Comparaison de l’activité des formes protéiques CIITA

4. ACTIVITE DES DIFFERENTES FORMES PROTEIQUES DE CIITA

4.2. Comparaison de l’activité des formes protéiques CIITA

Afin d’évaluer directement l’activité des diverses formes protéiques de CIITA de type I, III et IV, deux types d’analyse ont été effectuées en parallèle. Ainsi, j’ai mesuré la quantité de l’effecteur, c’est-à-dire le niveau de protéine CIITA, et le résultat de l’action de CIITA, dans ce cas le niveau d’ARNm de HLA-DRA. Vu que les transfectants CIITA I et IV n’expriment que leur forme respective, une corrélation directe peut être établie (Figure 4.2). Pour les transfectants CIITA III qui expriment les formes protéiques III et IV, la mesure de CIITA a été effectuée sur les deux formes en même temps. A partir de deux séries de transfections indépendantes, les quantités de protéine CIITA ont été mesurées en prenant soin d’établir une courbe de titration par densitométrie et ImageQuant. La quantité d’ARNm DRA a été mesurée au PhosphorImager suivi d’ImageQuant (Figure 4.3). Ces deux types de mesures ont été corrélés dans un graphique (Figure 4.4).

La protéine CIITA de type IV est exprimée à des taux différents selon l’extrémité 5’ non traduite incorporée dans la construction transfectée. Il existe une corrélation positive entre le niveau d’expression de CIITA IV et le niveau d’expression de HLA-DRA. A partir de ces trois points, une droite de régression a été établie pour estimer l’activité de cette forme. Un niveau comparable d’ARNm HLA-DRA est retrouvé dans les transfectants CIITA I, III et IV. Il faut noter que ce niveau d’expression de DRA est obtenu avec des quantités de protéine CIITA de type I et d’un mélange III et IV qui sont significativement plus faibles (4 et 2 fois moins environ) que le niveau d’expression de la protéine CIITA IV. Ces résultats suggèrent que la protéine CIITA IV aux niveaux atteints dans ce système est limitante pour l’expression de DRA. De plus, ils suggèrent aussi que les protéines CIITA de type I et III sont plus actives que la forme CIITA IV de plusieurs fois.

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

CIITA protein

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

DRA mRNA

m4S

mIV m4B

mIII mI

Figure 4.4. Efficacité relative des formes CIITA I, III, et IV. Les résultats proviennent de deux séries de transfections dans RJ2.2.5 (une des 2 a été présentées dans les figures 4.2 et 4.5). Les niveaux des protéines CIITA détectés en Western ont été quantifiés par densitométrie avec le programme ImageQuant. Le niveau d’expression du gène CMH-II HLA-DRA détecté par RPA a été quantifié dans ces divers transfectants par RPA de manière usuelle. Une droite de régression avec la déviation standard est montrée pour l’action de CIITA de type IV sur l’expression de DRA. Pour standardiser les expériences, l’unité de mesure arbitraire utilisée est la valeur de l’échantillon divisée par celle du transfectant 4S de la même expérience.

L’expression des molécules CMH-II à la surface de ces transfectants a été étudiée (Figure 4.5). Les trois types de transfectants qui n’expriment que la protéine CIITA de type IV montrent le niveau attendu de molécules HLA-DR, DP et DQ. Ainsi, les transfectants m4B, mIV et m4S qui expriment une quantité croissante de protéine CIITA IV et d’ARNm DRA induisent un niveau croissant de molécules CMH-II à la surface (voir en particulier DQ). Ces résultats ont été obtenus de manière reproductible dans trois séries indépendantes de transfection. Les niveaux d’expression de DR, DP et DQ des transfectants mCIITA I, III et IV ont été comparés. Une mesure de la fluorescence moyenne (MFI transfectant / MFI Raji) a permis de comparer trois séries de transfection.

Malgré quelques variations expérimentales (Figure 4.5), aucune différence n’a pu être objectivée entre les niveaux d’expression en HLA-DR, DP et DQ à la surface des transfectants mCIITA I, III et IV (données non montrées). En conclusion, ces résultats montrent une parfaite corrélation entre l’expression des gènes CMH-II au niveau de l’ARN et des molécules à la surface. De manière intéressante, ces résultats montrent à

nouveau que la régulation quantitative de CIITA sur le niveau d’expression des gènes CMH-II est une modulation fine et graduelle.

Figure 4.5. Analyse de l’expression de HLA-DR, DP et DQ dans les

transfectants CIITA murin de type I, III et IV. La série de transfectants générés dans la lignée RJ2.2.5 avec les contrôles, déjà analysée pour l’expression de CIITA et de DRA (Figures 4.3 et 4.5), est maintenant analysée pour l’expression des molécules HLA-DR, DP et DQ à la surface. Les contrôles négatifs et positifs sont les suivants: RJ2.2.5 transfectés avec le vecteur vide (PL), RJ2.2.5 transfecté avec les ADNc CIITA souris 4B (m4B, gris) et 4S (m4S, blanc), l’ADNc CIITA humain de type III (hIII, gris foncé)et Raji (noir).

DR DQ

Raji PL

m I

mIII

m IV

10⁴ 10³ 10² 10¹

10⁰ 10⁰ 10¹ 10² 10³10⁴ 10⁰ 10¹ 10² 10³ 10⁴

hIII m 4S m 4B

5. Etude de l’action de CIITA in vivo par transgénèse

CIITA, en tant que régulateur essentiel des gènes CMH-II, a été choisi pour une série d’études de transgénie visant un gain de fonction chez la souris. Selon le promoteur choisi, différents types cellulaires vont exprimer le transgène CIITA et induire l’expression des gènes CMH-II. Ce chapitre présente, pour cette expérience de transgénie utilisant l’ADNc CIITA, les questions posées, l’approche utilisée et les premiers résultats.

5.1. Introduction

L’approche de transgénie basée sur CIITA diffère de celle basée sur les gènes structuraux CMH-II ou sur des cytokines par les caractères suivants. En premier, la génération de souris transgéniques est simplifiée puisque un seul transgène CIITA permet d’exprimer tous les isotypes CMH-II ^[58;96]. Cette expression coordonnée des gènes CMH-II est une condition préalable pour un trafic normal des molécules CMH-II. En deuxième, le transgène CIITA agit en trans sur les gènes CMH-II endogènes ^[58]. Ainsi, il n’y a pas de différence entre l’haplotype des molécules CMH-II induites par le transgène et les molécules CMH-II normalement exprimées. En troisième, de multiples souris transgéniques pour l’IFN-γ ont été produites ^[145]. Ces souris activent la présentation d’antigènes par les CMH-II comme d’autres voies d’activation des lymphocytes ^[146;147]. Modifier l’action de CIITA par transgénie a des conséquences plus spécifiques. En bref, le gène CIITA représente vraiment une alternative en transgénie pour moduler l’action des molécules CMH-II.

Le rôle de CIITA dans l’activation des gènes CMH-II in vivo est naturellement un premier domaine à aborder. Les conséquences d’une déficience de CIITA ont été étudiées en détail in vivo chez l’homme et la souris [60;64;107;118]

; par contre, celles d’une activation de CIITA ont été essentiellement étudiées in vitro . Il existe une expérience, récemment publiée, utilisant CIITA sous le contrôle d’un promoteur CMH-I en transgénie ^[122]. Une approche en transgénie chez la souris permet à l’évidence de réexaminer l’action de CIITA sur les gènes CMH-II dans la complexité d’un organisme entier. Afin de mieux comprendre le mode d’action de CIITA, l’existence de cellules en partie ou totalement résistantes à l’action de CIITA est à rechercher.

La capacité de CIITA d’induire la présentation d’antigène dépendant des CMH-II demeure une inconnue ^[146]. Chez l’homme, in vitro, les cellules positives en HLA classe II par CIITA sont capables de présenter des peptides, des superantigènes mais pas des protéines ^[146;148]. D’après ces expériences, le « processing » d’antigène ne semble pas

sous le contrôle de CIITA. Une évaluation de cette fonction de CIITA, éventuellement absente aussi chez la souris, est d’importance pour de futures études avec les souris CIITA transgéniques. Ce point n’est pas évident à déterminer expérimentalement : la nécessité de plusieurs facteurs dans la présentation d’antigène est variable selon l’haplotype CMH ou l’antigène étudié ^[149;150]. Cette présentation d’antigène peut être étudiée dans les souris transgéniques CIITA en variant les « backcross » et les antigènes utilisés in vivo.

La nécessité de la régulation de l’expression des gènes CMH-II et le rôle des molécules CMH-II dans le système immunitaire peuvent être réexaminés par des expériences de transgénie avec CIITA. La dérégulation de l’expression de CIITA devrrait augmenter l’expression des molécules CMH-II dans des cellules déjà positives et devrait induire cette expression dans de nouveaux territoires. Suite à cette expression augmentée des molécules CMH-II, le système immunitaire pourrait être altéré de plusieurs manières.

En premier, les lymphocytes CD4 + pourraient voir leur développement, leur activité et leur homéostasie modifiés ^[122]. Un changement dans la capacité des CD4+ à fournir une fonction d’aide montrerait l’importance de l’expression régulée des gènes CMH-II. La fonction des cellules APC pourrait aussi être altérée. Ainsi, la surexpression des molécules CMH-II pourrait modifier l‘intensité du signal peptide-CMH ^[151]. Finalement, le développement de différentes cellules hématopoïétiques pourrait être modifié par la dérégulation de ce probable coactivateur. En particulier, la maturation des lymphocytes B pourrait être anormale comme dans plusieurs souris mutantes pour les gènes CMH-II structurels ^[21;22].

Plusieurs types de promoteurs ont été envisagés pour aborder ces différentes questions. Trois modes d’expression de CIITA transgéniques ont été entrepris. Tout d’abord, une expression large et idéalement ubiquitaire a été d’abord choisie comme première approche. Ensuite, une expression spécifiquement dérégulée dans certains organes a été recherchée comme celle dans le pancréas avec le promoteur insuline ^[145]. Finalement, une expression inductible a aussi été tentée avec le promoteur inductible à la tetracycline ^[136]. Uniquement la première approche, suffisamment avancée, est présentée dans la suite de ce chapitre.

5.2. Approche et mise au point

Comme première étape dans la génération de souris transgéniques, l’efficacité de l’ADNc de CIITA souris a été comparée avec la forme humaine dans des cellules souris.

Dans ce but, l’ADNc CIITA souris 4S codant pour la forme protéique de type IV, déjà utilisé avec succès, a été comparé avec l’ADNc CIITA humain de type III, celui isolé à l’origine (Figure 5.1). La lignée fibroblastique souris LMTK- a été transfectée avec ces deux ADNc en parallèle. Après sélection antibiotique et clonage, l’expression en molécules CMH-II souris, I-E et I-A, a été étudiée par FACS. Dans les deux cas, une expression élevée des gènes CMH-II est obtenue. On observe à nouveau la conservation de la fonction de CIITA entre la souris et l’homme. L’ADNc CIITA 4S a été choisi comme séquence codante de CIITA dans le transgène CIITA pour deux raisons : il est efficace pour induire I-E et I-A et étant d’origine souris il peut être utilisé dans un système inductible sans représenter une source d’antigène exogène.

I-A I-E

10⁴ 10³ 10² 10¹

10⁰ 10⁰ 10¹ 10² 10³ 10⁴

LMTK -/+ mCIITA 4S

LMTK -/+ hCIITA III

Figure 5.1. Comparaison de l’induction des molécules CMH-II souris I-E et I-A par CIITA humain et souris. Les cellules LMTK- ont été transfectées de manière stable avec les constructions linéarisées EBO contenant l’ADNc de CIITA humain de type III et le clone CIITA souris 4S codant pour la protéine de type IV. Ces transfectants ont été analysés pour leur expression de I-E et I-A par FACS. Comme contrôle négatif, des cellules LMTK- non transfectées ont été marquées en parallèle (gris).

Comme étape intermédiaire dans la construction de transgènes CIITA souris, une construction générique TG1 a été établie afin d’y insérer plusieurs types de promoteurs (Figure 5.2). Voici donc les éléments essentiels de cette construction basée sur le plasmide Bluescript :

1) L’ADNc CIITA souris 4S est dérivé du clone 4B à la suite de délétions dans les parties 5’ et 3’ non traduites. La délétion en 5’ laisse un fragment de 125 pb en amont de l’ATG iniateur IV. Cette délétion augmente l’expression de CIITA au niveau protéique (voir partie 3.3). La délétion en 3’ (position 3784) permet de différencier les ARNm CIITA transgéniques des ARNm endogènes par RNAse protection.

2) La partie codante de CIITA 4S contient un site unique StuI qui permet de changer l’extrémité 5’ et donc de changer le premier ATG si désiré.

3) L’intron 10 de 1,2 kb dérivé du gène CIITA souris ^[124] a été inséré dans la position originale 1288-1289, afin d’augmenter l’expression en transgénie ^[152;153].

4) Le signal de polyadénylation issu du early large T antigene SV40 a été placé en 3’ de l’ADNc CIITA 4S. Cette extrémité 3’ contient un petit intron de 86 pb qui peut être mis à profit pour distinguer l’ARNm du DNA transgénique en RT-PCR.

5) Plusieurs sites de restriction uniques sont utilisables en 5’ pour insérer un promoteur.

Pour isoler l’insert du vecteur plusieurs sites sont utilisables en 5’ et 3’.

6) Le fragment SV40 contenant le signal de polyA est utilisé pour le criblage des souris transgéniques. Deux méthodes peuvent être choisies : une amplification PCR au travers des segments CIITA et SV40 ou une hybridation par slot-blot avec une sonde SV40.

Afin d’exprimer CIITA de manière ubiquitaire, les promoteurs CMV et SRα ont été essayés en parallèle sur la base de la littérature préexistante. Le promoteur viral CMV a été utilisé avec succès en transgénie ^[154]. Le territoire d’expression, révélé grâce à l’emploi de gène rapporteur, englobe de nombreux organes en particulier le cerveau.

L’efficacité du fort promoteur SRα, utilisé avec succès en transfection dans de multiples études, avait été étudié en transgénie dans une seule publication au moment de la mise au point ^[155]. Cette étude était encourageante vu les résultats obtenus en transfectant CIITA in vitro (voir partie 3.2.1). Dans le but d’augmenter l’expression de l’ARNm transgénique, des séquences barrières (locus control region, LCR) ont été adjointes à la cassette d’expression transgénique ^[156]. Seul le locus métallothionine a été utilisé avec succès en transgénie avec plusieurs promoteurs hétérologues et pouvait donc être testé avec un promoteur ubiquitaire ^[157]. La construction mCIITA-TG avec le promoteur SRα a été inséré dans le locus métallothionine. Ce locus, cloné dans Bluescript, a été remanié en enlevant les promoteurs et les parties codantes des deux gènes métallothionine mais en gardant les régions hypersensibles à la DNAse responsables de l’effet LCR ^[157]. Les deux

constructions résultantes ont été désignées ainsi: CMV-mCIITA (CC) et Métallothionine-SRα-mCIITA (MC).

1 kb

mCIITA TG

RIP CMV tet-op

MT5’ _SRα mCIITA TG MT3’

poly-A cDNA 4S + intron

MCS

Pvu I T7 promoter Sac II Not I Xba I Spe I

EcoR I Pvu I Cla I * Sal I T3 promoter

Stu I

Figure 5.2. Représentation schématique des transgènes codant pour CIITA souris. (A) Le vecteur mCIITA-TG permet d’insérer un promoteur à choix grâce au polylinker de Bluescript (MCS) et de changer l’extrémité 5’ de CIITA en clonage dirigé (StuI). La partie codante inclut l’ADNc mCIITA 4B et un intron CIITA. L’extrémité 3’

non traduite, dérivé du SV40 early, possède un intron. Le criblage des souris se fait par deux méthodes : slot-blot avec le fragment SV40 early ou PCR avec un primer mCIITA et un SV40 early. Cla I est dam méthylé (*). (B) Les promoteur insuline (Rat Insuline Promoter= RIP), viral CMV précoce (CMV) et l’inductible (tet-op) ont été directement insérés dans le vecteur mCIITA-TG. Le promoteur viral composite SRα a été utilisé en conjonction avec le locus métallothionine (MT5’et MT3’). Le locus MT contient des régions hypersensibles à la DNAse (triangles).

5.3. Etablissement de lignées transgéniques CIITA sous le contrôle d’un promoteur ubiquitaire

Ces constructions transgéniques CIITA ont été injectées dans des ovocytes F1 CBAXB6, de manière standard. La taille de la construction MC (Methalothinie-SRα-mCIITA) de 24,1 kb n’a pas posé de problème lors de ces injections. Pour la construction CC, 3 souris fondatrices ont été obtenues sur 38 FO. Pour la construction MC, 11 souris fondatrices sur 63 FO ont été obtenues. La présence du transgène a été détectée avec certitude par une PCR duplex (gène endogène et transgène) et par hybridation sur slot-blot sur deux échantillons de queue pour chaque souris. Seulement 2 et 6 lignées ont pu être établies pour les deux constructions ; une proportion plus faible qu’attendue. Un backcross par croisement avec un partenaire consanguin a été mené dans la souche CBA/J et aussi de manière moins avancée dans la souche Balb/c. Une fois ces lignées établies, les deux transgènes ont été transmis à une fréquence mendélienne. Le passage du transgène MC dans une autre souche (Balb/c) s’est effectué sans problème de transmission. La durée de vie et l’état général des souris porteuses de l’un ou l’autre transgène ne semble aucunement affectée (longévité de plus d’une année, croissance normale). En conclusion, l’établissement de lignées transgéniques qui expriment CIITA de manière large, comme nous allons le voir plus bas, n’a pas donné lieu à un phénotype particulier tant pour la viabilité que la fertilité de ces souris.

5.4. In vivo, CIITA permet l’induction des molécules CMH de classe I et de classe II

Examiner l’expression du transgène est une étape cruciale dans toute étude en transgénie. Dans le cas de CIITA, la question a été approchée à deux niveaux : expression de l’ARN de CIITA transgénique et effet sur l’expression des gènes CMH endogènes. Les huit lignées transgéniques ont été étudiées par la préparation d’ARN à partir des organes suivants : cerveau, muscle, foie, rein, poumon, rate et dans certains cas estomac et cœur. Par RPA, l’expression de CIITA endogène et transgénique, et de TBP comme contrôle, a été analysée comme précédemment (voir partie 3). Les gènes cibles que sont I-Eα et I-Aα sont inclus dans cette série de RPA. L’expression des gènes CMH de classe I K et β2microglobuline a aussi été étudiée.

L’expression du transgène CIITA, clairement distinguée de celle du gène endogène, est présente dans chacune des huit lignées à des degrés variables (Figure 5.3).

Les deux souris des lignées CC50 et CC54 exprimant CIITA sous le contrôle du

promoteur CMV montrent un profil différent : celle de la lignée CC50 exprime le transgène uniquement dans le rein, tandis que celle de la lignée CC54 montre une expression large à l’exclusion de la rate. Les six lignées MC présentent un profil d’expression similaire. Tous les organes sont positifs pour l’expression du transgène MC selon l’ordre suivant : poumon, rein, rate > foie > muscle >cerveau.

MW Sp Li Ki lu Mu Br Li Ki Lu Mu Br Sp Br Li Ki Lu Mu Sp Br Li Ki Lu Mu Sp Br Li Ki Lu Mu Sp St Br Ki Mu Sp He St Br Li Ki Lu Mu Sp He StBrBalb/c CC54 tg+

MC25 tg- CC54 tg-

tg-CC50 tg+

MC52 tg+

MC42 tg+

MC25 tg+ MC varia tg+

CIITA endo

I-E α

CIITA tg

TBP

I-A α 367

242

190

147

118

Figure 5.3. Expression de CIITA et des gènes CMH-II dans les lignées MT-SRα-mCIITA et CMV-mCIITA. A partir de chacune des huit lignées transgéniques, une souris positive pour le transgène a été analysée ; en plus deux souris négatives de même portée ont été utilisées comme contrôles négatifs. Seules cinq des huit lignées sont représentées. L’ARN total a été préparé depuis le cerveau (Br), foie (Li), rein (Ki),poumons (Lu), muscle (Mu), rate (Sp), cœur (He), estomac (St). Entre 10 et 25 µg ont été utilisés pour chaque réaction de RPA. L’expression des gènes suivants a été examinée : CIITA endogène, CIITA transgénique, I-Eα, I-Aα et mTBP.

L’expression de CIITA transgénique et endogène a été quantifiée (Figures 5.4 et 5.5). La même méthode a été utilisée ici que dans les parties précédentes de ce travail. La construction transgénique MT-SRα-mCIITA est nettement plus exprimée que la construction CMV-mCIITA dans la plupart des organes. Le profil similaire d’expression du transgène MC dans les différentes lignées de souris est confirmé par la quantification.

Ainsi les poumons, les reins et la rate sont un territoire où le transgène MC est bien exprimé. Ces résultats permettent de classer les souris MC selon un niveau d’expression global pour la souris entière. On peut ainsi les regrouper entre trois collectifs : celles qui expriment le plus haut niveau MC29 (A), MC41 (B), MC42 (C), un niveau intermédiaire MC52 (D) et un niveau plus faible MC25 (E), MC30 (F). Globalement, ces analyses montrent que le promoteur SRα associé au locus MT est efficace pour exprimer CIITA en transgénie.

Le niveau de l’ARNm du gène I-Eα a aussi été quantifié. Une claire induction de I-Eα est observée dans le foie, les reins et aussi les poumons (Figure 5.4). Trois cas de figure apparaissent selon l’état d’expression de CIITA. Première situation : lorsque CIITA est peu exprimé (ni le transgène ni le gène endogène ne sont fortement exprimés), l’expression de I-Eα reste faible. Le cerveau présente ce profil. Deuxième situation :

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