Approche et mise au point

Comme première étape dans la génération de souris transgéniques, l’efficacité de l’ADNc de CIITA souris a été comparée avec la forme humaine dans des cellules souris.

Dans ce but, l’ADNc CIITA souris 4S codant pour la forme protéique de type IV, déjà utilisé avec succès, a été comparé avec l’ADNc CIITA humain de type III, celui isolé à l’origine (Figure 5.1). La lignée fibroblastique souris LMTK- a été transfectée avec ces deux ADNc en parallèle. Après sélection antibiotique et clonage, l’expression en molécules CMH-II souris, I-E et I-A, a été étudiée par FACS. Dans les deux cas, une expression élevée des gènes CMH-II est obtenue. On observe à nouveau la conservation de la fonction de CIITA entre la souris et l’homme. L’ADNc CIITA 4S a été choisi comme séquence codante de CIITA dans le transgène CIITA pour deux raisons : il est efficace pour induire I-E et I-A et étant d’origine souris il peut être utilisé dans un système inductible sans représenter une source d’antigène exogène.

I-A I-E

10 ⁴ 10 ³ 10 ² 10 ¹

10 ⁰ 10 ⁰ 10 ¹ 10 ² 10 ³ 10 ⁴

LMTK -/+ mCIITA 4S

LMTK -/+ hCIITA III

Figure 5.1. Comparaison de l’induction des molécules CMH-II souris I-E et I-A par CIITA humain et souris. Les cellules LMTK- ont été transfectées de manière stable avec les constructions linéarisées EBO contenant l’ADNc de CIITA humain de type III et le clone CIITA souris 4S codant pour la protéine de type IV. Ces transfectants ont été analysés pour leur expression de I-E et I-A par FACS. Comme contrôle négatif, des cellules LMTK- non transfectées ont été marquées en parallèle (gris).

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Comme étape intermédiaire dans la construction de transgènes CIITA souris, une construction générique TG1 a été établie afin d’y insérer plusieurs types de promoteurs (Figure 5.2). Voici donc les éléments essentiels de cette construction basée sur le plasmide Bluescript :

1) L’ADNc CIITA souris 4S est dérivé du clone 4B à la suite de délétions dans les parties 5’ et 3’ non traduites. La délétion en 5’ laisse un fragment de 125 pb en amont de l’ATG iniateur IV. Cette délétion augmente l’expression de CIITA au niveau protéique (voir partie 3.3). La délétion en 3’ (position 3784) permet de différencier les ARNm CIITA transgéniques des ARNm endogènes par RNAse protection.

2) La partie codante de CIITA 4S contient un site unique StuI qui permet de changer l’extrémité 5’ et donc de changer le premier ATG si désiré.

3) L’intron 10 de 1,2 kb dérivé du gène CIITA souris ^[124] a été inséré dans la position originale 1288-1289, afin d’augmenter l’expression en transgénie ^[152;153].

4) Le signal de polyadénylation issu du early large T antigene SV40 a été placé en 3’ de l’ADNc CIITA 4S. Cette extrémité 3’ contient un petit intron de 86 pb qui peut être mis à profit pour distinguer l’ARNm du DNA transgénique en RT-PCR.

5) Plusieurs sites de restriction uniques sont utilisables en 5’ pour insérer un promoteur.

Pour isoler l’insert du vecteur plusieurs sites sont utilisables en 5’ et 3’.

6) Le fragment SV40 contenant le signal de polyA est utilisé pour le criblage des souris transgéniques. Deux méthodes peuvent être choisies : une amplification PCR au travers des segments CIITA et SV40 ou une hybridation par slot-blot avec une sonde SV40.

Afin d’exprimer CIITA de manière ubiquitaire, les promoteurs CMV et SRα ont été essayés en parallèle sur la base de la littérature préexistante. Le promoteur viral CMV a été utilisé avec succès en transgénie ^[154]. Le territoire d’expression, révélé grâce à l’emploi de gène rapporteur, englobe de nombreux organes en particulier le cerveau.

L’efficacité du fort promoteur SRα, utilisé avec succès en transfection dans de multiples études, avait été étudié en transgénie dans une seule publication au moment de la mise au point ^[155]. Cette étude était encourageante vu les résultats obtenus en transfectant CIITA in vitro (voir partie 3.2.1). Dans le but d’augmenter l’expression de l’ARNm transgénique, des séquences barrières (locus control region, LCR) ont été adjointes à la cassette d’expression transgénique ^[156]. Seul le locus métallothionine a été utilisé avec succès en transgénie avec plusieurs promoteurs hétérologues et pouvait donc être testé avec un promoteur ubiquitaire ^[157]. La construction mCIITA-TG avec le promoteur SRα a été inséré dans le locus métallothionine. Ce locus, cloné dans Bluescript, a été remanié en enlevant les promoteurs et les parties codantes des deux gènes métallothionine mais en gardant les régions hypersensibles à la DNAse responsables de l’effet LCR ^[157]. Les deux

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constructions résultantes ont été désignées ainsi: CMV-mCIITA (CC) et Métallothionine-SRα-mCIITA (MC).

A.

1 kb

mCIITA TG

RIP CMV tet-op

MT5’ _SRα mCIITA TG MT3’

B.

poly-A cDNA 4S + intron

MCS

Pvu I T7 promoter Sac II Not I Xba I Spe I

EcoR I Pvu I Cla I * Sal I T3 promoter

Stu I

Figure 5.2. Représentation schématique des transgènes codant pour CIITA souris. (A) Le vecteur mCIITA-TG permet d’insérer un promoteur à choix grâce au polylinker de Bluescript (MCS) et de changer l’extrémité 5’ de CIITA en clonage dirigé (StuI). La partie codante inclut l’ADNc mCIITA 4B et un intron CIITA. L’extrémité 3’

non traduite, dérivé du SV40 early, possède un intron. Le criblage des souris se fait par deux méthodes : slot-blot avec le fragment SV40 early ou PCR avec un primer mCIITA et un SV40 early. Cla I est dam méthylé (*). (B) Les promoteur insuline (Rat Insuline Promoter= RIP), viral CMV précoce (CMV) et l’inductible (tet-op) ont été directement insérés dans le vecteur mCIITA-TG. Le promoteur viral composite SRα a été utilisé en conjonction avec le locus métallothionine (MT5’et MT3’). Le locus MT contient des régions hypersensibles à la DNAse (triangles).

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5.3. Etablissement de lignées transgéniques CIITA sous le contrôle d’un