Cinétique de développement du grain

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fluorescence microscope). Celui-ci est équipé d’un système d’acquisition (caméra

AxiocamMR) couplé au logiciel de traitement d’images Axiovision. Une lampe UV et un bloc

filtre permettent la détection des fluorochromes. Le filtre FITC permet de visualiser l’YFP qui

a un pic d’excitation à 514 nm et un pic d’émission à 527 nm.

5. Expérimentations sur petit épeautre (Triticum monococcum)

5.1. Génotype utilisé

Le blé est une plante d’intérêt agronomique mais son étude dans la cadre de la recherche

fondamentale n’est pas chose aisée pour plusieurs raisons : son cycle de développement est long

(environ 6 mois) et la complexité de son génome (constitué de 3 sous-génomes) oblige, lors de

l’étude d’un gène, à devoir prendre en compte ses 3 homéologues qui peuvent présenter de

légères différences de séquences et d’expression et rendre les résultats difficiles à analyser. Du

fait de ces particularités, nous avons donc choisi de réaliser la transgénèse non pas sur des plants

de blé tendre mais de petit épeautre ou Triticum monococcum, aussi appelé engrain. Il possède

un génome diploïde AA, très similaire au sous-génome AA du blé. De plus, son cycle de

développement est plus court (environ 4-5 mois). Nous avons travaillé avec le génotype

TM35821, qui est une variété ancienne de petit épeautre de printemps fournie par le CRA-SCV.

Il a été sélectionné parmi une vingtaine de variétés anciennes et de lignées pour usage

scientifique au sein de l’équipe BIANCA, parce qu’il était facile à battre et qu’il montrait les

meilleurs taux de régénération et de transformation après transgénèse.

Afin de pouvoir transférer notre étude du blé tendre au petit épeautre, le développement et la

réponse au stress thermique de cette espèce ainsi que le profil d’expression de ses NAC

homologues ont été observés. Les NAC étudiés chez le petit épeautre Triticum monococcum

sont noté les TmNAC.

5.2. Cinétique de développement du grain

Une première culture de petit épeautre a permis de multiplier le lot de grains fourni par l’INRA

de Crouël et de réaliser une cinétique du développement du grain de petit épeautre (Figure 30)

Figure 31 : Photo d’un épi de petit épeautre et numérotation des 5 premiers épillets sur l’épi.

Les jeunes fleurs sont d’un jaune vif tandis que les fleurs sorties quelques jours plus tôt sont

blanchies. Le jour de l’anthèse, le numéro des épillets fleuris correspondant à leur position sur

l’épi, est relevé. Pour cela, le comptage s’effectue à partir de l’épillet basal et continue en

montant en zigzag le long du rachis. Ici, l’exemple est donné pour les 5 premiers épillets.

Tableau 7 : Liste des 40 stades pour lesquels un épi a été prélevé, décortiqué, le nombre

d’épillets compté et dont les grains ont été pesés et photographiés. Les temps en jours après

anthèse (JAA) et en degré-jour après anthèse (°Cj) sont linéaires puisque les températures

étaient contrôlées et uniformes tout au long de la culture.

JAA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

°Cj 21 42 63 84 105 126 147 168 189 210

JAA 11 12 13 14 15 16 17 19 20 21

°Cj 231 252 273 294 315 336 357 399 420 441

JAA 22 23 24 25 26 27 28 29 30 34

°Cj 462 483 504 525 546 567 588 609 630 714

JAA 36 38 40 42 44 48 50 54 58 61

°Cj 756 798 840 882 924 1008 1050 1134 1218 1281

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qui a ensuite été mis en parallèle avec la cinétique du grain de blé réalisée au sein du laboratoire

et publiée par Capron et al. (2012).

5.2.1. Dispositif expérimental

La culture s’est déroulée dans une serre de confinement S2, sur le campus des Cézeaux

(Clermont-Ferrand, France). Le 17 novembre 2015, 50 grains ont été semés dans un terreau

spécial semis et placés en serre à 16 h de jour à 22°C et 30 000 lux, 8h de nuit à 19°C et une

hygrométrie constante de 55%. Le pourcentage de germination a été de 86%. Les plantes au

stade 3 feuilles ont été placées en armoire de vernalisation à 4°C pendant un mois puis

rempotées en pots individuels de 3 litres et replacées dans des conditions de culture identiques

à celles précédant leur vernalisation.

5.2.2. Notation de l’anthèse

Au sein de chaque plante, le développement des épis n’est pas équivalent. Nous n’avons

effectué un suivi que pour le 1

^er

et le 2

^ème

épis fleuris par plante, nommés respectivement Maître

Brin (MB) et Talle 1 (T1), et étiquetés afin d’être aisément identifiables.

De même que pour le blé, il n’est pas possible de déterminer le moment exact de la fécondation

de la fleur de petit épeautre par le pollen mais cette espèce étant autogame (c’est-à-dire qu’elle

s’autoféconde, comme le blé), il est admis que le moment de l’anthèse coïncide avec celui de

la fécondation. La date d’anthèse est donc l’élément central de la détermination du stade de

développement du grain, et la surveillance de l’anthèse a été effectuée chaque matin. L’anthèse

des épillets au sein de l’épi s’étale sur environ 2-3 jours, le jour de la sortie de la première fleur

est noté comme le jour de l’anthèse de l’épi entier. Le jour de l’anthèse, la fleur d’une couleur

jaune vif devient apparente et pend de l’épillet. Elle blanchit dans les jours suivants, pour

ensuite sécher et tomber (Figure 31). L’épi est alors étiqueté MB ou T1, le numéro de la plante

et la date, ainsi que le nombre total d’épillets de l’épi et le numéro des épillets fleuris au sein

de l’épi sont notés. Le numéro de chaque épillet est compté comme suit : l’épillet basal est le

n° 1, puis les suivants sont comptés en montant en alternance de part et d’autre de la tige (Figure

31).

Tableau 8 : Nombre d’épis MB et T1 de petit épeautre, récoltés aux 8 stades de prélèvement

(en temps thermique °Cj, et en jours après anthèse JAA) en condition contrôle et contrainte

thermique modérée. Du fait de la petite taille des grains, les stades les plus précoces ont

nécessité le prélèvement d’un nombre d’épis plus important pour avoir suffisamment de

matériel biologique.

Stade de récolte

(°Cj)

Stade de récolte

(JAA)

Condition -

Répétition ^{Nombre d’épis récoltés}

0 0 Contrôle - 1 13

0 0 Contrôle - 2 13

0 0 Contrôle - 3 16

0 0 Contrôle - 4 9

40 2 Contrôle - 1 12

40 2 Contrôle - 2 12

40 1 Stressthermique - 1 12

40 1 Stressthermique - 2 12

80 4 Contrôle - 1 6

80 4 Contrôle - 2 6

80 3 Stressthermique - 1 6

80 3 Stressthermique - 2 6

120 6 Contrôle - 1 6

120 6 Contrôle - 2 6

120 4 Stressthermique - 1 6

120 4 Stressthermique - 2 7

180 9 Contrôle - 1 6

180 9 Contrôle - 2 6

180 7 Stressthermique - 1 6

180 7 Stressthermique - 2 6

220 12 Contrôle - 1 6

220 12 Contrôle - 2 6

220 8 Stressthermique - 1 6

220 8 Stressthermique - 2 6

300 16 Contrôle - 1 6

300 16 Contrôle - 2 6

300 12 Stressthermique - 1 6

300 12 Stressthermique - 2 6

700 37 Contrôle - 1 6

700 37 Contrôle - 2 6

700 33 Stressthermique - 1 6

700 33 Stressthermique - 2 6

TOTAL 244

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Chez le blé, les épillets fleurissent en premier dans la partie centrale de l’épi. Chez le petit

épeautre, le départ de floraison semble plutôt se faire dans la partie basale. De plus, chez le blé,

qui a été particulièrement sélectionné par l’Homme au cours de son évolution, la date d’anthèse

est synchronisée entre plants ; mais les plants de petit épeautre possèdent une anthèse beaucoup

plus étalée dans le temps. Pour les 50 plantes de cette culture, les anthèses ont débuté le 2 mars

2016, soit 106 jours après le semis, et se sont étalées sur 19 jours.

5.2.3. Récolte et analyse des grains

Pour chacun des 40 stades de développement étudiés (présentés dans le Tableau 7), un épi MB

ou T1 a été récolté et placé sur glace dans un sachet saturé en humidité. Les plantes ayant eu un

épi prélevé n’ont pas été prélevées une deuxième fois afin d’éviter un biais de mesure par

modification de l’équilibre source/puits. Les épis ont été pesés, le nombre d’épillet total et le

nombre d’épillets fertiles (pour les stades tardifs, après 17 JAA = 357°Cj) ont été comptés. Les

5 épillets les plus basaux parmi ceux fleuris le jour de l’anthèse de l’épi ont été décortiqués, le

nombre de grains par épillet a été noté ainsi que le poids frais des grains. Les 2 grains les plus

représentatifs ont ensuite été photographiés par Dominique Marcon, l’un avec le sillon visible

l’autre non, puis placé 48h dans une étuve à 60°C afin de déterminer leur masse sèche. Les

grains destinés à la multiplication du lot de grains ont été récoltés à maturité.

5.3. Application d’un stress thermique modéré durant les stades précoces de

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