Détermination des sites d’initiations de transcription du gène CIITA murin

L’isolation des formes ADNc CIITA murines a été présentée dans les pages précédentes. Ce présent chapitre propose au lecteur de revenir sur les expériences de RACE-PCR. Dans ce travail, cette technique a été utilisée, de manière classique, pour obtenir les séquences complètes des multiples ADNc de CIITA ^[129]. D’une façon plus originale, il a été possible en plus de déterminer avec précision les sites d’initiation de transcription.

La technique de RACE-PCR permet d’isoler par RT-PCR les extrémités 5’ et 3’, des molécules d’ARN (Figure 2.5, partie A). Le caractère singulier de cette méthode est l’utilisation d’une seule amorce spécifique (l’autre est complémentaire au tailing). Ce point est à relever, car il a permis d’isoler deux extrémités supplémentaires inattendues, en plus de l’extrémité isolée à partir d’une banque. Les trois types d’extrémité ont été en premier analysés par le séquençage de clones individuels qui sont représentés dans le bas des parties B, C et D de la figure 2.5. Ainsi, pour l’extrémité de forme I, les clones ADNc de RACE-PCR débutent entre les positions +14 et +111 par rapport au site d’initiation chez l’homme (voir bas de la partie B). Certains clones ne possèdent même pas le premier AUG de l’exon 1 forme I. Pour la forme III, une telle dispersion est aussi observée dans les divers clones qui débutent de la position -48 à celle à +69 (voir bas de la partie C). Pour la forme IV isolée à partie d’une lignée cellulaire induite à l’IFN-γ, trois types d’extrémités ont été isolés. Le premier groupe de clones est originaire du promoteur IV, le deuxième groupe comprend un seul clone issu du promoteur III et le troisième comprend trois clones d’origine artefactuelle (amplification chimérique d’ADNc). Par ailleurs, on relèvera qu’un codon stop précède à chaque fois le premier AUG d’initiation trouvé de chaque type de transcript. En bref, les cadres de lecture déterminés dans les trois types d’extrémités sont véritablement complets.

Malgré le séquençage de multiples clones issus de deux RACE-PCR indépendantes, les sites précis d’initiation de transcription n’ont pas été étudiés de manière correcte. Déterminer de pareils sites se fait usuellement par « primer extension » ou par des réactions de RNAse protection ou de Nucléase S1 ^[130]. Dans le cas précis de CIITA, une approche plus légère, à savoir le séquençage des clones RACE-PCR en groupe, fut choisie. Dans cette approche, trois points sont essentiels : 1) pour éviter l’arrêt brutal de la réaction de séquençage à la fin de l’amorce, sous-cloner les fragments amplifiés 2) afin de générer une réaction de séquençage identique au début pour tous les

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clones, utiliser une amorce spécifique à l’ADNc étudié 3) afin de déterminer le site d’initiation, détecter la disparition ou l’affaiblissement du signal spécifique de la séquence ou l’apparition du polyT en comparaison avec un des clones RACE-PCR séquencé en parallèle.

A

5’ 3’

AUG

RT + tailing

PCR

cloning into plasmid sequencing pool and clones

TAC 5’

AAAAAAA 3’

TAC AAAAAAAAAAAAAA

TAC AAAAAAAAAA

TTT

ATG

TTTTTTTTTTT5’ 3’

AAAAAAAAAA TAC

3’ 5’

B

CATCCTGGGT CTCACTTCAT GTTTTGGATG CTGCAAGGCT GGATGAGAGG CGACTCCAGG CAGCAGGCAG CCTCAGAGCA CTGCCATG

T G C A

POOL

30X

CLONE

3B2

CATCCTGGGT CTCACTTCAT GTTTTGGATG CTGCAAGGCT GGATGAGAGG CGACTCCAGG CAGCAGGCAG CCTCAGAGCA CTGCCATG

3B2 3A4

4B 3A2 + 3B1

T G C A

+1

AA CCACTTCCAG GCCATCCTGG CCC +1

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C

T G C A POOL

21X

CLONE 15.3

T G C A

TTCTGGGCTCCTAACTGATAGACAGAGGCATGTGAGGGATGAGGCTGCCTGCTTCCCACCTGGGCATCTGAGGACCTTTTTGGAGAC +1

13.2

GCATCTGAGGACCTTTTTGGAGACTTCCGGCACGCCAGGAGGGGCAGCTGGACTACAGACGTTACTGCATCACTCTGCTCTCTAAATCATG 15.3

TTCTTTGCATGCTAGCTGAGCTTGGTAGGTTCTGGGCTCCTAACTGATAGACAGAGGCATGTGAGGGATGAGGCTGCCTGCTTCCCACCTGG

15.2 +115.113.4 13.1

13.2

D

T G C A T G C A T G C A POOL

14X

CLONE 19.2 POOL

13X

17.2

+1 19.2 17.4

19.12

AAAGTGAAAGGGGGAAAAGCGCCACAGATACTCCCTATTTGTGAGATAGCTGCCAGGAGACTGCCCGCCCCAAGCTCCTAGGAGCCACGG +1

AAAGTGAAAGGGGGAAAAGCGCCACAGATACTCCCTATTTGTGAGATAGCTGCCAGGAGACTGCCCGCCCCAAGCTCCTAGGAGCCACGG

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Figure 2.5. Analyse par RACE-PCR et séquençage des extrémités 5’

des transcripts CIITA murin.

A) Schéma de l’analyse par RACE-PCR. L’ARN total a été isolé à partir de rate de souris Balb/c ou de cellules MT2 induites à l’IFN-γ.

Une amorce spécifique pour CIITA a été utilisée pour la réaction RT.

L’amplification a été effectuée en deux fois (nested PCR). Afin de retrouver l’extrémité de type I qui est plus longue, la dernière amplification a été effectuée avec une amorce située dans l’exon1 type I. Ces amplifiats ont été sous-clonés dans BS puis séquencés en groupe ou individuellement.

B, C, D) Comparaison des réactions de séquençage pour les extrémités de type I, III, IV à partir d’un clone individuel ou de clones en groupe.

En haut des autoradiographies est indiquée la séquence obtenue depuis un clone génomique. Des flèches indiquent les principaux sites d’initiation de transcription déterminés par séquençage en groupe. Les positions +1 (cadre) correspondent au site d’initiation principal chez l’homme. En bas des films, sont indiqués en comparaison les clones individuels obtenus.

Par cette approche de séquençage en groupe des clones, les sites d’initiation de transcription principaux dans le promoteur I ont été cartographiés aux positions +17, +75 et +239. Pour le promoteur III, les principaux sites détectés se situent entre les positions – 18 et +12 et pour le promoteur IV entre –47 et +8 (voir haut des parties B, C et D). Dans ces trois cas, les sites d’initiations ont été redéfinis. Pour le promoteur I, les sites à +75 et +239 n’avaient pas été trouvés dans des clones individuels. Pour le promoteur III, la

“fenêtre”, dans laquelle la transcription a probablement lieu, a été réduite. Pour le promoteur IV, deux sites d’initiation supplémentaires en positions -47 et –16 ont été détectés. De plus, seule la séquence correspondante aux clones issus du promoteur IV est visible. En conclusion, chacun des messagers CIITA souris de type I, III, et IV est initié à de multiples sites de transcription, comme le montre l’analyse en pool des clones RACE-PCR. Comme chez l’homme ^[128], cette multiplicité indique l’existence et l’activité de plusieurs promoteurs CIITA.