Vérification des produits d’amplification PCR par séquençage

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Enfin, des amorces permettant l’amplification d’une séquence intronique du gène Protein

Disulfide Isomerase (PDI) chez le blé (Paolacci et al. 2009) ont été utilisées afin de vérifier

l’absence de contamination par de l’ADN génomique.

3.3. Vérification des produits d’amplification PCR par séquençage

Afin d’obtenir la séquence des différents gènes étudiés chez le blé (génotype SerixBabax 49)

et le petit épeautre (TM35821), des amorces gène-complet ont été dessinées sur la séquence

théorique de ces gènes, puis utilisées pour l’amplifier par PCR. L’amorce sens commençait

donc par l’ATG de la séquence et l’amorce anti-sens finissait par le codon stop. Les produits

d’amplification PCR ont été purifiés et clonés dans un plasmide utilisé pour transformer des

bactéries compétentes ; qui ont ensuite été mises à croître sur milieu sélectif puis repiquées en

culture liquide. Pour finir, l’ADN plasmidique en a été extrait et l’insert a été séquencé.

3.3.1. Purification des produits d’amplification

Les fragments d'ADN obtenus après amplification par PCR ont été séparés par électrophorèse

sur gel d’agarose et visualisés grâce à la fluorescence émise par le BET (bromure d’éthidium)

contenu dans le gel. La bande à la taille attendue a été purifiée par le kit Nucleospin extract II

(Macherey-Nagel) puis l’ADN a été élué dans 30 μl de tampon d’élution. La concentration

d’ADN plasmidique purifié a ensuite été mesurée en déposant 3 μl de l'échantillon sur gel

d'agarose grâce à une échelle de poids moléculaire quantitative (DNA ladder 1 kb, Euromedex).

3.3.2. Sous-clonage dans le plasmide pGEM-T Easy : TA cloning

Le plasmide pGEM-T Easy, commercialisé par la société Promega, est un vecteur linéarisé de

3015 pb, utilisé pour le clonage de produits PCR. Ce plasmide haute-copie présente une origine

de réplication dans un système bactérien, un gène de résistance à l’ampicilline (100μg/ml) et

un site de clonage multiple flanqué par les promoteurs de l’ARN polymérase SP6 et T7 (Figure

25). Ce site de clonage multiple est situé dans le gène LacZ, ce qui permet un crible blanc/bleu

des transformants. En effet, le gène LacZ code pour l’enzyme β-galactosidase capable de cliver

Figure 26 : Schéma global des clonages successifs de la séquence complète dans des

plasmides variés pour différentes utilisations. L’étude de la localisation subcellulaire et la

validation fonctionnelle de 4 gènes TaNAC ont nécessité un clonage par la technologie

Gateway.

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le substrat chromogène X-gal présent dans le milieu, ce qui produit une coloration bleue de la

colonie. L’inactivation de la β-galactosidase par clonage TA d’un produit PCR au milieu de ce

gène produit une coloration blanche de la colonie bactérienne transformée. Le clonage des

produits PCR purifiés dans ce plasmide a été réalisé par la T4 DNA ligase, à l’aide du kit

pGEM®-T Vector System II (Promega), selon les recommandations du fournisseur. La Figure

26 récapitule les clonages réalisés dans les différents plasmides et leur objectif.

3.3.3. Transformation de la souche bactérienne E. coli DH5α compétente,

vérification de la présence de l’insert/Criblage des colonies

La souche bactérienne d’Escherichia coli utilisée pour les clonages est la souche DH5α

Chemically Competent (Invitrogen). Cette souche présente une efficacité de transformation

importante, amplifie fortement les plasmides et permet un criblage visuel des transformants par

ajout du substrat de la β-galactosidase (XGal), ainsi que de l’IPTG.

Cinq μl de produit de ligation ont été transférés dans 100 μL d’une suspension de bactéries

compétentes. Le mélange a été laissé 30 min sur glace, un choc thermique a ensuite été réalisé

30 sec à 42°C, puis le mélange a été mis à reposer 2 min dans la glace. Cinq cent μL de milieu

SOC (Super Optimal broth with Catabolite repression ; 2 g tryptone, 0,5 g

Bacto®-yeast extract, 1 ml NaCl 1M, 0,25 ml KCl 1M, 1 ml Mg2+ 2M filtré et stérilisé, 1 ml glucose

2M filtré et stérilisé, H2O qsp 100 ml, pH7) ont été ajoutés à la suspension, qui a ensuite été

placée 1h à 37°C sous agitation (250 rotations par minutes). Les bactéries transformées ont

ensuite été étalées sur boîte de Petri contenant du milieu Luria-Bertani (ou milieu LB ; 10g de

Bacto-tryptone, 5g de Bacto-yeast extract, 10g de NaCl, H2O Qsp 1L) supplémenté en

antibiotiques adaptés pour permettre la sélection des colonies transformées. Les boites ont été

placées une nuit dans l’obscurité à 37°C, puis les colonies présentant une coloration blanche

ont été repiquées dans 5 ml de milieu LB liquide supplémenté en antibiotique. Après une nuit

d’incubation à 37°C sous agitation, 10 μl de chaque culture bactérienne liquide a été centrifugé

30 sec à 14000 g. Le culot a été ensuite suspendu dans 10 μl d’eau et chauffé 5 min à 95°C afin

de lyser les bactéries. La présence de l’insert a été vérifiée par PCR sur ce lysat bactérien, avec

des amorces spécifiques à l’insert et selon les mêmes conditions que celles décrites en Matériel

& Méthode – Partie 3.2.3.

Figure 27 : Synthèse du protocole expérimental de la transformation de l’épiderme inférieur

de feuille de tabac pour l’étude de l’expression transitoire d’une protéine TaNAC couplée à

la protéine fluorescente YFP. Cette expérimentation permet d’identifier la localisation

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3.3.4. Extraction d’ADN plasmidique par lyse alcaline (mini prep)

L’ADN plasmidique a été extrait à partir de cultures bactériennes liquides par la méthode de

lyse alcaline (Sambrook et al. 2001), qui a pour avantage d’éliminer l’ADN du chromosome

bactérien (Protocole détaillé en Annexe III). Une fois extrait, l’ADN plasmidique a été dosé au

spectrophotomètre (Nanodrop®) et sur gel d’agarose 1% par évaluation visuelle de l’intensité

des bandes en comparaison avec une échelle quantitative (1 kb DNA Ladder).

3.3.5. Séquençage

La séquence exacte de l’insert a été obtenue par séquençage de type Sanger sur les ADN

plasmidiques extraits par lyse alcaline. Ce séquençage a été réalisé par l’entreprise Beckman

Coulter Genomics (Takeley, Royaume Uni), sur un minimum de 3 clones différents pour

chaque couple d’amorce.