Résultats supplémentaires : Modulation fine, in vitro, de l’expression

3. ACTION QUANTITATIVE DE CIITA SUR LES GENES CMH-II

3.3. Résultats supplémentaires : Modulation fine, in vitro, de l’expression

des CMH-II par CIITA

Le système de régulation transcriptionnelle à la tetracycline a permis de montrer une relation causale entre le niveau d’expression de CIITA et celui des molécules CMH-II. Mais ce système a un défaut qui réside dans une réponse brutale aux variations de doxycycline ^[136;142]. Dans ce contexte, l’observation d’une augmentation brusque de l’expression des molécules CMH-II à la surface cellulaire est peu surprenante (Figure 1 de l’article). A cause de ces résultats, il m’a paru nécessaire de confirmer cette relation causale et quantitative entre l’expression de CIITA et celui des molécules CMH-II. Dans ce but, nous avons choisi un autre système d’expression permettant d’exprimer CIITA à des taux intermédiaires et faiblement différents. L’utilisation d’une lignée lymphocytaire B dans ces expériences permet aussi de valider le contrôle quantitatif des gènes CMH-II par CIITA dans un autre type cellulaire que des cellules épithéliales comme HeLa.

RJ2.2.5, une lignée de lymphocytes B mutée pour CIITA, a été transfectée avec CIITA grâce à un vecteur d’expression épisomal basé sur EBNA-1 ^[58]. Grâce à l’efficacité de la transfection suivie d’une sélection antibiotique pendant deux semaines, ce système permet d’étudier les transfectants sans clonage préalable. Deux ADNc de mCIITA 4B et 4S, qui possèdent uniquement le second ATG, ont été ainsi transfectés.

Seulement, la protéine CIITA souris forme IV est donc exprimée par ces deux ADNc.

L’ADNc 4S diffère du 4B par la délétion partielle des parties non traduites. Le niveau d’expression de CIITA IV dans les transfectants mCIITA 4S et 4B a été quantifié par une densitométrie d’un Western sur des échantillons chargés en quantité croissante. RFX5 a été utilisé comme contrôle interne. Dans le transfectant 4S, on constate un doublement d’expression de CIITA par rapport au transfectant 4B (Figure 3.4 parties A et C). Cette augmentation est probablement due à une traduction plus efficace dans un contexte d’un 5’ non traduit d’une longueur usuelle de 125 pb ^[143]. Les deux constructions induisent un différent niveau d’expression de CMH-II à la surface cellulaire: Dans les transfectants 4S, HLA-DR, DP et DQ sont environ deux fois plus élevés que dans les transfectants 4B (Figure 3.4 parties B et C). Des résultats identiques en FACS comme en Western ont été obtenus dans plusieurs autres transfections. Ces analyses montrent que de faibles variations de niveau de CIITA permettent de moduler finement le niveau d’expression des gènes CMH-II.

Figures 3.4. Analyse de l’expression de CIITA et de HLA-DR, DP et DQ dans les transfectants EBO-mCIITA 4S et 4B de la lignée RJ2.2.5.

A. A partir des transfectants 4S et 4B codant tous deux pour mCIITA forme IV, des extraits protéiques totaux ont été analysés par Western blot avec deux serums polyclonaux: un hCIITA IV et un anti-RFX5. B. L’analyse par FACS pour l’expression de HLA-DR, DP et DQ a été effectuée pour les transfectants vecteur vide EBO-PL (traitillé), EBO-mCIITA 4B (gris), EBO-mCIITA 4S (blanc) et la lignée lymphocytaire B parentale Raji (noir).

4. Activité des différentes formes protéiques de CIITA

A la fois chez l’homme et la souris, il existe trois types de messagers CIITA souris qui se distinguent par leur premier exons différent et des cadres de lecture ouverts différents (voir article partie 2.3). Un cadre de lecture, qui est présent dans les trois types de messagers, commence avec un AUG commun situé dans l’exon 2. Les messagers de

type I et III possèdent un AUG additionnel en amont (AUG I, AUG III) qui peut coder pour 101 et 24 acides aminés en supplément. Les messagers de type IV se contentent de l’AUG commun (AUG IV). L’importance des AUG I et III est restée longtemps peu claire, car la transfection d’un ADNc CIITA tronqué contenant seulement l’AUG IV est suffisante pour complémenter des lignées déficientes en CIITA. De plus, les AUG I ou AUG III sont favorablement situés en amont de l’AUG commun (AUG IV), mais ils ne sont pas entourés par un consensus Kozak aussi bon que l’AUG IV (Figure 4.1). Une étude a été menée afin de déterminer l’utilisation respective des divers AUG et l’activité de ces diverses formes protéiques prédite.

Kozak consensus mouse ATG form I mouse ATG form III mouse ATG form IV

(GCC)GCC CCATGGA G

agc actgccATGa ctc taaatcATGc tgt gccaccATGg

Figure 4.1. Contexte des différents ATG d’initation CIITA souris. Le consensus Kozak ^[143] est montré avec le codon d’initiation (gras), la position essentielle en –3 (gras) et la conservation moindre en –7 à -9.

Les séquences ADNc de CIITA souris montrent les positions conservées (souligné).

4.1. Expression de multiples formes protéiques de CIITA

L’étude de l’utilisation des AUG des messagers de CIITA a été entreprise à la fois chez l’homme et la souris. Grâce à un anticorps contre la partie N-terminale de la forme protéique CIITA III, il a été montré que la lignée humaine lymphocytaire B Raji utilise l’AUG III ^[144]. Par une approche de transfection de l’ADNc CIITA humain de type I, il fut déduit que l’AUG I est utilisé ^[144]. Chez la souris, une approche utilisant uniquement des ADNc transfectés fut choisie dans le travail présenté ci-dessous.

Les ADNc des 3 formes ont d’abord été reconstitués avec des extrémités 5’ non traduites respectives complètes (Figure 2.5) et ont été placés dans le vecteur d’expression. Le système d’expression de CIITA dans la lignée RJ2.2.5 avec le plasmide épisomal fut choisi à nouveau pour son efficacité. Après la transfection suivie de la sélection antibiotique, les cellules transfectées avec l’ADNc CIITA souris de type I, III, IV ont été analysées par FACS pour l’expression à la surface des molécules CMH-II.

L’analyse de ces cellules s’est poursuivie avec la préparation en parallèle d’ARN

cytoplasmique et d’extraits protéiques totaux. L’expression de CIITA dans ces divers transfectants a été visualisée par Western blot avec un anticorps polyclonal dirigé contre CIITA humain de type IV.

RJ2.2.5

PL mI mIII

mIV

4B 4S hIII Raji mCIITA I

mCIITA III mCIITA IV

hCIITA III hCIITA IV

Figure 4.2. Utilisation des AUG dans les diverses formes de transcripts CIITA souris. La lignée lymphocytaire B RJ2.2.5 déficiente en CIITA a été transfectée avec des vecteurs épisomaux contenant les ADNc CIITA souris de type I, III, IV (mI, mIII, mIV). Comme contrôles sont inclus les lignées non transfectées RJ2.2.5, Raji la lignée parentale, le vecteur vide transfecté (PL), l’ADNc CIITA souris codant la protéine de type IV avec chacun une extrémité 5’non traduite mutée longue et courte (4B et 4S) et l’ADNc humain de type III (hIII). Les extraits protéiques totaux ont été préparés après deux semaines de sélection. 50 µg ont été chargés sur un gel SDS-PAGE 5%, puis analysés par Western blot avec un anticorps polyclonal contre CIITA humain de type IV. La partie gauche en blanc concerne les échantillons exprimant CIITA souris, à droite en gris se trouvent ceux qui expriment la protéine humaine.

L’expression de protéine CIITA souris dans les transfectants CIITA de type IV, c’est-à-dire l’ADNc IV et les mutants 4B et 4S, passe par l’AUG d’initiation situé dans l’exon 2. La taille de CIITA observée de 126 kD correspond à celle attendue (Figure 4.2).

Dans les transfectants CIITA souris I et III, on détecte des bandes de plus haut poids moléculaire à 141 et 129, qui sont proches des tailles attendues pour des protéines CIITA traduites à partir des AUG I et AUG III. Il faut noter que depuis l’ADNc de type III à la fois chez l’ADNc souris et humain, on détecte une forme de CIITA correspondant au type IV. Il semble donc que dans le cas de transfectants CIITA III, l’AUG IV est aussi utilisé. CIITA est détecté dans la lignée Raji sous forme de trois bandes différentes dont deux semblent correspondre à des protéines traduites à partir de l’AUG III et de l’AUG IV. Une seconde série de transfections a été effectuée et a donné des résultats identiques.

En conclusion, ces données montrent que les AUG situés dans les exon 1 de type I et III

de CIITA souris peuvent être utilisés. Plusieurs formes de protéines CIITA sont donc probablement exprimées chez la souris à partir des ARNm de type I, III et IV.

Dans les 2 séries de transfections, le niveau détecté de protéine CIITA souris de type I et III est plus faible que celui des transfectants exprimant uniquement la protéine de type IV. Afin de contrôler l’efficacité de transfection, une analyse par RPA des 2 séries de transfectants et des contrôles a été menée. L’expression de l’ARNm de CIITA souris transfecté, de HLA-DRA et d’un gène contrôle hTBP a été mesurée. Le niveau d’ARN CIITA souris est similaire dans les différents transfectants. Après quantification, on constate que le niveau d’ARN varie au maximum de 60% entre les divers échantillons.

Ces résultats excluent une efficacité variable de transfection entre les différentes constructions. En conclusion, ces données suggèrent que les ARNm endogènes de CIITA de différentes formes ne conduisent pas au même niveau d’expression de protéine CIITA.

mCIITA*

DRA

TBP mCIITA

PL mI mIII

mIV

4B 4S hIII Raji

Figure 4.3. Expression des ARNm CIITA souris dans les transfectants CIITA de type I, III et IV. L’ARN cytoplasmique a été préparé à partir de Raji et des transfectants RJ2.2.5 déjà montrés dans la figure 4.2. Par RPA, 25 µg d’ARN ont été analysés pour l’expression en messager de CIITA souris, de HLA-DRA et de hTBP. Pour les échantillons exprimant CIITA souris (partie blanche), le fragment protégé de CIITA souris est soit de 202 pb (mCIITA*) pour les constructions tronquées dans l’extrémité 3’ non traduite, soit de 348 pb ce qui correspond à la taille protégée d’un messager sauvage (mCIITA). Les deux échantillons exprimant CIITA humain (partie grise) n’ont pas été testés pour l’expression de l’ARNm CIITA humain.

4.2. Comparaison de l’activité des formes protéiques CIITA

Afin d’évaluer directement l’activité des diverses formes protéiques de CIITA de type I, III et IV, deux types d’analyse ont été effectuées en parallèle. Ainsi, j’ai mesuré la quantité de l’effecteur, c’est-à-dire le niveau de protéine CIITA, et le résultat de l’action de CIITA, dans ce cas le niveau d’ARNm de HLA-DRA. Vu que les transfectants CIITA I et IV n’expriment que leur forme respective, une corrélation directe peut être établie (Figure 4.2). Pour les transfectants CIITA III qui expriment les formes protéiques III et IV, la mesure de CIITA a été effectuée sur les deux formes en même temps. A partir de deux séries de transfections indépendantes, les quantités de protéine CIITA ont été mesurées en prenant soin d’établir une courbe de titration par densitométrie et ImageQuant. La quantité d’ARNm DRA a été mesurée au PhosphorImager suivi d’ImageQuant (Figure 4.3). Ces deux types de mesures ont été corrélés dans un graphique (Figure 4.4).

La protéine CIITA de type IV est exprimée à des taux différents selon l’extrémité 5’ non traduite incorporée dans la construction transfectée. Il existe une corrélation positive entre le niveau d’expression de CIITA IV et le niveau d’expression de HLA-DRA. A partir de ces trois points, une droite de régression a été établie pour estimer l’activité de cette forme. Un niveau comparable d’ARNm HLA-DRA est retrouvé dans les transfectants CIITA I, III et IV. Il faut noter que ce niveau d’expression de DRA est obtenu avec des quantités de protéine CIITA de type I et d’un mélange III et IV qui sont significativement plus faibles (4 et 2 fois moins environ) que le niveau d’expression de la protéine CIITA IV. Ces résultats suggèrent que la protéine CIITA IV aux niveaux atteints dans ce système est limitante pour l’expression de DRA. De plus, ils suggèrent aussi que les protéines CIITA de type I et III sont plus actives que la forme CIITA IV de plusieurs fois.

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

CIITA protein

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

DRA mRNA

m4S

mIV m4B

mIII mI

Figure 4.4. Efficacité relative des formes CIITA I, III, et IV. Les résultats proviennent de deux séries de transfections dans RJ2.2.5 (une des 2 a été présentées dans les figures 4.2 et 4.5). Les niveaux des protéines CIITA détectés en Western ont été quantifiés par densitométrie avec le programme ImageQuant. Le niveau d’expression du gène CMH-II HLA-DRA détecté par RPA a été quantifié dans ces divers transfectants par RPA de manière usuelle. Une droite de régression avec la déviation standard est montrée pour l’action de CIITA de type IV sur l’expression de DRA. Pour standardiser les expériences, l’unité de mesure arbitraire utilisée est la valeur de l’échantillon divisée par celle du transfectant 4S de la même expérience.

L’expression des molécules CMH-II à la surface de ces transfectants a été étudiée (Figure 4.5). Les trois types de transfectants qui n’expriment que la protéine CIITA de type IV montrent le niveau attendu de molécules HLA-DR, DP et DQ. Ainsi, les transfectants m4B, mIV et m4S qui expriment une quantité croissante de protéine CIITA IV et d’ARNm DRA induisent un niveau croissant de molécules CMH-II à la surface (voir en particulier DQ). Ces résultats ont été obtenus de manière reproductible dans trois séries indépendantes de transfection. Les niveaux d’expression de DR, DP et DQ des transfectants mCIITA I, III et IV ont été comparés. Une mesure de la fluorescence moyenne (MFI transfectant / MFI Raji) a permis de comparer trois séries de transfection.

Malgré quelques variations expérimentales (Figure 4.5), aucune différence n’a pu être objectivée entre les niveaux d’expression en HLA-DR, DP et DQ à la surface des transfectants mCIITA I, III et IV (données non montrées). En conclusion, ces résultats montrent une parfaite corrélation entre l’expression des gènes CMH-II au niveau de l’ARN et des molécules à la surface. De manière intéressante, ces résultats montrent à

nouveau que la régulation quantitative de CIITA sur le niveau d’expression des gènes CMH-II est une modulation fine et graduelle.

Figure 4.5. Analyse de l’expression de HLA-DR, DP et DQ dans les

transfectants CIITA murin de type I, III et IV. La série de transfectants générés dans la lignée RJ2.2.5 avec les contrôles, déjà analysée pour l’expression de CIITA et de DRA (Figures 4.3 et 4.5), est maintenant analysée pour l’expression des molécules HLA-DR, DP et DQ à la surface. Les contrôles négatifs et positifs sont les suivants: RJ2.2.5 transfectés avec le vecteur vide (PL), RJ2.2.5 transfecté avec les ADNc CIITA souris 4B (m4B, gris) et 4S (m4S, blanc), l’ADNc CIITA humain de type III (hIII, gris foncé)et Raji (noir).

DR DQ

Raji PL

m I

mIII

m IV

10⁴ 10³ 10² 10¹

10⁰ 10⁰ 10¹ 10² 10³10⁴ 10⁰ 10¹ 10² 10³ 10⁴

hIII m 4S m 4B

5. Etude de l’action de CIITA in vivo par transgénèse

CIITA, en tant que régulateur essentiel des gènes CMH-II, a été choisi pour une série d’études de transgénie visant un gain de fonction chez la souris. Selon le promoteur choisi, différents types cellulaires vont exprimer le transgène CIITA et induire l’expression des gènes CMH-II. Ce chapitre présente, pour cette expérience de transgénie utilisant l’ADNc CIITA, les questions posées, l’approche utilisée et les premiers résultats.

5.1. Introduction

L’approche de transgénie basée sur CIITA diffère de celle basée sur les gènes structuraux CMH-II ou sur des cytokines par les caractères suivants. En premier, la génération de souris transgéniques est simplifiée puisque un seul transgène CIITA permet d’exprimer tous les isotypes CMH-II ^[58;96]. Cette expression coordonnée des gènes CMH-II est une condition préalable pour un trafic normal des molécules CMH-II. En deuxième, le transgène CIITA agit en trans sur les gènes CMH-II endogènes ^[58]. Ainsi, il n’y a pas de différence entre l’haplotype des molécules CMH-II induites par le transgène et les molécules CMH-II normalement exprimées. En troisième, de multiples souris transgéniques pour l’IFN-γ ont été produites ^[145]. Ces souris activent la présentation d’antigènes par les CMH-II comme d’autres voies d’activation des lymphocytes ^[146;147]. Modifier l’action de CIITA par transgénie a des conséquences plus spécifiques. En bref, le gène CIITA représente vraiment une alternative en transgénie pour moduler l’action des molécules CMH-II.

Le rôle de CIITA dans l’activation des gènes CMH-II in vivo est naturellement un premier domaine à aborder. Les conséquences d’une déficience de CIITA ont été étudiées en détail in vivo chez l’homme et la souris [60;64;107;118]

; par contre, celles d’une activation de CIITA ont été essentiellement étudiées in vitro . Il existe une expérience, récemment publiée, utilisant CIITA sous le contrôle d’un promoteur CMH-I en transgénie ^[122]. Une approche en transgénie chez la souris permet à l’évidence de réexaminer l’action de CIITA sur les gènes CMH-II dans la complexité d’un organisme entier. Afin de mieux comprendre le mode d’action de CIITA, l’existence de cellules en partie ou totalement résistantes à l’action de CIITA est à rechercher.

La capacité de CIITA d’induire la présentation d’antigène dépendant des CMH-II demeure une inconnue ^[146]. Chez l’homme, in vitro, les cellules positives en HLA classe II par CIITA sont capables de présenter des peptides, des superantigènes mais pas des protéines ^[146;148]. D’après ces expériences, le « processing » d’antigène ne semble pas

sous le contrôle de CIITA. Une évaluation de cette fonction de CIITA, éventuellement absente aussi chez la souris, est d’importance pour de futures études avec les souris CIITA transgéniques. Ce point n’est pas évident à déterminer expérimentalement : la nécessité de plusieurs facteurs dans la présentation d’antigène est variable selon l’haplotype CMH ou l’antigène étudié ^[149;150]. Cette présentation d’antigène peut être étudiée dans les souris transgéniques CIITA en variant les « backcross » et les antigènes utilisés in vivo.

La nécessité de la régulation de l’expression des gènes CMH-II et le rôle des molécules CMH-II dans le système immunitaire peuvent être réexaminés par des expériences de transgénie avec CIITA. La dérégulation de l’expression de CIITA devrrait augmenter l’expression des molécules CMH-II dans des cellules déjà positives et devrait induire cette expression dans de nouveaux territoires. Suite à cette expression augmentée des molécules CMH-II, le système immunitaire pourrait être altéré de plusieurs manières.

En premier, les lymphocytes CD4 + pourraient voir leur développement, leur activité et leur homéostasie modifiés ^[122]. Un changement dans la capacité des CD4+ à fournir une fonction d’aide montrerait l’importance de l’expression régulée des gènes CMH-II. La fonction des cellules APC pourrait aussi être altérée. Ainsi, la surexpression des molécules CMH-II pourrait modifier l‘intensité du signal peptide-CMH ^[151]. Finalement, le développement de différentes cellules hématopoïétiques pourrait être modifié par la dérégulation de ce probable coactivateur. En particulier, la maturation des lymphocytes B pourrait être anormale comme dans plusieurs souris mutantes pour les gènes CMH-II structurels ^[21;22].

Plusieurs types de promoteurs ont été envisagés pour aborder ces différentes questions. Trois modes d’expression de CIITA transgéniques ont été entrepris. Tout d’abord, une expression large et idéalement ubiquitaire a été d’abord choisie comme première approche. Ensuite, une expression spécifiquement dérégulée dans certains organes a été recherchée comme celle dans le pancréas avec le promoteur insuline ^[145]. Finalement, une expression inductible a aussi été tentée avec le promoteur inductible à la tetracycline ^[136]. Uniquement la première approche, suffisamment avancée, est présentée dans la suite de ce chapitre.

5.2. Approche et mise au point

Comme première étape dans la génération de souris transgéniques, l’efficacité de l’ADNc de CIITA souris a été comparée avec la forme humaine dans des cellules souris.

Dans ce but, l’ADNc CIITA souris 4S codant pour la forme protéique de type IV, déjà utilisé avec succès, a été comparé avec l’ADNc CIITA humain de type III, celui isolé à l’origine (Figure 5.1). La lignée fibroblastique souris LMTK- a été transfectée avec ces deux ADNc en parallèle. Après sélection antibiotique et clonage, l’expression en molécules CMH-II souris, I-E et I-A, a été étudiée par FACS. Dans les deux cas, une expression élevée des gènes CMH-II est obtenue. On observe à nouveau la conservation de la fonction de CIITA entre la souris et l’homme. L’ADNc CIITA 4S a été choisi comme séquence codante de CIITA dans le transgène CIITA pour deux raisons : il est efficace pour induire I-E et I-A et étant d’origine souris il peut être utilisé dans un

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