2 µl tampon de synthèse (sans MgCl₂)10x 2 µl MgCl₂ 10x

0,4 µl 10 mM dNTPs chacun 1 µl oligo m-R15 (2,5 pmol/µl)

1,25 µl oligo adaptateur ADXSC (2,5 pmol/µl) 0,5 µl oligo adaptateur XSCT17 (2,5 pmol/µl) 0,1 µl de Taq ADN polymérase 5 U/µl (Cetus) - ajouter l’échantillon en dernier : 1 µl l’ADNc - conditions de cycles :

Pause 94°C, mettre les tubes 1 X 5’, 94°C

10 X 30’’, 94°C 30’’, 65°C -1°C/cycle 30’’, 72°C

20 X 30’’, 94°C 30’’, 55°C 30’’, 72°C

1 X 5’, 72°C

Pause 4°C, enlever les tubes 2) Seconde PCR (nested PCR)

- purification par Qiaquick de l’amplifiat - préparer un mélange :

12.25 µl H2O

2 µl tampon de synthèse (sans MgCl2)10x 2 µl MgCl₂ 10x

0,4 µl 10 mM dNTPs chacun

1 µl oligo m-R16 ou m-R3 (2,5 pmol/µl) 1 µl oligo adaptateur ADXSC (2,5 pmol/µl)

0,1 µl de Taq ADN polymérase 5 U/µl (Cetus) - ajouter l’ADN (1/100 de l’amplifiat)

- mêmes conditions de cycle que la précédente amplification - clonage dans BS et séquençage

Numéro des séquences dans Genbank :

mouse CIITA ADNc type III : AF42158 mCIITA clone ADNc 4B : AF042159 mCIITA exon 1 type I : AF000006 mCIITA exon 1 type III : AF000007 mCIITA exon 1 type IV : AF000008 mTBP ADNc : D01034

I-Eα génomique haplotype d : J00396 IEa ADNc haplotype u : M12818 I-Aα ADNc haplotype k : M11357 hCIITA ADNc type III : X74301 SV40 : V01380

Primers :

Les positions 5' end de chaque oligonucléotide sont indiquées entre parenthèses. Les séquences de référence pour CIITA souris sont celles des exons 1 de type I, III et IV et celle de l’ADNc complet de type III. Les positions +1 souris correspondent aux +1 humaines. Les nucléotides en minuscules sont des séquences adaptatrices ou mutées. Les nucléotides soulignés forment un site de restriction utilisé pour des sous-clonages.

CIITA :

mIVF1 : 5'-AAG CTt CTA GaA GCC ACG GAG CTG G-3' (5’ : +2 dans exon 1V) mF2: 5'-AGC TGG GTC TGC AAC AG-3' (5’ : 302 dans exon 1I)

mF3b: 5’-GGT GGA AAC ACT GGC AAT GTG-3’ (5’ : 3280) mF4 : 5’-GGC AGC TAC CTG GAA CT-3’ (5’ : 227)

mhF8 : 5’-tat aaC TCG AGG GCC TGA GCA AGG-3’ (5’ : 464)

mF16: 5'-CTG Gtc tAG AGG CGA CTC CAG GC-3' (5’ : +39 dans exon 1I) mF17: 5'-GAT Atc tAG AGG CAT GTG AGG GAT G-3' (5’ : -2 dans exon 1III) mR3, 5'-TGC AGA CCC AGC TCA AG-3' (5’ : 314 dans exon 1I)

mhR13: 5’-aat aaT GTG AAG GGG CTG GTG GAG-3’ (5’ : 854) mR15: 5’-GCT GGG TAT CCT GGA ACA CG-3’ (5’ : 464) mR16: 5’-CCC GGG TCT CTT CAT CC-3’ (5’ : 410) SV4O T antigen :

SV40-R1 : 5’-GTA GCC TCA TCA TCA CTA GAT GG-3’ (5’ : 4468) Adaptateurs de RACE-PCR :

5’ ADXSC: 5’-gac tcg agt cga cat cg-3’

5’XSCT17: 5’-gac tgc agt cga cat cga t17-3’

I-E α (haplotype d):

IEAK-F1: 5’-AGG AAC ACA CCA TCA TCC AGG-3’ (genomic 5’ : 1482, ADNc 5’ : 6)

Clones issus du criblage de la banque ADNc de rate souris :

Après une hybridation positive avec l’ADNc hCIITA, les inserts des phages ont été sous-clonés par leur linker EcoRI dans BS via le site EcoRI.

Clone Clones

Sous-clones dérivés depuis le clone 4BII dans BS :

Ces divers clones sont tous dérivés de l’insert du phage 4, dans deux orientations différentes par rapport au promoteur T7 de BS. Les sous-clones ont été générés par délétion.

Clone Méthode Orient. Extrémité

5’ selon

Constructions CIITA dans BS :

Les diverses constructions mCIITA sont toutes dérivées de l’insert du phage 4. La construction ADNc mCIITA courte pouvant coder pour CIITA de type IV a été générée par délétion et correspond à la construction 4BIIdBdH (tableau ci-dessus). A partir de cette construction, les divers ADNc CIITA de type I, III et IV ont été reconstitués de la manière suivante : a) RT-PCR pour chaque extrémité avec les divers oligos mF16 + mR15, mF17 + mR15, et mCIITAIVF1-R15 b) digestion de l’amplifiat PCR par XbaI en 5’ et StuI en 3’ c) ligation du plasmide receveur 4BIIdBdH digéré à XbaI et StuI 4) contrôle par séquençage.

La construction MCS1, cassette d’expression pour transfection, permet d’insérer des promoteurs.

MCS1 contient les 3 parties suivantes : a) vecteur BS/KS digéré BamHI + EcoRI, b) fragment CIITA (4BIIdBdH) BamHI- blunted AccI, c) fragment SV40 T intron blunted SpeI-EcoRI. Le fragment SV40 ^[176] a subi une délétion interne Sau 3AI (fourni par M. Bradel, Munich) ; il contient les nucléotides SV40 suivants : 4713-4100 (Sau 3AI) puis (Sau 3AI) 2774-1782. L’intron SV40 est situé dans les positions : 4637-4572. Les sites poly A sont situés dans les positions : 2637 et 2606.

La construction TG1, dérivé de MCS1, contient un intron supplémentaire pour augmenter l’expression en transgénie. L’intron 10 de mCIITA de 1,2 kb a été inséré comme fragment HindIII-SfiI (positions 1271 et 2270 dans 4B) dans la construction MCS1. L’intron sépare les positions 1288 et 1289.

La construction CMV-TG1 contient le promoteur CMV 600 pb provenant de la construction PBKCMV (Stratagene).Le promoteur a été inséré comme fragment blunted NsiI-NheI dans le vecteur TG1 linéarisé blunted XbaI + SpeI.

La construction MT-mCIITA a été construite à partir d’une construction intermédiaire SRα-TG1. Cette dernière construction a été réalisée ainsi : le promoteur SRa provenant du vecteurpcDL-SRα-206 a été isolé comme fragment blunted HindIII-NheI et inséré dans le vecteur TG1 linéarisé blunted XbaI + SpeI. La construction LCR/MT # 2999, fournie par Palmiter, diffère de la construction publiée MT5’/MT3’. Les deux LCR MT5’ et MT3’ encadrent la cassette d’expression possédant un polylinker composé des sites EcoRI-NotI-EcoRI. La construction MT-SRα-mCIITA est issue d’une ligation en 3 fragments : MT5’ ClaI-NotI + SRα-TG1 NotI-EcoRI + MT3’ EcoRI-ClaI (contient pBS).

Les constructions Tet-MCS1 et Tet-TG1 contiennent le promoteur inductible à la tetracycline

PhCMV*-1 isolé comme fragment blunted XhoI-XbaI depuis le plasmide pUHD10-3 (fourni par H.

Bujard, Heidelberg). Ce fragment a été ligué aux vecteurs MCS1 et TG1 linéarisés par blunted XbaI + SpeI.

Nom Origine Clone Fragment

CIITA

2) sous-clones CIITA dans vecteurs épisomaux type EBO :

La construction EBO-4B provient de la ligation entre le fragment 4BII EcoRV-NotI (polylinker pBS des deux côtés) avec le vecteur SLH76 linéarisé blunted SacI-NotI.

La construction EBO-4BdelBamHI provient de la ligation entre le fragment 4BIIdB blunted BamHI-SalI (contenant polylinker pBS) avec le vecteur SLH76 linéarisé blunted SacI-SalI.

La construction EBO-4Bshort provient de la ligation entre le fragment 4BIIdBdH blunted BamHI-SalI (sans polylinker pBS) avec le vecteur SLH76 linéarisé blunted SacI-SalI.

Les constructions EBO-mCIITA I et III contiennent les ADNc de CIITA reconstitué dans pBS. Les fragments CIITA XbaI-SalI ont été insérés dans le vecteur SLH76 digéré avec NheI-SalI. La construction EBO-mCIITA IV provient de la ligation entre le fragment SacI-SacI 5’ de CIITA IV reconstitué dans pBS

Nom Clone Vecteur Extrémité

5’ CIITA

Clones autres que CIITA souris :

Les constructions contenant les inserts I-Aα (clone KS/IA#2), I-Eα (clone KS/IEA#1) et mTBP (clone KS/mTBP#2) ont été obtenues ainsi :

1) réaction RT-PCR en 3x 20 µl (voir sections primers et RT-PCR).

2) traitement à la Klenow : augmenter MgCl2 à 5 mM des amplifiats frais, ajouter 1-2 U Klenow, incuber 16 ⁰C, 30’

3) phosphorylation : augmenter MgCl2 à 10 mM, 1mM ATP, ajouter 30 U T4 PNK, incuber 4 ⁰C, 10’

4) purification des fragments selon kit Qiaquick

5) ligation des fragments amplifiés + 100 ng vecteur pBS/KS linéarisé EcoRV/SmaI, déphosphorylé et purifié sur gel. Incuber avec 1mM Hexamine Cobalt (Sigma) et 400 Weiss Units de ligase (N.E.B.), 16 ⁰C, O/N.

6) contrôle par séquençage des constructions

Western CIITA:

Préparation des extraits.

- récolter 10x10⁶ cellules et centrifuger. Resuspendre et laver avec du PBS sans BSA.

- casser les cellules : mettre 15’ à -70°C (possible de conservation pendant quelques semaines à mois) - reprendre le culot en 90 µl de tampon CSH 1x. Incuber 30’ sur glace. Centrifuger 20’ à 4°C à 13000

rpm.

- récupérer le surnageant, environ 75 µl. Ajouter 13µl de glycérol (15% final). Conserver l’extrait à-70°C, quelques semaines maximum ou utilisation immédiate

- mesurer la concentration (kit Bradford de Biorad), normalement environ 9 µg/µl pour RJ et Raji.

- charger sur le gel 30 à 50 µg (5 µl) en 1x loading buffer, plus 5% de β-mercaptoéthano final. Bouillir les échantillons et le marqueur de poids pendant 5’ avant charger.

Gel 7.5%.

A = gel, B = stacking gel. Gel à utiliser dans les heures du casting pour une meilleure résolution.

- Mix pour A: 2.5 ml acrylamide:bisacrylamide 30:0.8; 1.25 ml Tris 3M pH 8.8; 100 µl SDS 10%; 4.98 ml H2O; 100 µl glycérol; 1 ml EDTA 20mM; 60 µl APS 10%; 4.7 µl Temed.

- Mix pour B: 1 ml acrylsec :amide:bisacrylamide 30:0.8; 400 ml Tris 1M pH 6.8; 60 µl SDS 10%; 3.52 ml H2O; 1 ml EDTA 20mM; 45 µl APS 10%; 3 µl Temed.

- Migration; 30 mA / gel. Arrêter la migration pour détecter RFX5 lorsque le bleu est à quelques millimètres, pour détecter CIITA seul, lorsque le bleu est sorti, en Tris-glycine-SDS.

Transfert.

- Enlever la partie stacking du gel. Mettre le gel 15’ dans le tampon de transfert.

- Activer la membrane (PVDF Immobilon-P Millipore) 30’’ dans le méthanol, 2’ dans H2Odd, 15’ dans le tampon de transfert.

- Transfert semi-sec (Trans-Blot SD, BioRad) : sandwich décrit de bas en haut: 3 papiers Whatmann mouillés dans le tampon de transfert, la membrane activée, le gel traité, 3 Whatmann mouillés dans le tampon de transfert, le tout coupé très précisément aux dimensions du gel. Respecter la durée et le

Dans le document Étude du transactivateur CIITA souris : de l’isolement de l’ADN complémentaire à la souris transgénique (Page 105-0)